CN110702760B - 一种检测铀酰离子的纳米金-dna网状结构电化学生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

一种检测铀酰离子的纳米金-dna网状结构电化学生物传感器及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分析化学与生物电化学传感技术领域，公开了一种检测铀酰离子的纳米金‑DNA网状结构电化学生物传感器及其制备方法和应用。本发明所述生物传感器包括金电极、MCH、巯基化的DNAS1或DNAS2、修饰有巯基化的DNAS1的AuNPs以及修饰有巯基化的DNAS2的AuNPs。本发明利用在金电极表面形成纳米金‑DNA网状结构来实现信号的双重放大，利用铀酰离子对DNAzyme的特异性切割来实现对铀酰离子的检测，检测结果具备较佳的回收率，检测准确度较高，同时能够达到较高的灵敏度和特异性。

Description

一种检测铀酰离子的纳米金-DNA网状结构电化学生物传感器 及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分析化学与生物电化学传感技术领域，更具体的说是涉及一种检测铀酰离子的纳米金-DNA网状结构电化学生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
铀是一种重要战略物质，也是存在于环境中的一种非常重要的天然放射性核素。铀现已被广泛应用于核能开发与核军工等领域，全球相关产业对铀的需求也与日俱增。铀兼具放射毒性与化学毒性，其导致机体产生的辐射损伤与急慢性化学毒性效应不容忽视。外环境中铀经生物富集进入食物链，通过消化系统经血液分布至人体全身，超剂量阈值之后易引发免疫系统、造血系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统、神经与内分泌系统等损伤，严重可产生致癌、致畸、致突变效应。铀矿冶、铀浓缩、乏燃料后核工业过程均伴随有大量含铀废水的产生与释放，地质活动与铀尾矿库也将导致铀通过迁移、扩散和转化进入环境中，从而威胁环境与生态安全，并对人类健康产生巨大潜在风险。铀在外环境存在多种形式，而铀酰离子(UO2 2+)是自然界中铀最常见、最稳定、最广泛存在的化学形式。美国国家环境保护局规定，饮用水中铀的最高允许浓度为130nM，据报道，有些被污染区域水体中铀浓度高达4.2μM，远超过规定值。因此，开发一种超灵敏、快速、便捷的现场实时检测水体中铀酰离子的新方法是非常必要的，对于环境与生态安全具有重要意义。
目前，已经开发了多种不同的技术来检测水体中的铀酰离子，如原子吸收光谱法，电感耦合等离子体质谱法，激光诱导动力学磷光法，全反射X射线荧光光谱法，表面增强拉曼光谱法等。这些传统方法在操作过程中存在仪器设备昂贵、难以携带、操作过程繁琐等缺陷，难以用于环境水体痕量铀浓度的现场实时测定。
电化学方法操作简单、灵敏度高、特异性好，可以满足现场快速检测铀酰离子的要求，近年来备受关注。构建一种操作便捷、灵敏度高、特异性好、准确度高的电化学生物传感器，在环境中铀的检测与预警领域具有良好的应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测铀酰离子的纳米金-DNA网状结构电化学生物传感器及其制备方法，使得所述生物传感器用于检测铀酰离子时具有较佳的回收率，检测准确度较高，同时能够达到较高的灵敏度和特异性；
本发明的另外一个目的在于提供一种检测铀酰离子的纳米金-DNA网状结构电化学生物传感器及其制备方法，使得所述生物传感器具备双重信号放大作用，并增强生物传感器结构的稳定性；
