CN113899800B - 一种检测水中铅的电化学发光适配体传感器制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种检测水中铅离子的电化学发光适配体传感器的制备与使用方法，其特征在于：利用碳化钛和金复合物的导电性、高比表面积，联吡啶钌的π‑π共轭强吸附作用，金和二氧化硅复合物的强催化作用、铅离子自身对适配体的剪切识别作用，构建了一个开关型检测水中铅离子的电化学发光生物传感器。本发明的传感器可根据检测结果中铅离子的电化学发光峰值改变判定被检水中是否含有目标离子。本发明的优点是：传感器成本低廉，检测操作简单；可对铅重金属进行定性与定量测定；具有较高的灵敏度和较低的检测限，为其他离子和小分子物质的检测提供思路。
Description
技术领域
本发明涉及一种电化学发光适配体传感器和这种传感器的制备方法以及使用方法，属于电化学发光适配体传感器技术领域。
背景技术
自然界中水是生物生存不可缺少的条件，随着我国工业化进程的加速、农业生产技术的提高，水的污染日益严重；水中重金属污染来源广泛，主要来源是工业污染、农业污染及生活污染；日趋加剧的水污染，已对人类的生存安全构成重大威胁，成为人类健康、经济和社会可持续发展的重大障碍；重金属对水环境污染不仅对动植物产生危害，而且直接影响人类生活饮用水的质量及对人体的直接或间接的威胁；水中重金属通过食物链进入到人体，这些重金属通过长期积累，而自身又无法分解，危害人体健康；水环境中的重金属污染，特别是铅离子(Pb2+)严重影响水生生物的生长，其降解非常困难，最终通过富集进入人体，危害神经和血液系统、胃肠道、心血管和肾脏系统；由于水环境中的重金属污染主要是由混合污染引起的，水体中的金属元素较多，这使得水中重金属的检测十分复杂，所以开发一种便捷、高效、快速和实用的水中重金属污染的分析方法显得格外重要，这一工作对保护生态环境、提高食品质量、保护人类安全具有重要的理论和实际意义。
重金属的检测方法：目前重金属的检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法、原子吸收光谱法、分光光度法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、比色法等这些传统的重金属检测方法虽然应用比较成熟、灵敏度和准确性较高、检测限低、检测范围宽等，但仪器价格昂贵、耗时长、样品处理复杂、携带不方便、无法连续监测及现场测定等，极大地限制了其广泛应用；因此，寻求一种简单、快速、灵敏的重金属离子检测技术，仍然是人们不断追求的目标；为了切实保障食品安全及人类生命安全，需要建立高效、灵敏、实用的重金属快速检测方法。
发明的目的在于提供一种能克服上述问题以及制备简单、操作灵活、高灵敏度、高准确性、选择性及稳定性好，构建的电化学发光适配体传感器无需酶的催化作用，直接通过适配体与靶标物质铅离子结合，对适配体特定位点剪切，可对水中重金属铅离子特定检测的电化学发光适配体传感器的制备方法。
发明内容
技术方案为：一种检测铅重金属的适配体传感器的制备方法，其特征在于：适配体传感器的敏感界面组成包括碳化钛和金的(MXene@Au)复合材料、金和二氧化硅(Au@SiO2)复合材料，进而固定重金属铅的适配体。
所述的一种检测铅重金属的适配体传感器的制备方法，其特征在于：玻碳电极（d=3 mm）的清洗，适配体传感器敏感界面的构建及过程表征（制备MXene@Au、Au@SiO2，利用MXene@Au、Au@SiO2的固定催化作用共同修饰电极），适配体传感器工作曲线的建立，适配器传感器性能的检测，适配体传感器对实际样品的检测。
所述的一种检测铅重金属的适配体传感器的制备方法，其特征在于：实验条件的优化，主要包括适配体浓度、测试底液的PH以及适配体与靶标物质的孵育时间；所制备的适配体传感器的工作曲线为：y=8274.00-903.73lgx （R2=0.998）；适配体传感器性能检测包括特异选择性、重现性、稳定性以及适配体传感器对水样回收率的测定。
目标离子电化学发光检测：采用电化学发光检测法利用三电极体系在最佳实验条件下检测废水样品，根据检测结果中电化学发光强度值进行分析即可获知电化学发光强度峰值大小与该金属离子的浓度成反比，据此可获得重金属离子浓度信息。
