CN111707721A - 一种17β-雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种17β-雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物传感检测技术领域，涉及一种17β‑雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法及应用。具体为一种基于氮掺杂碳点(NCDs)作为羧基化三联吡啶钌(Ru(dcbpy)3 2+)共反应剂的新型电化学发光(ECL)适配体传感器用于17β‑雌二醇(E2)的特异性检测。本发明中，由于NCDs对Ru(dcbpy)3 2+的优异催化作用和信号放大效应，NCDs可以作为Ru(dcbpy)3 2+有效的共反应剂，大大提高体系的发光效率，进而增强发光信号。为了提高Ru(dcbpy)3 2+‑NCDs体系对E2检测的选择性，我们创新性地引入了E2适配体以构建新型ECL适配体传感器。构筑的ECL适配体传感器对E2的线性响应范围为1.0×10‑14～1.0×10‑ 6mol/L，检出限为1.0×10‑15mol/L。本发明的电化学发光适配体传感器选择性好、灵敏度高，为测定实际样品中的E2提供了一种新型适配体传感平台。

Description

一种17β-雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物传感检测技术领域，涉及一种17β-雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法及应用，具体涉及一种基于Ru(dcbpy)3 2+-NCDs体系的17β-雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法及应用。
背景技术
17β-雌二醇(E2)，作为最强的内分泌干扰化学物质(EDCs)之一，对提高奶牛产奶量、提高瘦肉率、促进动物和人类的生长具有积极意义。然而，由于在促进牲畜生长和人类药物治疗方面的药物滥用，大量的E2被释放到环境中。过量的E2会影响生物体的生殖、内分泌、神经、免疫系统，甚至会导致异发育不良、男性不育、卵巢癌和乳腺癌，对人类造成不可逆转的危害。因此，开发了液相色谱-质谱(LC-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)和免疫吸附试验等E2分析方法。其中，基于色谱的方法是可靠、准确的，但取决于昂贵的仪器和专业的操作。此外，免疫吸附方法，主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、表面等离子体共振(SPR)传感器和比色免疫传感器，在实际样品中提供了快速的检测过程，但是该类方法需要引入昂贵的抗体。因此，发展一种新型有效的传感策略对E2进行分析具有实际的指导意义。
电化学发光(ECL)适配体传感技术作为一种新兴的检测技术，由于操作简单、灵敏度好、成本低、易于控制、选择性好等优点，被开发用于EDCs的分析。在典型的ECL体系中，三联吡啶钌(Ru(bpy)3 2+)由于其良好的可逆性、较高的发光效率被广泛用作发光体试剂。其中，三丙胺(TPA)作为阳极Ru(bpy)3 2+最传统的共反应剂，具有良好的信号增强效果。然而，由于TPA的毒性和挥发性，仍然需要开发新型共反应剂。近年来，碳点(CDs)及其复合材料是一种新型的纳米材料共反应剂，其ECL增强机理已得到初步研究。研究发现，CDs表面的苄基醇结构、氮掺杂碳点(NCNDs)和氮化硼量子点(BNQDs)表面的氨基可以作为Ru(bpy)3 2+的辅助反应位点提高ECL信号强度。在我们的前期工作中，开发的新型纳米复合材料，如氮掺杂CDs(NCDs)，氮掺杂石墨烯纳米点(NGDs)和聚乙烯亚胺(PEI)功能化NCDs(NCDs@PEI)，被用作Ru(bpy)3 2+的有效共反应剂，并基于其优势分别制备了不同环境污染物的ECL传感平台。
然而，目前还没有构建用于E2检测的基于CDs的ECL适配体传感平台。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明在结合羧基化三联吡啶钌和碳点优点的工作基础上，引入E2适配体，构建新型电化学发光适配体传感器，用于实际样品中E2的快速、灵敏检测分析。
