CN113588745A - 一种灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法 - Google Patents

一种灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物传感检测领域，涉及一种灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法。本发明基于GO、CQDs和NCQDs等不同碳基纳米材料对羧基化三联吡啶钌(Ru(dcbpy)3 2+)/三丙胺体系不同的猝灭性能，开发了一种灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法，因为引入特异性识别元件Pb2+的适配体，提高了双放大电化学发光适配体传感方法的选择性，降低了与Pb2+同时存在的其它离子的干扰，实现对Pb2+的特异性分析；该方法灵敏度高，且选择性好。

Description

一种灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法
技术领域
本发明涉及一种灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法，该方法具有灵敏度高、选择性好的特点，属于生物传感检测领域。
背景技术
土壤中的重金属离子污染已成为全球范围内令人担忧的问题。其中，Pb2+由于其不可降解和毒性高的特性，不仅会抑制植物生长、扰乱植物的正常代谢，还会严重影响作物产量和籽粒品质，最终危害人类健康。特别是Pb2+可引起不可逆的神经损伤和行为障碍，严重威胁儿童健康。因此，对土壤中Pb2+的检测和定量具有重要意义。目前，一些Pb2+检测分析方法，主要包括原子吸收光谱法、火焰原子吸收光谱法、毛细管电泳-电感耦合等离子体-质谱法和电感耦合等离子体-发射光谱法，具有精度高和选择性好等优点，但是需要精密的仪器和专业的操作人员。电化学法、荧光法、光电化学法和电化学发光法(ECL)等方法因其较高灵敏度和简单操作的优点，对Pb2+分析具有较好的传感价值。
其中，ECL适配体传感器因其灵敏度高、响应时间短、动态范围宽和选择性好等优点，被广泛应用于Pb2+的检测。在众多的发光体/共反应剂体系中，三(2,2′-联吡啶)二氯钌(II)基试剂(Ru(II))/三丙胺体系因其高的发光效率表现出强的背景信号。基于此，为了进一步提高灵敏度，发展了一些键连互补DNA(cDNA)的猝灭剂来最小化背景信号，使得在目标物存在时产生最大的恢复信号。目前，常用的猝灭剂如酚类、二茂铁和Cy5等有毒、水溶性较差。多壁碳纳米管和氧化石墨烯因其表面含氧官能团和其本征性质也表现出优异的猝灭性能。因此，开发一种ECL适配体传感器实现对Pb2+的灵敏、高选择性监测成为一项重要课题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明基于氧化石墨烯(GO)、碳量子点(CQDs)和氮掺杂CQDs(NCQDs)等不同碳基纳米材料对羧基化三联吡啶钌(Ru(dcbpy)3 2+)/三丙胺体系不同的猝灭性能，开发了一种灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法，该方法灵敏度高，且选择性好。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法，包括如下步骤：
(1)cDNA-碳基纳米材料的制备；
将1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和N,N-二甲基甲酰胺混合得到混合溶液A，然后加入到碳基纳米材料溶液中进行第一次搅拌以活化碳基纳米材料表面的羧基；再加入氨基功能化cDNA溶液，进行第二次搅拌后制备得到cDNA-碳基纳米材料溶液；
(2)将玻碳电极(GCE)用三氧化二铝粉末打磨，然后依次在乙醇和水中超声，最后在空气中干燥得到预处理后的电极；
(3)将步骤(2)预处理后的电极浸泡在HAuCl4溶液中电沉积金粒子(AuPs)，处理后的电极备用；
(4)在步骤(3)制备的电极上修饰Pb2+适配体(Apt)溶液，在一定温度条件下继续反应一段时间，得到的电极备用；
(5)在步骤(4)制备的电极上滴加巯基己醇(MCH)溶液，以封闭非特异性结合位点，室温条件下进行孵育，孵育后的电极备用；