本发明的制备原理为：核酸适配体是一类特异性识别功能的单链DNA或者RNA核酸分子，能够与靶标物质快速、高亲和力和高特异性结合，所以适配体检测重金属也随之发展起来，将适配体末端交联到固相载体作为捕获分子，去捕获待测标本中的靶标物质，另一个适配体的5，端标有相应的指示剂或者催化物质，如荧光素、生物素、放射性同位素或纳米金和纳米银等标记转化为检测分子，当检测分子与相应的待测标本结合后就会产生信号，从而达到检测目的；本发明采用MXene@Au、Au@SiO2以及联吡啶钌对玻碳电极进行修饰；由于MXene的高比表面积和高导电性，加上纳米金的导电性，增加电极表面电子传输能力和稳定性，通过MXene@Au的高比表面积，使电极表面具备更好地定向固定铅适配体的能力，从而为铅重金属适配体的固定提供了良好的传感器界面，保持了铅重金属适配体的有效固定量，进而增加了传感器的检测精度；经上述步骤制备的适配体传感器，简单灵敏，稳定性和特异性较好，重现性好，而且回收率符合要求。
为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测铅重金属的适配体传感器的制备方法，其特征在于：（1）适配体传感器制备前裸玻碳电极的清洗、活化和性能测试，如果测试循环伏安曲线中的峰电位差在100 mV以下，氧化峰和还原峰对称，则所述的玻碳电极可使用，否则要重新返回清洗步骤中，直到符合；（2）清洗好的玻碳电极表面滴涂分散均匀的MXene@Au，继而修饰联吡啶钌，然后把适配体S1链固定在纳米金上，之后滴涂Au@SiO2与适配体S1链相连，再加入适配体S2链与适配体S1链碱基互补配对，最后加入靶标物质；适配体传感器制备结束后，放入4℃冰箱里保存备用。
为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测铅重金属的适配体传感器的制备方法，其特征在于：（1）将上述制备好的适配体传感器在工作底液中用电化学发光方法检测，得到峰值和靶标物质的关系；（2）配置一系列的铅离子浓度标准液，进行电化学方法测定，进一步得到上述制备的适配体传感器的工作曲线、检测范围和检测限；（3）配置一系列常见的重金属溶液，以检测所制备的适配体传感器的选择性；（4）通过电化学发光法多次验证上述适配体传感器的稳定性；（5）对实际废水样品进行分析得出适配体传感器的回收率。
本发明采用简单的原位生长法合成MXene@Au来促进电极表面的电子转移速率，提高电极上的响应电流，改善电极表面的微环境，因而可以作为载体材料，用以制备响应信号强和灵敏度高的适配体传感器；Au@SiO2可以催化测试底液与联吡啶钌发生反应，增强电化学发光信号，增强峰值的变化范围，从而增大了适配体传感器的检测精度；另外，传感器制备方法简单，有较高的稳定性和特异性，能够用于水样品中有重金属铅的检测，为水中重金属污染快速检测便携装置的研制奠定基础。
所述适配体传感器的制备工艺如下：在玻碳电极（GCE）上滴加5 μL的5 mg/mL的Mxene@Au，在室温条件下放置半小时，得到Mxene@Au/GCE。接着在Mxene@Au/GCE电极上滴加5 μL 200 nM的适配体S1链，于室温下放置半小时，待电极自然晾干后，再滴加5 μL 10 mg/mL的Au@SiO2，于室温下放置半小时，待电极自然晾干，再滴加5 μL 200 nM的适配体S2链，于室温下放置半小时，待电极自然晾干，适配体传感器制备完成，保存在4℃条件下备用。
附图说明
图1电化学发光传感器的基底材料表征。
图2电化学发光传感器的发光材料表征。
图3电化学发光传感器的电化学表征。（a：裸电极；b：Ru/Mxene@Au；c：apt1/Ru/Mxene@Au；d：Au@SiO2/apt1/Ru/Mxene@Au；e：apt2/Au@SiO2/apt1/Ru/Mxene@Au；f：Pb2+/apt2/Au@SiO2/apt1/Ru/Mxene@Au）。
图4电化学发光传感器的适配体浓度优化
图5电化学发光传感器孵育时间优化。
图6电化学发光传感器底液pH优化。
图7电化学发光传感器测量不同浓度重金属铅的标准曲线。
图8电化学发光传感器特异性研究。
图9电化学发光传感器重现性研究。
图10电化学发光传感器稳定性研究。
具体实施方式
实施例：