本发明旨在耦合电化学发光法和适配体传感技术，构筑一种基于Ru(dcbpy)3 2+-NCDs体系的E2适配体传感器。具体涉及基于Ru(dcbpy)3 2+-NCDs体系的E2电化学发光传感器的制备及应用。
一种17β-雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法，步骤如下：
(1)NCDs的制备
首先，将柠檬酸和尿素加入到二次水中。然后，将溶液置于微波炉中反应，冷却至室温后，得到的产物再次溶于二次水，10,000rpm条件下离心15min，得到的上层溶液用0.22μm滤膜过滤，并于60℃下真空干燥，得到固体产物NCDs。
(2)将玻碳电极(GCE)依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，在乙醇和水中超声后在空气中干燥；
(3)将发光体Ru(dcbpy)3 2+溶液修饰到步骤(2)制备的GCE表面，并在空气中干燥；产品标记为Ru(dcbpy)3 2+/GCE；
(4)然后将NCDs的溶液修饰到步骤(3)制备的电极表面，室温下晾干；此时，产品标记为NCDs/Ru(dcbpy)3 2+/GCE；
(5)在步骤(4)制备的电极上滴加全氟磺酸溶液，室温下晾干后形成膜；以防修饰材料脱落电极表面；
(6)将步骤(5)修饰好的电极浸泡在HAuCl4中，从-0.45V到-0.15V电位下进行电镀，时间控制在15s到35s内，在电极表面修饰上一层Au粒子(AuPs)，用于连接E2适配体；产品标记为AuPs/NCDs/Ru(dcbpy)3 2+/GCE；
(7)在一定温度下，将巯基功能化的E2适配体反应在步骤(6)修饰好的电极上，通过Au-S共价键固定在电极表面，形成自组装电极；此时，产品标记为Apt/AuPs/NCDs/Ru(dcbpy)3 2+/GCE。
(8)在一定温度下，将牛血清白蛋白(BSA)溶液中修饰在步骤(7)制备的自组装电极上，以阻断剩余的非特异性结合位点，制得基于Ru(dcbpy)3 2+-NCDs的电化学发光适配体传感器。此时，产品标记为BSA/Apt/AuPs/NCDs/Ru(dcbpy)3 2+/GCE。
步骤(1)中，柠檬酸、尿素和二次水中的用量比例为4.5g：4.5g：10mL，微波炉功率为800W，反应时间为5min。
步骤(2)中，玻碳电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm和0.05μm。
步骤(3)中，Ru(dcbpy)3 2+的浓度为0.2mM，用量为3μL。
步骤(4)中，NCDs的溶液的浓度为0.2mg/mL，用量为3μL。
步骤(5)中，全氟磺酸(Nafion)溶液的浓度为0.5wt％，用量为3μL。
步骤(6)中，HAuCl4的质量百分浓度为1％。
步骤(7)中，巯基功能化的E2适配体的浓度为0.04～0.16μmol/L，用量为6μL；反应温度为4℃，反应时间为3～10h。
步骤(8)中，牛血清白蛋白BSA溶液的质量百分浓度为1％；用量为6μL；孵育的温度为37℃，孵育的时间为10～60min。
将6μL不同浓度E2溶液修饰在上述制得的传感器中，室温下绑定时间为10～50min,E2的浓度依次为1×10-14,1×10-13,1×10-12,1×10-11,1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7和1×10-6mol L-1，此时制得的传感器作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由MPI-EII电化学发光分析仪记录和检测ECL信号。在0.1M PBS(pH＝7.5)缓冲溶液中进行测试。扫描电压范围0.2～1.25V，扫描速度0.1V/s,实验中光电倍增管的高压为700V。
同样的方法，测试未知浓度的E2溶液的ECL信号，代入标准曲线，得到未知溶液的浓度。
本发明的有益效果：
(1)用氮掺杂的碳点(NCDs)代替有毒、易挥发的三丙胺(TPA)作为Ru(dcbpy)3 2+的新型共反应剂可以提高ECL体系的稳定性，解决稳定性差的问题。