(6)在步骤(5)制备的电极上滴加步骤(1)制备的cDNA-碳基纳米材料溶液；在一定温度条件下继续反应一段时间，此时，得到传感器标记为cDNA-碳基纳米材料/MCH/Apt/AuPs/GCE；
(7)将步骤(6)得到的传感器置于不同浓度Pb2+标准溶液中绑定一定的时间，一个浓度的Pb2+标准溶液对应一个传感器，浓度和传感器呈一一对应关系；绑定后的传感器经超纯水冲洗后在室温下自然晾干；此时制得的电极材料记为Pb2+/cDNA-碳基纳米材料/MCH/Apt/AuPs/GCE-1，以其作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极；所述的三电极体系在含有Ru(dcbpy)3 2+和三丙胺的缓冲溶液中进行测试；由MPI-EII电化学发光分析仪记录和检测电化学发光信号(ECL信号)；建立Pb2+溶液浓度和电化学发光信号的对应关系的标准线性曲线；
(8)待测样品中Pb2+浓度的检测：
将步骤(6)得到的电极置于Pb2的待测溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干，记为Pb2+/cDNA-碳基纳米材料/MCH/Apt/AuPs/GCE-2；此时制得的电极Pb2+/cDNA-碳基纳米材料/MCH/Apt/AuPs/GCE-2作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极；将所述的三电极体系在含有Ru(dcbpy)3 2+和三丙胺的缓冲溶液中进行测试，检测电化学发光信号；代入步骤(7)建立的标准线性曲线中，得到待测溶液中Pb2+的浓度，实现对Pb2+的高灵敏检测。
进一步地，步骤(1)中，碳基纳米材料包括氧化石墨烯(GO)、碳量子点(CQDs)和氮掺杂CQDs(NCQDs)；其中GO是直接购买，所述CQDs是以柠檬酸为反应前体微波反应合成；所述NCQDs是以柠檬酸和尿素为反应前体微波反应合成；
所述1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:1；所述1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸的浓度为10mM，N,N-二甲基甲酰胺的浓度为5mM；
所述混合溶液A、碳基纳米材料溶液和氨基功能化cDNA溶液的体积比为1:2：2(800μL：1600μL：1600μL)；所述cDNA溶液的浓度为1μM；
所述第一次搅拌的时间为15min；所述第二次搅拌的时间为2h。
进一步地，步骤(2)中，所述GCE的直径为3mm；三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm和0.05μm。
进一步地，步骤(3)中，所述HAuCl4的质量百分浓度为1％；电沉积的电位为-0.25V，电沉积的时间为20s。
进一步地，步骤(4)中，所述Pb2+适配体溶液的浓度为0.2μM，在电极上修饰的用量为6μL；所述一定温度为4℃，反应时间为12h。
进一步地，步骤(5)中，所述MCH溶液的浓度为1mM；在电极上滴加的用量为6μL；所述孵育的时间为1h。
进一步地，步骤(6)中，所述cDNA-碳基纳米材料溶液浓度为0.4～2.8mg mL-1；用量为6μL；所述一定温度条件为37℃，反应时间为2h。
进一步地，步骤(7)中，所述Pb2+溶液的浓度为100aM～100nM；所述绑定一定的时间为40min；所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，浓度为0.1M，pH值为7.5；缓冲溶液中Ru(dcbpy)3 2+的浓度为0.16mM；缓冲溶液中三丙胺的浓度为10μM；所述测试时所采用的参数为：电压为0.2V～1.25V，扫描速率为0.1V/s，光电倍增管高压为700V。
进一步地，步骤(8)中，所述Pb2+溶液绑定时间为40min；所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，浓度为0.1M，pH值为7.5；缓冲溶液中Ru(dcbpy)3 2+的浓度为0.16mM，三丙胺的浓度为10μM；所述测试时所采用的参数为：电压为0.2V～1.25V，扫描速率为0.1V/s，光电倍增管高压为700V。
该灵敏度可控型双放大电化学发光传感器的工作原理：