本发明的另外一个目的在于提供上述生物传感器在检测铀酰离子中的应用，以及在制备铀酰离子的电化学检测产品中的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测铀酰离子的纳米金-DNA网状结构电化学生物传感器，包括金电极、MCH、巯基化的DNAS1或DNAS2、修饰有巯基化的DNAS1的AuNPs以及修饰有巯基化的DNAS2的AuNPs；
其中，所述DNAS1与DNAS2能够形成DNAzyme并可互补配对，巯基化的DNAS1或DNAS2通过Au-S键修饰在金电极表面，修饰有巯基化的DNAS1的AuNPs和修饰有巯基化的DNAS2的AuNPs通过互补配对组成纳米金-DNA网状结构，所述纳米金-DNA网状结构通过互补配对与巯基化的DNAS1和/或DNAS2连接，所述封闭剂通过Au-S键修饰在金电极表面。本发明所述纳米金-DNA网状结构电化学生物传感器的结构示意图参见图1。
本发明借助具有较大比表面积的纳米金，负载更多的DNA，实现信号的放大；而纳米金-DNA网状结构优势可以扩大探针延伸的空间，稳定性增强，避免其他小分子的非特异性吸附，实现了信号的再一次放大。同时，纳米金-DNA网状结构的形成，增强了生物传感器结构的稳定性。
在本发明具体实施方式中，所述巯基化的DNAS1或DNAS2为5’端修饰有-(CH2)6-SH的DNAS1或DNAS2；其中，所述DNAS1序列如SEQ ID NO:1所示，DNAS2序列如SEQ ID NO:2所示。
利用本发明所述生物传感器对样本中的铀酰离子进行检测，检测结果具备较佳的回收率，检测准确度较高，同时能够达到较高的灵敏度和特异性。基于此，本发明还提出了所述生物传感器在检测铀酰离子中的应用或在制备铀酰离子的电化学检测产品中的应用。
依据应用，本发明提供了所述生物传感器检测铀酰离子的方法，以本发明所述生物传感器作为工作电极与电化学工作站连接，对铀酰离子进行检测。其中，所述电化学工作站包括但不限于参比电极(饱和甘汞电极)、辅助电极(铂电极)等常规组成部分，这些常规组成部分配合工作电极完成检测工作。
作为优选，所述检测方法为：
步骤A、配制梯度浓度的铀酰离子溶液；
步骤B、将本发明所述生物传感器分别浸泡在梯度浓度的铀酰离子溶液反应并清洗；
步骤C、将反应后的生物传感器浸入电化学指示剂中反应并清洗；
步骤D、以本发明生物传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极的三电极系统、采用差分脉冲法进行电化学检测，检测底液为PBS，制作出标准曲线；
步骤E、将待测样本按照步骤B至步骤D的方法进行检测，将检测结果代入标准曲线获得检测结果。
其中，梯度浓度的铀酰离子溶液为0.01nM、0.025nM、0.04nM、0.06nM、0.1nM、0.25nM、0.4nM、0.6nM、1nM的铀酰离子溶液，优选用pH为6的PBS配制；所述电化学指示剂优选为有机染料、具有强荧光性质的有机化合物，或者含有简单联吡啶或邻菲罗啉等平面配体的钴、锇、钌等金属配合物等等，浓度为20μM，在本发明中选择使用亚甲基蓝(MB)；所述检测底液为10mM的PBS(pH＝6.0)，所述差分脉冲法的电位设置为0到-0.5V；
在本发明具体实施方式中，所述检测方法为：
步骤A、用pH＝6.0的磷酸缓冲液配置浓度为0.01nM、0.025nM、0.04nM、0.06nM、0.1nM、0.25nM、0.4nM、0.6nM、1nM的铀酰离子溶液；
步骤B、将本发明所述生物传感器分别浸泡在不同浓度的铀酰离子溶液中，反应1h后清洗；
步骤C、将所述生物传感器浸入浓度为20μM的亚甲基蓝溶液中，反应10min后清洗，用于电化学检测；
步骤D、所述检测过程中采用三电极系统，以金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极，用差分脉冲法进行测试，检测底液为10mM的PBS(pH＝6.0)，电位设置为0到-0.5V，得到稳定的电流值，并做出标准曲线；
步骤E、将待测样本按照步骤B至步骤D的方法进行检测，将检测结果代入标准曲线获得检测结果。