(2)引入特异性识别元件E2适配体，降低了E2干扰物质的影响，提高了Ru(dcbpy)3 2+-NCDs体系的选择性。
(3)本发明构建的ECL适配体传感器用于E2的检测，灵敏度高、选择性好、线性范围宽，为1.0×10-14～1.0×10-6mol/L。
附图说明
图1是基于Ru(dcbpy)3 2+-NCDs体系的E2电化学发光适配体传感器制备工艺过程图。
图2(A)为NCDs/Ru(dcbpy)3 2+/GCE的SEM图；(B)为AuPs/NCDs/Ru(dcbpy)3 2+/GCE的SEM图；
图3(A)无适配体时不同浓度E2对数所对应的ECL信号，E2浓度：从上到下的浓度依次为1×10-9,1×10-8,1×10-7和1×10-6mol/L；(B)无适配体的ECL传感器的信号响应与不同浓度E2对数与之间构建的线性关系。(C)存在适配体时不同浓度E2对数所对应的ECL信号，E2浓度：从上到下的浓度依次为1×10-14,1×10-13,1×10-12,1×10-11,1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7和1×10-6mol/L；(D)ECL适配体传感器的信号响应与不同浓度E2对数与之间构建的线性关系。
图4(A)适配体传感器的选择性能，图中干扰物质为双酚A，雌三醇，乙炔雌二醇，己烯雌酚以及其混合物；(B)适配体传感器平行6次测定的重现性能。
具体实施方式
下面结合具体实施例和说明书附图，进一步阐明本发明。
对比例1
(1)NCDs的制备
首先，将4.5g柠檬酸和4.5g尿素加入到10mL二次水中。然后，将溶液置于800W微波炉中反应5min，冷却至室温后，得到的产物再次溶于二次水，10,000rpm条件下离心15min，得到的上层溶液用0.22μm滤膜过滤，并于60℃下真空干燥，得到固体产物NCDs。
(2)将玻碳电极(GCE)依次用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末打磨，在乙醇和水中超声后在空气中干燥，所述玻碳电极的直径d＝3mm；
(3)将发光体3μL 0.2mM Ru(dcbpy)3 2+溶液修饰到步骤(2)制备的GCE表面，并在空气中干燥，产品标记为Ru(dcbpy)3 2+/GCE；
(4)然后将3μL 0.2mg/mL NCDs的溶液修饰到步骤(3)制备的电极表面，室温下晾干；此时，产品标记为NCDs/Ru(dcbpy)3 2+/GCE；
(5)在步骤(4)制备的电极上滴加3μL 0.5wt％全氟磺酸(Nafion)溶液，室温下晾干后形成膜，以防修饰材料脱落电极表面；
(6)将步骤(5)修饰好的电极浸泡在HAuCl4中，从-0.45V到-0.15V电位下进行电镀，时间控制在15s到35s内，在电极表面修饰上一层Au粒子(AuPs)，用于连接E2适配体；此时，产品标记为AuPs/NCDs/Ru(dcbpy)3 2+/GCE；
所述HAuCl4的质量百分浓度为1％。
(7)6μL 1％牛血清白蛋白(BSA)溶液中在步骤(6)制备的自组装电极上37℃下孵育10～60min以阻断剩余的非特异结合位点，制得基于Ru(dcbpy)3 2+-NCDs的电化学发光适配体传感器。此时，产品标记为BSA/Apt/AuPs/NCDs/Ru(dcbpy)3 2+/GCE。
将6μL不同浓度E2溶液修饰在上述制得的传感器中，室温下绑定时间为10～50min,E2的浓度依次为1×10-14,1×10-13,1×10-12,1×10-11,1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7和1×10-6mol/L，此时制得的传感器作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由MPI-EII电化学发光分析仪记录和检测ECL信号。在0.1M PBS(pH＝7.5)缓冲溶液中进行测试。扫描电压范围0.2～1.25V，扫描速度0.1V/s,实验中光电倍增管的高压为700V。
图2(A)中，可以看出，NCDs/Ru(dcbpy)3 2+/GCE表面是一个干净的界面，(B)中可以看出，在图2(A)基础上电沉积金粒子(AuPs)为雪花状，其平均粒径为1.93μm。