经研究发现，部分碳基纳米材料可以猝灭Ru(dcbpy)3 2+/三丙胺体系的ECL信号。基于此，将碳基纳米材料与Pb2+的cDNA结合，记为cDNA-碳基纳米材料，并利用适配体和cDNA之间的杂交作用将cDNA-碳基纳米材料固定于电极表面以最小化ECL信号。利用不同cDNA-碳基纳米材料可以以不同程度降低电化学发光信号的性质，当Pb2+和其适配体的特异性绑定引发cDNA-碳基纳米材料的释放和Pb2+-G-四链体的形成时，可以得到不同放大程度的电化学发光信号，从而实现电化学发光传感方法的灵敏度可控。
本发明的有益效果：
(1)本发明将不同cDNA-碳基纳米材料通过与Pb2+适配体的碱基互补配对原则修饰在电极表面，作为发光体羧基化吡啶钌(Ru(dcbpy)3 2+)和共反应剂(TPA)溶液体系的猝灭探针。在不存在Pb2+的情况下，不同cDNA-碳基纳米材料以不同程度降低电化学发光信号，作为双放大电化学发光传感方法灵敏度可控的前提。
(2)本发明利用Pb2+和其适配体的特异性绑定引发cDNA-碳基纳米材料从电极界面释放和Pb2+-G-四链体在电极界面形成，以得到不同放大程度的电化学发光信号，实现电化学发光传感方法的灵敏度可控。
(3)本发明中cDNA-碳基纳米材料从电极界面的释放和Pb2+-G-四链体在电极界面的形成这两方面均可以放大电化学发光信号，提高了双放大电化学发光传感方法的灵敏度。
(4)本发明基于电极表面的cDNA-碳基纳米材料与溶液中的Ru(dcbpy)3 2+之间的分子间氢键，提高了双放大电化学发光传感方法的稳定性。
(5)本发明引入特异性识别元件Pb2+的适配体，提高了双放大电化学发光适配体传感方法的选择性，降低了与Pb2+同时存在的其它离子的干扰，实现对Pb2+的特异性分析。
(6)本发明构建的双放大电化学发光适配体传感方法用于Pb2+的检测，灵敏度高、选择性好、稳定性好，线性范围宽。
(7)本发明构建的双放大电化学发光适配体传感方法用于土壤样品中Pb2+的检测，得到了满意的回收率，同时该结果与标准方法的结果基本一致，表明了电化学发光适配体传感方法的可靠性。
附图说明
图1中(A)为灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法的制备工艺过程图；(B)为Pb2+的检测机制图。
图2中(A)为ECL适配体传感器a：GO诱导的不同浓度Pb2+对数所对应的ECL信号，Pb2 +浓度：从左到右的浓度依次为100aM,1fΜ,10fΜ,100fΜ,1pΜ,10pΜ,100pΜ,1nΜ,10nM和100nM，和(B)相应的工作曲线；
(C)为ECL适配体传感器b：CQDs诱导的不同浓度Pb2+对数所对应的ECL信号，Pb2+浓度：从左到右的浓度依次为100aM,1fΜ,10fΜ,100fΜ,1pΜ,10pΜ,100pΜ,1nΜ,10nM和100nM，和(D)相应的工作曲线；
(E)为ECL适配体传感器c：NCQDs诱导的不同浓度Pb2+对数所对应的ECL信号，Pb2+浓度：从左到右的浓度依次为100aM,1fΜ,10fΜ,100fΜ,1pΜ,10pΜ,100pΜ,1nΜ,10nM和100nM，和(F)相应的工作曲线。
图3中(A)为ECL适配体传感器a,b和c的工作曲线；(B)ECL适配体传感器a,b和c与灵敏度之间的依赖关系。
图4以ECL适配体传感器c为例，考察该传感器的选择性能：图中干扰物质为K+,Na+,Ca2+,Fe2+,Cd2+,Cu2+,Fe3+,Hg2+,Zn2+,Mg2+,Mn2+,Ni2+和以上离子的混合物；
图5为ECL适配体传感器c的批次内和批次间的重现性能图。
图6为ECL适配体传感器c的稳定性能图。
图7为农田土壤和化工厂附近土壤的处理过程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和说明书附图，进一步阐明本发明。在本发明中，我们发现部分碳基纳米材料可以猝灭Ru(dcbpy)3 2+/三丙胺体系的ECL信号。基于此，将碳基纳米材料与Pb2+的cDNA结合，记为cDNA-碳基纳米材料，并利用适配体和cDNA之间的杂交作用将cDNA-碳基纳米材料固定于电极表面以最小化ECL信号。当Pb2+存在时，它和适配体的特异性绑定会引发G-四链体在电极表面的形成，并伴随着cDNA-碳基纳米材料的脱落，这两方面使得体系ECL信号显著放大。
在本发明中，GO购买于南京先丰纳米材料科技有限公司，cDNA和适配体购买于在生工生物工程(上海)股份有限公司购买。