（1）MXene@Au的制备：将12 mL的0.5 mg/mL MXene超声分散10 min，之后加入60 μL的1%的氯金酸（HAuCl4 .3H2O），反应30 min之后，再加入50 μL的0.16 mol/L硼氢化钠（NaBH4）和1.6 mol/L氢氧化钠（NaOH）（两者的体积比=1:1）的混合物，超声处理30 min，用离心机在10000 rpm下离心8 min，用超纯水离心洗涤3次，在60℃条件下真空干燥，配制成5mg/mL的溶液。
（2）联吡啶钌的制备：将壳聚糖溶于1%的醋酸溶液中，配制成0.05%的壳聚糖溶液，加入联吡啶钌，配制成1 mM的溶液，超声10 min，混合均匀。
（3）纳米金溶液的制备：将实验中可能用到的玻璃容器全部提前置于王水（硝酸与盐酸体积比=1:3）中浸泡24 h，超纯水清洗5遍，烘干待用。量取200 mL的超纯水，加入2 mL氯金酸溶液，轻摇溶液混匀，置于微波炉中加热至溶液沸腾。迅速去除，按同一方向摇晃瓶身，使瓶里的溶液转动起来，快速加入1%柠檬酸三钠，继续摇晃混匀，放回微波炉加热4min，取出容器，此时的溶液呈现酒红色。置于室温冷却，待冷却至室温，加入超纯水定容至200 mL，即为（0.1 mg/mL）纳米金溶液。
（4）Au@SiO2的制备：将80 μL 20%的硅酸乙酯-乙醇溶液加入到上述合成的纳米金溶液20 mL和200 μL 0.1 M NaOH的混合液中，在25℃的条件下孵育24 h并剧烈搅拌，溶液在7000 rpm下离心10 min，超纯水离心洗涤3次，沉淀在超纯水中重新分散。
（5）玻碳电极的清洗：玻碳电极修饰前，用0.3 μm的Al2O3于麂皮上抛光至镜面，抛光后用去离子水洗去除表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次5 min，重复2次，无水乙醇和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥。
（6）玻碳电极的测试：在含有0.1 M KCl和5 mM [Fe(CN)6]3-/4-的0.01 M PBS溶液中跑循环伏安曲线，以测试所述玻碳电极的性能，扫描速度为50 mV/s，扫描电位为-0.1～0.6 V；当所述循环伏安曲线中的氧化还原峰电位差在100 mV以下时，则所述玻碳电极可进一步使用，否则要返回步骤（5）中继续处理所述玻碳电极，直至符合要求。
（7）在玻碳电极（GCE）上滴加5 μL的5 mg/mL的Mxene@Au，在室温条件下放置半小时，得到Mxene@Au/GCE。接着在Mxene@Au/GCE电极上滴加5 μL 200 nM的适配体S1链，于室温下放置半小时，待电极自然晾干后，再滴加5 μL 10 mg/mL的Au@SiO2，于室温下放置半小时，待电极自然晾干，再滴加5 μL 200 nM的适配体S2链，于室温下放置半小时，待电极自然晾干，适配体传感器制备完成，保存在4℃条件下备用。
（8）采用三电级体系，利用电化学发光法对测试底液pH、适配体浓度，孵育时间等实验因素进行优化，测试底液pH的范围为7.0~10.0，适配体浓度的范围为10 nM~400 nM,孵育时间的范围为10～80 min。
（9）在最佳测试条件下使用电化学发光法进行进行浓度梯度定量分析测试，适配体浓度为200 nM，测试底液pH为8.0，测试用的铅的浓度区间为0.1～106ng/L，得到铅最低检测限分别为0.008 ng/L，回归方程分别为IECL=8274.00-903.73lgC(Pb2+)，R2=0.998，见图7。
（10）在测试体系中分别加入浓度为50 μg/L的铜、铁、银、锌、镍、汞、钴、镁干扰离子，通过电化学发光法进行测试，以检测其抗干扰性；选1根于制备好的电极在铅浓度为1000 ng/L时重复测定六次，检测其稳定性。
（11）将水样品过滤、超声、离心后，加入铅重金属溶液，进行实际样品检测分析。
此种电化学发光适配体传感器可对废水中的铅重金属进行检测，传感器成本低廉，操作简单，检测时间短，抗干扰能力强，稳定性好，特异性强，具有较高的检测灵敏度，符合我国废水中铅重金属快速检测技术发展和国际化要求。
Claims (3)
1.一种检测废水样中铅离子的电化学发光生物传感器，其特征在于：运用共价键、π-π共轭
键、自组装技术构建适配体传感器用于检测铅重金属，并且引入碳化钛和金复合物、金和二
氧化硅复合物、纳米金，不仅可以增强适配体传感器的电化学特性，而且可以增强电化学发