本发明所述应用中的铀酰离子的电化学检测产品优选为以本发明所述生物传感器为工作电极的电化学工作站。
此外，本发明还提供了所述生物传感器的制备方法，包括：
步骤1、制备AuNPs，并对所制得的AuNPs上分别修饰巯基化的DNAS1和巯基化的DNAS2，制成AuNPs-DNAS1与AuNPs-DNAS2复合物；
步骤2、对金电极表面进行清洗；
步骤3、巯基化的DNAS1或DNAS2通过Au-S键修饰到金电极表面；
步骤4、步骤3修饰好的金电极表面继续通过Au-S键修饰封闭剂；
步骤5、步骤4修饰好的金电极上滴加AuNPs-DNAS2与AuNPs-DNAS1复合物，获得所述生物传感器；
其中，步骤1与其余各步骤属于并列关系。
作为优选，步骤1中所述AuNPs通过柠檬酸钠还原氯金酸法制备获得；具体为：将0.01％氯金酸溶液加热至回流，之后迅速加入1％柠檬酸三钠溶液，继续回流至溶液变成酒红色时停止加热，继续搅拌并冷却到室温，4℃下保存备用。
作为优选，步骤1中所述AuNPs-DNAS1与AuNPs-DNAS2复合物通过活化试剂活化DNAS1和DNAS2的巯基与AuNPs偶联；具体为：将硫醇化的DNAS1用过量的TCEP中活化1h后，DNAS1分散在纳米金溶液中，并在4℃孵育12小时；加入SDS室温下震荡1h，然后再加氯化钠溶液陈化20小时，最后用PBS缓冲液(pH7.4)清洗并离心3次，最终所得的复合物AuNPs-DNAS1用TE缓冲液保存备用；复合物AuNPs-DNAS2的制备方法与AuNPs-DNAS1相同。
作为优选，所述步骤2为对金电极进行抛光，然后进行清洗，最后浸入食人鱼溶液，取出后用氮气吹干；具体为：用粒径为1.0μm、0.3μm、0.05μm三氧化二铝粉末依次对裸金电极进行抛光，并用超纯水、无水乙醇、超纯水分别超声清洗5min，最后将电极浸入食人鱼溶液中10min，取出电极冲洗并氮气吹干。
作为优选，所述步骤3和步骤4中的Au-S键通过活化试剂活化巯基后连接到金电极表面上；所述活化试剂优选为TCEP；
在本发明具体实施方式中，所述步骤3为：将DNAS1或DNAS2用过量TCEP活化后滴加在金电极表面，孵育12h后清洗；
所述步骤4为：在步骤3得到的DNAS1或DNAS2修饰的金电极表面滴加封闭剂，孵育1h后清洗。其中，封闭剂可采用常规封闭剂如BSA、巯基乙醇等，但在本发明中，封闭剂优选为MCH(巯基己醇)，修饰MCH的作用不仅起到封闭金电极表面作用，避免其它非特异性DNA的吸附，并且使前一步DNAS1或DNAS2能直立起来，更利于后续纳米金-DNA网状结构的形成并与金电极连接。
在本发明步骤5中，滴加AuNPs-DNAS2与AuNPs-DNAS1复合物的先后顺序取决于步骤3中采用的是DNAS1还是DNAS2，若采用DNAS1，则先滴加AuNPs-DNAS2复合物后滴加AuNPs-DNAS1复合物；若采用DNAS2，则先滴加AuNPs-DNAS1复合物后滴加AuNPs-DNAS2复合物；
以采用DNAS1为例，在本发明具体实施方式中，步骤5为：修饰了DNAS1与MCH的金电极表面滴加复合物AuNPs-DNAS2，再继续滴加相同量的复合物AuNPs-DNAS1至电极表面，孵育6h后清洗。
本发明生物传感器的制备过程示意图和检测原理示意图均可参见图1。
由以上技术方案可知，本发明利用在电极表面形成纳米金-DNA网状结构来实现信号的放大，利用铀酰离子对DNAzyme的特异性切割来实现对铀酰离子的检测。传统的方法电极表面的修饰比较的单一，灵敏度就受到了一定的阻碍，本发明提高了一种新的思路，有效实现了信号的扩增。
与现有技术相比，本发明制备的检测铀酰离子的电化学生物传感器具有以下优势：(1)本发明具有良好的稳定性，且不易受其他金属离子的干扰，选择性强，可满足与复杂水样的检测；(2)DNAzyme与铀酰离子之间的强结合亲和力以及网状结构的信号扩增提高了灵敏度；(3)本发明操作简单，避免了复杂的实验步骤，能快速准确的检测水样中铀酰离子的含量。