实施例1：
按照图1所述的制备工艺：
(1)cDNA-GO的制备
将800μL含有10mM 1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和5mM N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液加入1600μL 1～7mg mL-1的GO中，进一步搅拌15min。然后加入1600μL 1μM氨基功能化cDNA，搅拌2h后制备cDNA-GO复合材料。
(2)将GCE依次用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末打磨，在乙醇和水中超声后在空气中干燥，所述GCE的直径d＝3mm；
(3)将步骤(2)的电极浸泡在HAuCl4中，在-0.25V电位下进行电镀20s，在电极表面形成一层AuPs；
(4)将6μL 0.2μM Pb2+的Apt溶液修饰到步骤(3)制备的电极表面，4℃下作用12h；
(5)在步骤(4)制备的电极上滴加6μL 1mM MCH溶液，室温下作用1h以封闭非特异性结合位点；
(6)在步骤(5)制备的电极上滴加6μL cDNA-GO，37℃下作用2h；此时，产品标记为cDNA-GO/MCH/Apt/AuPs/GCE；即为ECL适配体传感器a；
(7)将步骤(6)置于不同浓度Pb2+标准溶液中，Pb2+的浓度依次为100aM,1fΜ,10fΜ,100fΜ,1pΜ,10pΜ,100pΜ,1nΜ,10nM和100nM，超纯水冲洗后在室温下自然晾干；此时制得的电极Pb2+/cDNA-GO/MCH/Apt/AuPs/GCE-1作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极。所述的三电极体系在含有0.16mM Ru(dcbpy)3 2+和10μM三丙胺的缓冲溶液(0.1M PBS；pH＝7.5)中进行测试。由MPI-EII电化学发光分析仪记录和检测ECL信号。建立Pb2+溶液浓度和电化学发光信号的对应关系的标准线性曲线。
(8)待测样品中Pb2+浓度的检测：
将步骤(6)得到的电极置于Pb2的待测溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干，记为Pb2+/cDNA-GO/MCH/Apt/AuPs/GCE-2；此时制得的电极Pb2+/cDNA-GO/MCH/Apt/AuPs/GCE-2作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极；将所述的三电极体系在含有Ru(dcbpy)3 2+和三丙胺的缓冲溶液中进行测试，由MPI-EII电化学发光分析仪记录和检测ECL信号。代入步骤(7)建立的标准线性曲线中，得到待测溶液中Pb2+的浓度，实现对Pb2+的高灵敏检测。扫描电压范围0.2～1.25V，扫描速度0.1V/s,实验中光电倍增管的高压为700V。
从图2的(A)中，可以看出，GO诱导的ECL适配体传感器a的的ECL信号(IECL)随着Pb2+浓度的增加逐渐增强，这应归因于GO的本征性质及其表面的含氧官能团与Ru(dcbpy)3 2+之间的能量转移，和Pb2+-G-四链体结构在电极界面的形成两个方面；且(B)与Pb2+浓度的对数值(lgCPb 2+)绘制的标准曲线为IECL＝2677.6+428.1lgC Pb 2+(R2＝0.9959),线性范围为1fM～1nM，检测限为0.85fM。
实施例2：
(1)CQDs和cDNA-CQDs的制备
将4.5g柠檬酸加入到10mL二次水中。搅拌均匀后，将溶液置于800W微波炉中反应5min，待得到的产物冷却后，再次溶于二次水，在10,000rpm下离心15min，上清液用0.22μm滤膜过滤，并于60℃下真空干燥，得到产物CQDs。
然后，将800μL含有10mM 1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和5mM N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液加入1600μL 5mg mL-1的NCQDs中，进一步搅拌15min。然后加入1600μL1μM氨基功能化cDNA，搅拌2h后制备cDNA-CQDs复合材料。