从图3(A)中，可以看出，随着E2浓度的增加(从上到下的浓度依次为1×10-9,1×10-8,1×10-7和1×10-6mol/L)，ECL信号逐渐降低，这应归因于E2与Ru(dcbpy)3 2+之间的能量转移。从图3(B)中，可以看出，无适配体传感器的ECL信号(IECL)与E2浓度的对数值(logCE2)绘制的标准曲线为IECL＝-3660.6-933.2logCE2(R2＝0.9921),线性范围为1.0×10-9-1.0×10-6mol/L，检测限为1.0×10-9mol/L。
实施例1
按照图1所述的制备工艺：
(1)NCDs的制备
首先，将4.5g柠檬酸和4.5g尿素加入到10mL二次水中。然后，将溶液置于800W微波炉中反应5min，冷却至室温后，得到的产物再次溶于二次水，10,000rpm条件下离心15min，得到的上层溶液用0.22μm滤膜过滤，并于60℃下真空干燥，得到固体产物NCDs。
(2)将玻碳电极(GCE)依次用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末打磨，在乙醇和水中超声后在空气中干燥，所述玻碳电极的直径d＝3mm；
(3)将发光体3μL 0.2mmoL·L-1Ru(dcbpy)3 2+溶液修饰到步骤(2)制备的GCE表面，并在空气中干燥，产品标记为Ru(dcbpy)3 2+/GCE；
(4)然后将3μL 0.2mg·mL-1NCDs的溶液修饰到步骤(3)制备的电极表面，室温下晾干；此时，产品标记为NCDs/Ru(dcbpy)3 2+/GCE；
(5)在步骤(4)制备的电极上滴加3μL 0.5wt％全氟磺酸(Nafion)溶液，室温下晾干后形成膜，以防修饰材料脱落电极表面；
(6)将步骤(5)修饰好的电极浸泡在HAuCl4中，从-0.45V到-0.15V电位下进行电镀，时间控制在15s到35s内，在电极表面修饰上一层Au粒子(AuPs)，用于连接E2适配体；此时，产品标记为AuPs/NCDs/Ru(dcbpy)3 2+/GCE；
所述HAuCl4的质量百分浓度为1％。
(7)6μL 0.04μmoL/L到0.16μmoL/L巯基功能化的E2适配体(Apt)在步骤(6)修饰好的电极上4℃下作用3～10h,通过Au-S共价键固定在电极表面，形成自组装电极；。此时，产品标记为Apt/AuPs/NCDs/Ru(dcbpy)3 2+/GCE。
(8)6μL 1％牛血清白蛋白(BSA)溶液中在步骤(7)制备的自组装电极上37℃下孵育10～60min以阻断剩余的非特异结合位点，制得基于Ru(dcbpy)3 2+-NCDs的电化学发光适配体传感器。此时，产品标记为BSA/Apt/AuPs/NCDs/Ru(dcbpy)3 2+/GCE。
将6μL不同浓度E2溶液修饰在上述制得的传感器中，室温下绑定时间为10～50min,E2的浓度依次为1×10-14,1×10-13,1×10-12,1×10-11,1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7和1×10-6mol/L，此时制得的传感器作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由MPI-EII电化学发光分析仪记录和检测ECL信号。在0.1M PBS(pH＝7.5)缓冲溶液中进行测试。扫描电压范围0.2～1.25V，扫描速度0.1V/s,实验中光电倍增管的高压为700V。
同样的方法，测试未知浓度的E2溶液的ECL信号为1448 a.u.，代入标准曲线，得到未知溶液的浓度9.44×10-12mol·L-1。
从图3(C)中，可以看出，随着E2浓度的增加(从上到下的浓度依次为1×10-14,1×10-13,1×10-12,1×10-11,1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7和1×10-6mol/L)，ECL信号逐渐降低，这应归因于BPA与其适配体的特异性结合。从图3(D)中，可以看出，适配体传感器的ECL信号(IECL)与E2浓度的对数值(logCE2)绘制的标准曲线为IECL＝-49.92-126.81logCE2(R2＝0.9985),线性范围为1.0×10-14-1.0×10-6mol/L，检测限为1.0×10-15mol/L。