附图说明
图1所示为本发明纳米金-DNA网状结构电化学生物传感器进行铀酰离子定量检测的原理示意图；
图2所示为本发明纳米金颗粒的电镜图；
图3所示为本发明的生物传感器不同修饰阶段的循环伏安图；其中，裸金电极(a)，Au/DNAS1(b)，Au/DNAS1/MCH(c)，Au/DNAS1/MCH/AuNPs-DNAS1(d)，Au/DNAS1/MCH/纳米金-DNA网状结构(e)；
图4所示为本发明的生物传感器不同修饰阶段的电化学阻抗图；其中，裸金电极(a)，Au/DNAS1(b)，Au/DNAS1/MCH(c)，Au/DNAS1/MCH/AuNPs-DNAS1(d)，Au/DNAS1/MCH/纳米金-DNA网状结构(e)；
图5所示为本发明的生物传感器在不同铀酰离子浓度下的响应；
图6所示为本发明的生物传感器对铀酰离子检测的选择性实验图。
具体实施方式
本发明公开了一种检测铀酰离子的纳米金-DNA网状结构电化学生物传感器及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述传感器及其制备方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述传感器及其制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明生物传感器的制备过程以及检测原理如图1所示，酶链与底物链通过碱基互补配对形成铀酰离子特异性切割的DNAzyme。两种单链DNA分别修饰金纳米粒子(AuNPs)后，在电极表面，AuNPs-DNA通过反复交替构建出了网状的超分子结构，实现了电信号的放大。用亚甲基蓝(MB)作为电化学指示剂通过静电吸附嵌入DNAzyme中。铀酰离子存在时，纳米金-DNA网状结构中的特异性位点被铀酰离子剪切，释放出MB产生电化学响应，以此来检测铀酰离子的浓度。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：制备本发明所述生物传感器
1、AuNPs的制备
将50mL 0.01％的氯金酸溶液加入到三口烧瓶中，快速搅拌并加热至溶液开始回流。加入2ml 1％的柠檬酸三钠，继续回流15min，当溶液的颜色从淡黄色变为深紫色，到最后酒红色时，说明AuNPs已经形成。停止加热，继续搅拌并冷却到室温。得到的产物用22μm的滤头和注射器过滤，棕色瓶中4℃下保存备用；所得的AuNPs透射电镜图如图2(左)所示，其粒径在13nm左右。
2、复合物AuNPs-DNAS1与AuNPs-DNAS2的制备
先将DNAS1用过量的TCEP在室温下处理1h，然后将150μL 10μM的DNAS1与500μL的AuNPs混合并在4℃孵育12h，再加入10μL 1％的SDS室温下震荡1小时，最后再加入50μL0.5M的NaCl陈化20小时；溶液用离心机在10000r/min的速度下离心15min，吸去上清液，再用10mM的PBS(pH7.4)清洗并离心3次，所得的复合物AuNPs-DNAS1用TE缓冲液保存备用。复合物AuNPs-DNAS2的制备方法与AuNPs-DNAS1相同，透射电镜图如图2(右)所示。
酶链DNAS1：3'-TGA GTG ATA CAG ACT TCC AGC CAA ATT GAT GGG CTG ACG TCTCTA CCT GCA C-(CH2)6-SH-5'；
底物链DNAS2：3'-GTG CAG GTA GAG AAG GrAT ATC ACT CA-(CH2)6-SH-5'；(rA表示其为RNA碱基)
3、金电极的清洗
将金电极依次用粒径为1.0、0.3和0.05μm的三氧化二铝粉末在麂皮砂纸上抛光至镜面。依次用超纯水、无水乙醇、超纯水各超声5min，食人鱼溶液浸泡15min，并用超纯水清洗干净,氮气吹干。