(2)将GCE依次用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末打磨，在乙醇和水中超声后在空气中干燥，所述GCE的直径为3mm；
(3)将步骤(2)的电极浸泡在HAuCl4中，在-0.25V电位下进行电镀20s，在电极表面形成一层AuPs；
(4)将6μL 0.2μM Pb2+的Apt溶液修饰到步骤(3)制备的电极表面，4℃下作用12h；
(5)在步骤(4)制备的电极上滴加6μL 1mM MCH溶液，室温下作用1h以阻断非特异性结合位点；
(6)在步骤(5)制备的电极上滴加6μL cDNA-CQDs，37℃下作用2h；此时，产品标记为cDNA-CQDs/MCH/Apt/AuPs/GCE；即为ECL适配体传感器b；
(7)将步骤(6)置于不同浓度Pb2+标准溶液中，Pb2+的浓度依次为100aM,1fΜ,10fΜ,100fΜ,1pΜ,10pΜ,100pΜ,1nΜ,10nM和100nM，超纯水冲洗后在室温下自然晾干；此时制得的电极Pb2+/cDNA-CQDs/MCH/Apt/AuPs/GCE-1作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极。所述的三电极体系在含有0.16mM Ru(dcbpy)3 2+和10μM三丙胺的缓冲溶液(0.1M PBS；pH＝7.5)中进行测试。由MPI-EII电化学发光分析仪记录和检测ECL信号。建立Pb2+溶液浓度和电化学发光信号的对应关系的标准线性曲线。
(8)待测样品中Pb2+浓度的检测：
将步骤(6)得到的电极置于Pb2的待测溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干，记为Pb2+/cDNA-CQDs/MCH/Apt/AuPs/GCE-2；此时制得的电极Pb2+/cDNA-CQDs/MCH/Apt/AuPs/GCE-2作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极；将所述的三电极体系在含有0.16mM Ru(dcbpy)3 2+和10μM三丙胺的缓冲溶液中进行测试，由MPI-EII电化学发光分析仪记录和检测ECL信号。代入步骤(7)建立的标准线性曲线中，得到待测溶液中Pb2+的浓度，实现对Pb2+的高灵敏检测。扫描电压范围0.2～1.25V，扫描速度0.1V/s,实验中光电倍增管的高压为700V。
从图2(C)中，可以看出，CQDs诱导的ECL生物传感器b的的ECL信号(IECL)随着Pb2+浓度的增加逐渐增强，这应归因于富含羧基的Ru(dcbpy)3 2+与富含氧官能团的CQDs之间形成的分子间氢键涉及的能量转移和Pb2+-G-四链体结构在电极界面的形成两个方面；且(D)与Pb2+浓度的对数值(lgCPb 2+)绘制的标准曲线为IECL＝2549.5+302.5lgCPb 2+(R2＝0.9989),线性范围为1fM～10nM，检测限为0.99fM。
实施例3：
(1)NCQDs和cDNA-NCQDs的制备
将4.5g柠檬酸和4.5g尿素加入到10mL二次水中。搅拌均匀后，将溶液置于800W微波炉中反应5min，待得到的产物冷却后，再次溶于二次水，在10,000rpm下离心15min，上清液用0.22μm滤膜过滤，并于60℃下真空干燥，得到产物NCQDs。
然后，将800μL含有10mM 1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和5mM N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液加入1600μL 1～7mg mL-1的NCQDs中，进一步搅拌15min。然后加入1600μL 1μM氨基功能化cDNA，搅拌2h后制备cDNA-NCQDs复合材料。
(2)将GCE依次用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末打磨，在乙醇和水中超声后在空气中干燥，所述GCE的直径为3mm；
(3)将步骤(2)的电极浸泡在HAuCl4中，在-0.25V电位下进行电镀20s，在电极表面形成一层AuPs；
(4)将6μL 0.2μM Pb2+的Apt溶液修饰到步骤(3)制备的电极表面，4℃下作用12h；
(5)在步骤(4)制备的电极上滴加6μL 1mM MCH溶液，室温下作用1h以阻断非特异性结合位点；