从图4(A)中，可以看出，E2的干扰物质(双酚A，雌三醇，乙炔雌二醇，己烯雌酚以及其混合物)引起的ECL改变值可以忽略不计，证明该传感器具有优异的选择性能。
从图4(B)中，可以看出，6个平行E2适配体传感器的在进行ECL测试后，相对标准差(RSD)为1.7％，证明该传感器具有良好的重现性能。

Claims (10)

1.一种17β-雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)制备NCDs，备用；
(2)将玻碳电极GCE依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，在乙醇和水中超声后在空气中干燥；
(3)将发光体Ru(dcbpy)3 2+溶液修饰到步骤(2)制备的GCE表面，并在空气中干燥；
(4)然后将NCDs的溶液修饰到步骤(3)制备的电极表面，室温下晾干；
(5)在步骤(4)制备的电极上滴加全氟磺酸溶液，室温下晾干后形成膜；
(6)将步骤(5)修饰好的电极浸泡在HAuCl4中，从-0.45V到-0.15V电位下进行电镀，时间控制在15s到35s内，在电极表面修饰上一层Au粒子(AuPs)，用于连接E2适配体；
(7)在一定温度下，将巯基功能化的E2适配体反应在步骤(6)修饰好的电极上，通过Au-S共价键固定在电极表面，形成自组装电极；
(8)在一定温度下，将牛血清白蛋白BSA溶液中修饰在步骤(7)制备的自组装电极上，以阻断剩余的非特异性结合位点，制得基于Ru(dcbpy)3 2+-NCDs的电化学发光适配体传感器。
2.根据权利要求1所述的17β-雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，NCDs的制备步骤为：
首先，将柠檬酸和尿素加入到二次水中，然后，将溶液置于微波炉中反应，冷却至室温后，得到的产物再次溶于二次水，10,000rpm条件下离心15min，得到的上层溶液用0.22μm滤膜过滤，并于60℃下真空干燥，得到固体产物NCDs；
步骤(1)中，柠檬酸、尿素和二次水中的用量比例为4.5g：4.5g：10mL，微波炉功率为800W，反应时间为5min。
3.根据权利要求1所述的17β-雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，玻碳电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm和0.05μm。
4.根据权利要求1所述的17β-雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，Ru(dcbpy)3 2+的浓度为0.2mM，用量为3μL。
5.根据权利要求1所述的17β-雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，NCDs的溶液的浓度为0.2mg/mL，用量为3μL。
6.根据权利要求1所述的17β-雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，全氟磺酸(Nafion)溶液的浓度为0.5wt％，用量为3μL。
7.根据权利要求1所述的17β-雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，HAuCl4的质量百分浓度为1％。
8.根据权利要求1所述的17β-雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，巯基功能化的E2适配体的浓度为0.04～0.16μmol/L，用量为6μL；反应温度为4℃，反应时间为3～10h。
9.根据权利要求1所述的17β-雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(8)中，牛血清白蛋白BSA溶液的质量百分浓度为1％；用量为6μL；孵育的温度为37℃，孵育的时间为10～60min。
10.将权利要求1～9任一项所述制备方法制得的17β-雌二醇电化学发光适配体传感器用于检测17β-雌二醇的用途。
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