4、巯基化的DNAS1修饰金电极
向清洗后所得金电极表面滴加10μL 2μΜ的DNAS1溶液，室温下避光孵育12h，超纯水清洗并吹干。
5、MCH修饰金电极
向修饰巯基化的DNAS1所得金电极表面滴加10μL1mM的MCH溶液，室温下温育1h。超纯水清洗并吹干。
6、纳米金-DNA网状结构的形成
在修饰MCH所得金电极表面滴加10ml AuNPs-DNAS2溶液35℃下孵育2h后，继续滴加10μL AuNPs-DNAS1溶液反应4h，获得所述生物传感器。
实施例2：本发明所述生物传感器的不同修饰过程的电化学表征
将实施案例1中的金电极在不同修饰阶段的5mM铁氰化钾/亚铁氰化钾中的循环伏安如图3所示，裸金电极(a)，Au/DNAS1(b)，Au/DNAS1/MCH(c)，Au/DNAS1/MCH/AuNPs-DNAS1(d)，Au/DNAS1/MCH/纳米金-DNA网状结构(e)。可以看出随着电极表面修饰物的增多，阻碍的表面电子的转移，电流减小，电位差逐渐增大，表明电极表面层层修饰成功。
将实施案例1中的金电极在不同修饰阶段的5mM铁氰化钾/亚铁氰化钾中的电化学阻抗如图4所示，裸金电极(a)，Au/DNAS1(b)，Au/DNAS1/MCH(c)，Au/DNAS1/MCH/AuNPs-DNAS1(d)，Au/DNAS1/MCH/纳米金-DNA网状结构(e)。可以看出随着电极表面的修饰物增多，阻抗随之增大，与循环伏安结果保持一致。
实施例3：本发明所述生物传感器对不同浓度铀酰离子的检测
按照上述实例1的生物传感器制备步骤，将生物传感器在含0.01nM、0.025nM、0.04nM、0.06nM、0.1nM、0.25nM、0.4nM、0.6nM、1nM铀酰离子的磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.0)中反应10min后，超纯水冲洗干净。反应电极浸入浓度为20μM的亚甲基蓝溶液中10min后，超纯水清洗，用于电化学检测。结果如图5所示，随着铀酰离子浓度的增加，传感器的信号逐渐减弱，峰电流与铀酰离子浓度的对数呈良好的线性关系。线性相关方程为I(μA)＝-0.1415ln[C]+0.0487(相关系数R2＝0.9923，C代表铀酰离子的浓度)，检出限为8pM，说明该传感起对铀酰离子具有较高的灵敏度。
实施例4：本发明所述生物传感器对铀酰离子的特异性检测
特异性实验中，所述铀酰离子的浓度为1nM；所述其他金属离子为：Cu2+、Co2+、Zn2+、Mg2+、K+、VO2+、Mn2+、Fe3+、Ni2+、Ca2+、Cd2+，浓度为10nM。按照上述实施例1的生物传感器制备步骤，将传感器在含所述其他金属离子的磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.0)中反应10min后，超纯水冲洗干净。反应电极浸入浓度为20μM的亚甲基蓝溶液中10min后，去离子水清洗，用于电化学检测。结果如图6所示，与铀酰离子对比，传感器对其他金属离子的电化学响应非常小，说明生物传感器对铀酰离子具有良好的特异性。
实施例5：本发明生物传感器在实际水样中的检测
首先将实际水样过滤，分别在实际水样中加入25pM和50pM的铀酰离子。按照上述实施例1的生物传感器制备步骤，将传感器浸入到实际水样中10min后。超纯水冲洗干净。反应电极浸入浓度为20μM的亚甲基蓝溶液中10min后，超纯水清洗，用于电化学检测。测得铀酰离子在96-101.5％范围内的回收率，证明了该方法在实际样品中的可行性，也证明本发明的检测准确度较高(回收率越贴近100％准确度越高)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南华大学
<120> 一种检测铀酰离子的纳米金-DNA网状结构电化学生物传感器及其制备方法和应用