(6)在步骤(5)制备的电极上滴加6μLcDNA-NCQDs，37℃下作用2h；此时，产品标记为cDNA-NCQDs/MCH/Apt/AuPs/GCE；即为ECL适配体传感器c；
(7)将步骤(6)置于不同浓度Pb2+标准溶液中，Pb2+的浓度依次为100aM,1fΜ,10fΜ,100fΜ,1pΜ,10pΜ,100pΜ,1nΜ,10nM和100nM，超纯水冲洗后在室温下自然晾干；此时制得的电极Pb2+/cDNA-NCQDs/MCH/Apt/AuPs/GCE-1作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极。所述的三电极体系在含有0.16mM Ru(dcbpy)3 2+和10μM三丙胺的缓冲溶液(0.1M PBS；pH＝7.5)中进行测试。由MPI-EII电化学发光分析仪记录和检测ECL信号。建立Pb2+溶液浓度和电化学发光信号的对应关系的标准线性曲线。
(8)待测样品中Pb2+浓度的检测：
将步骤(6)得到的电极置于Pb2的待测溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干，记为Pb2+/cDNA-NCQDs/MCH/Apt/AuPs/GCE-2；此时制得的电极Pb2+/cDNA-NCQDs/MCH/Apt/AuPs/GCE-2作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极。将所述的三电极体系在含有Ru(dcbpy)3 2+和三丙胺的缓冲溶液中进行测试，由MPI-EII电化学发光分析仪记录和检测ECL信号。代入步骤(7)建立的标准线性曲线中，得到待测溶液中Pb2+的浓度，实现对Pb2+的高灵敏检测。扫描电压范围0.2～1.25V，扫描速度0.1V/s,实验中光电倍增管的高压为700V。
从图2的(E)中，可以看出，CQDs诱导的ECL适配体传感器c的的ECL信号(IECL)随着Pb2+浓度的增加逐渐增强，这应归因于富含羧基的Ru(dcbpy)3 2+与富含氧、氮官能团的NCQDs之间形成的分子间氢键涉及的能量转移和Pb2+-G-四链体结构在电极界面的形成两个方面；且(F)与Pb2+浓度的对数值(lgCPb 2+)绘制的标准曲线为IECL＝2989.8+590.6lgCPb 2+(R2＝0.9992),线性范围为1fM～10nM，检测限为0.19fM。
从图3的(A)和(B)中，可以看出，与GO诱导的ECL适配体传感器a和CQDs诱导的ECL适配体传感器b相比，NCQDs诱导的ECL适配体传感器c具有最高的灵敏度、最宽的线性范围和最低的检出限。这是因为与GO相比，NCQDs具有更好的水溶性和更小的尺寸；与CQDs相比，NCQD上表面还有更多的氮元素，从而使得与Ru(dcbpy)3 2+与之间形成更多的分子间氢键，导致更优异的猝灭性能，从而产生最好的恢复性能。
图4为以ECL适配体传感器c为例，考察该传感器的选择性能：其中blank是指水溶液，定义为空白样；K+,Na+,Ca2+,Fe2+,Cd2+,Cu2+,Fe3+,Hg2+,Zn2+,Mg2+,Mn2+,Ni2+，Mix作为干扰物，Mix为上述12中干扰离子的混合溶液。
分别指当将ECL适配体传感器c置于水溶液中时，获得的ECL信号为空白信号；当以不同的离子(K+,Na+,Ca2+,Fe2+,Cd2+,Cu2+,Fe3+,Hg2+,Zn2+,Mg2+,Mn2+,Ni2+，Mix，Pb2+和Pb2++Mix)分别代替空白样时，所获得的ECL信号为测试信号；利用测试信号与空白信号的差值，记为ΔECL，考察其选择性能。
从图4中，可以看出，当选择ECL适配体传感器c为例时，Pb2+的干扰物质(K+,Na+,Ca2 +,Fe2+,Cd2+,Cu2+,Fe3+,Hg2+,Zn2+,Mg2+,Mn2+,和Mix)引起的ECL改变值可以忽略不计，Pb2+和包含Pb2+的所有混合离子引起的ECL改变值明显增加，证明该传感器具有优异的选择性能。
从图5中，可以看出，当选择ECL适配体传感器c为例时，批次内5个平行适配体传感器的ECL信号的相对标准差(RSD)为4.36％，批次间为4.37％，证明该传感器具有良好的重现性能。
从图6中，可以看出，利用发展的双放大电化学发光适配体传感方法连续扫描30圈的ECL信号的RSD为1.05％，表明其良好的稳定性。
实施例4：