光信号，利用铅适配体与铅的特异性结合，来定向检测铅重金属，既不需要酶的催化作用，
通过铅重金属对适配体的特异性剪切，实现对铅的高特异性识别，以更有效的完成目标成分
铅重金属的快速检测，碳化钛和金复合物、金和二氧化硅复合物的制备步骤为：
MXene@Au 的制备：将 12 mL 的 0.5 mg/mL MXene 超声分散 10 min，之后加入 60 μL 的
1%的氯金酸，反应 30 min 之后，再加入 50 μL 的 0.16 mol/L 硼氢化钠和 1.6mol/L 氢氧化钠
的混合物，两者的体积比为 1:1，超声处理 30 min，用离心机在 10000 rpm 下离心 8min，用
超纯水离心洗涤 3 次，在 60℃条件下真空干燥，配制成 5 mg/mL 的溶液；
Au@SiO2 的制备：将实验中可能用到的玻璃容器全部提前置于王水中浸泡 24 h，超纯水清
洗 5 遍，烘干待用；量取 200 mL 的超纯水，加入 2 mL 氯金酸溶液，轻摇溶液混匀，置于
微波炉中加热至溶液沸腾，迅速去除，按同一方向摇晃瓶身，使瓶里的溶液转动起来，快速
加入 1%柠檬酸三钠，继续摇晃混匀，放回微波炉加热 4 min，取出容器，此时的溶液呈现酒
红色；置于室温冷却，待冷却至室温，加入超纯水定容至 200 mL，即为 0.1 mg/mL 纳米金
溶液；将 80 μL 20%的硅酸乙酯-乙醇溶液加入到上述合成的纳米金溶液 20 mL 和200 μL 0.1
M NaOH 的混合液中，在 25℃的条件下孵育 24 h 并剧烈搅拌，溶液在 7000 rpm 下离心 10
min，超纯水离心洗涤 3 次，沉淀在超纯水中重新分散。
2.用于制备权利要求 1 所述的一种检测废水样中铅离子的电化学发光生物传感器，其特征
在于：MXene@Au 通过金硫键连接适配体 S1 链，MXene@Au 不仅能够为玻碳电极提供大
的比表面积，而且还能够增加电极表面电子传输速率，增加了适配体传感器界面的导电性，
显著增强了电流响应；另外 Au@SiO2 能够促进测试底液与发光物质的转化，借助 Au@SiO2
的催化作用，增强了电化学发光信号。
3.用于制备权利要求 1 所述的一种检测废水样中铅离子的电化学发光生物传感器，其特征
在于：通过纳米材料的协同作用，为适配体在电极表面的固定提供了一个良好的生物界面，
扩大了电极的有效固定面积，提高了传感器表面适配体的有效固定量，进而增大了铅重金属
的检测精度和灵敏度，适配体传感器的制备步骤为：
在玻碳电极上滴加 5 μL 的 5 mg/mL 的 Mxene@Au，在室温条件下放置半小时，得到
Mxene@Au/GCE，接着在 Mxene@Au/GCE 电极上滴加 5 μL 200 nM 的适配体 S1 链，于室
温下放置半小时，待电极自然晾干后，再滴加 5 μL 10 mg/mL 的 Au@SiO2，于室温下放置半
小时，待电极自然晾干，再滴加 5 μL 200 nM 的适配体 S2 链，于室温下放置半小时，待电极自然晾干，适配体传感器制备完成，保存在 4℃条件下备用。
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| CN110438200A (zh) * | 2019-08-09 | 2019-11-12 | 重庆医科大学 | 一种基于双信号放大的用于重金属铅离子检测的生物传感器 |
| CN111208182A (zh) * | 2020-03-11 | 2020-05-29 | 山东理工大学 | 一种同时检测土壤中铅镉重金属的电化学传感器的制备方法 |
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| 一种基于聚苯胺-羧甲基纤维素钠(PANI-CMC)纳米复合材料的低成本新型亚硝酸盐电化学传感器;褚光雷 等;中国化学会第十四届全国电分析化学学术会议会议论文集（第二分册）;全文 * |
| 基于RGO-Au-ZIF-8复合材料的电化学传感器制备及其在铅离子和铜离子同时检测中的应用;孙延慧;齐有啸;申优;井翠洁;陈笑笑;王新星;;化学学报(02);全文 * |
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