<130> MP1920725
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgagtgatac agacttccag ccaaattgat gggctgacgt ctctacctgc ac 52
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> a为RNA碱基
<400> 2
gtgcaggtag agaaggatat cactca 26

Claims (10)

1.一种检测铀酰离子的纳米金-DNA网状结构电化学生物传感器，其特征在于，包括电化学指示剂、金电极、封闭剂、巯基化的DNAS1或DNAS2、修饰有巯基化的DNAS1的AuNPs以及修饰有巯基化的DNAS2的AuNPs；
其中，所述DNAS1与DNAS2能够形成DNAzyme 并可互补配对，巯基化的DNAS1或DNAS2通过Au-S键修饰在金电极表面，修饰有巯基化的DNAS1的AuNPs和修饰有巯基化的DNAS2的AuNPs通过互补配对组成纳米金-DNA网状结构，所述纳米金-DNA网状结构通过互补配对与巯基化的DNAS1或DNAS2连接，所述封闭剂通过Au-S键修饰在金电极表面；电化学指示剂通过静电吸附嵌入DNAzyme中。
2.根据权利要求1所述生物传感器，其特征在于，所述巯基化的DNAS1或DNAS2为5’端修饰有-(CH2)6-SH的DNAS1或DNAS2。
3.根据权利要求1或2所述生物传感器，其特征在于，所述DNAS1序列如SEQ ID NO:1所示，DNAS2序列如SEQ ID NO:2所示。
4.权利要求1-3任意一项所述生物传感器在检测铀酰离子中的应用或在制备铀酰离子的电化学检测产品中的应用。
5.权利要求1所述生物传感器的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1、制备AuNPs，并对所制得的AuNPs上分别修饰巯基化的DNAS1和巯基化的DNAS2，制成AuNPs-DNAS1与AuNPs-DNAS2复合物；
步骤2、对金电极表面进行清洗；
步骤3、巯基化的DNAS1或DNAS2通过Au-S键修饰到金电极表面；
步骤4、步骤3修饰好的金电极表面继续通过Au-S键修饰封闭剂；
步骤5、步骤4修饰好的金电极上滴加AuNPs-DNAS2与AuNPs-DNAS1复合物，获得所述生物传感器；
其中，步骤1与其余各步骤属于并列关系。
6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤1中所述AuNPs通过柠檬酸钠还原氯金酸法制备获得。
7.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤1中所述AuNPs-DNAS1与AuNPs-DNAS2复合物通过活化试剂活化DNAS1和DNAS2的巯基与AuNPs偶联。
8.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述步骤2为对金电极进行抛光，然后进行清洗，最后浸入食人鱼溶液，取出后用氮气吹干。
9.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述步骤3和步骤4中的Au-S键通过活化试剂活化巯基后连接到金电极表面上。
10.一种检测铀酰离子的方法，其特征在于，以权利要求1-3任意一项所述生物传感器作为工作电极与电化学工作站连接，对铀酰离子进行检测。
CN201910962479.XA 2019-10-11 2019-10-11 一种检测铀酰离子的纳米金-dna网状结构电化学生物传感器及其制备方法和应用 Active CN110702760B (zh)

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