以实施例3所制备的传感器以及检测方法，作为一个实际检测模型，对农田土壤和化工厂附近的农田土壤提取液进行检测。
(1)农田土壤和化工厂附近的农田土壤的采集和处理
农田土壤和化工厂附近的土壤均采集于江苏镇江，并按照行业标准(HJ 803-2016)进行处理。将得到的土样风干，细磨至200目尼龙筛。将0.1g土壤样品和6mL硝酸/盐酸盐(HCl/HNO3，v/v，3/1)的混合溶液逐渐加入锥形瓶中，在电加热板上进行热消解。消解后用0.22μm纤维素膜滤除杂质，用1M NaOH将提取液pH值调至7.0。最后，将溶液进一步稀释至所需浓度以备进一步使用。其中，农田土壤提取液标记为“1”，化工厂附件的土壤标记为“2”。
(2)取部分提取液进行加标配置，使得“1”和“2”土壤提取液中Pb2+的浓度分别为0，10pM，和100pM，总共获得6个待测样品。
(2)将实施例3步骤(6)得到的6个电极分别置于6个Pb2+的待测溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干，记为Pb2+/cDNA-碳基纳米材料/MCH/Apt/AuPs/GCE-2；此时制得的电极Pb2+/cDNA-碳基纳米材料/MCH/Apt/AuPs/GCE-2作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极。将所述的三电极体系在含有Ru(dcbpy)3 2+和三丙胺的缓冲溶液中进行测试，检测ECL信号，该操作重复3次，取其平均值；代入步骤(7)建立的标准线性曲线中，得到待测溶液中Pb2+的浓度。
(3)通过标准方法(电感耦合等离子体耦合光发射光谱，ICP-OES)，对发展的双放大电化学发光适配体传感方法的可靠性进行验证；并使用发展的电化学发光适配体传感方法(n＝3)和电感耦合等离子体耦合光发射光谱(ICP-OES)法测量土壤样品中Pb2+的浓度，结果如表1所示；
表1：土壤样品中Pb2+浓度的检测
Figure BDA0003176685520000101
从图7中，可以看出，加标农田土壤和化工厂附近土壤的回收率在95.5％～102％之间，RSD低于6.23％。通过ICP-OES方法获得的回收率介于95.5％和108％之间，表明所发展的双放大电化学发光适配体传感方法在实际应用中的可靠性。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (9)

1.一种灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法，其特征在于，步骤如下：
(1)cDNA-碳基纳米材料的制备；
将1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和N,N-二甲基甲酰胺混合得到混合溶液A，然后加入到碳基纳米材料溶液中进行第一次搅拌以活化碳基纳米材料表面的羧基；再加入氨基功能化cDNA溶液，进行第二次搅拌后制备得到cDNA-碳基纳米材料溶液；
(2)将玻碳电极用三氧化二铝粉末打磨，然后依次在乙醇和水中超声，最后在空气中干燥得到预处理后的电极；
(3)将步骤(2)预处理后的电极浸泡在HAuCl4溶液中电沉积金粒子，处理后的电极备用；
(4)在步骤(3)制备的电极上修饰Pb2+适配体溶液，在一定温度条件下继续反应一段时间，得到的电极备用；
(5)在步骤(4)制备的电极上滴加巯基己醇溶液，以封闭非特异性结合位点，室温条件下进行孵育，孵育后的电极备用；
(6)在步骤(5)制备的电极上滴加步骤(1)制备的cDNA-碳基纳米材料溶液；在一定温度条件下继续反应一段时间，此时，得到传感器标记为cDNA-碳基纳米材料/MCH/Apt/AuPs/GCE；
(7)将步骤(6)得到的传感器置于不同浓度Pb2+标准溶液中绑定一定的时间，一个浓度的Pb2+标准溶液对应一个传感器，浓度和传感器呈一一对应关系；绑定后的传感器经超纯水冲洗后在室温下自然晾干；此时制得的电极材料记为Pb2+/cDNA-碳基纳米材料/MCH/Apt/AuPs/GCE-1，以其作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极；所述的三电极体系在含有Ru(dcbpy)3 2+和三丙胺的缓冲溶液中进行测试；由MPI-EII电化学发光分析仪记录和检测电化学发光信号；建立Pb2+溶液浓度和电化学发光信号的对应关系的标准线性曲线；
(8)待测样品中Pb2+浓度的检测：
将步骤(6)得到的电极置于Pb2的待测溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干，记为Pb2+/cDNA-碳基纳米材料/MCH/Apt/AuPs/GCE-2；此时制得的电极Pb2+/cDNA-碳基纳米材料/MCH/Apt/AuPs/GCE-2作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极；将所述的三电极体系在含有Ru(dcbpy)3 2+和三丙胺的缓冲溶液中进行测试，检测电化学发光信号；代入步骤(7)建立的标准线性曲线中，得到待测溶液中Pb2+的浓度，实现对Pb2+的高灵敏检测。
2.根据权利要求1所述的灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述碳基纳米材料包括氧化石墨烯、碳量子点和氮掺杂CQDs；
所述1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:1；所述1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸的浓度为10mM，N,N-二甲基甲酰胺的浓度为5mM；
所述混合溶液A、碳基纳米材料溶液和氨基功能化cDNA溶液的体积比为1:2：2；所述cDNA溶液的浓度为1μM；
所述第一次搅拌的时间为15min；所述第二次搅拌的时间为2h。
3.根据权利要求1所述的灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述玻碳电极的直径为3mm；三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm和0.05μm。
4.根据权利要求1所述的灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述HAuCl4的质量百分浓度为1％；电沉积的电位为-0.25V，电沉积的时间为20s。
5.根据权利要求1所述的灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法，其特征在于，步骤(4)中，所述Pb2+适配体溶液的浓度为0.2μM，在电极上修饰的用量为6μL；所述一定温度为4℃，反应时间为12h。
6.根据权利要求1所述的灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法，其特征在于，步骤(5)中，所述巯基己醇溶液的浓度为1mM；在电极上滴加的用量为6μL；所述孵育的时间为1h。
7.根据权利要求1所述的灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法，其特征在于，步骤(6)中，所述cDNA-碳基纳米材料溶液浓度为0.4～2.8mg mL-1；用量为6μL；所述一定温度条件为37℃，反应时间为2h。
8.根据权利要求1所述的灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法，其特征在于，步骤(7)中，所述Pb2+溶液的浓度为100aM～100nM；所述绑定一定的时间为40min；所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，浓度为0.1M，pH值为7.5；所述缓冲溶液中Ru(dcbpy)3 2+的浓度为0.16mM，缓冲溶液中三丙胺的浓度为10μM；所述测试时所采用的参数为：电压为0.2V～1.25V，扫描速率为0.1V/s，光电倍增管高压为700V。
9.根据权利要求1所述的灵敏度可控的Pb2+诱导的双放大电化学发光检测方法，其特征在于，步骤(8)中，所述Pb2+溶液绑定时间为40min；所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，浓度为0.1M，pH值为7.5；所述缓冲溶液中Ru(dcbpy)3 2+的浓度为0.16mM，三丙胺的浓度为10μM；所述测试时所采用的参数为：电压为0.2V～1.25V，扫描速率为0.1V/s，光电倍增管高压为700V。
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