CN112630279B - 用于检测双氯酚酸的基于金纳米粒子的等离子共振增强型电化学发光传感器及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于电化学发光检测领域，具体涉及一种用于检测双氯酚酸的基于金纳米粒子的等离子共振增强型电化学发光传感器及制备方法。首先制备PTCA/CoP和Au NPs材料；再制备基于等离子共振的电化学发光传感器；然后以cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE修饰的玻碳电极作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂电极作为辅助电极，组成三电极体系，利用电化学发光法检测双氯酚酸；本发明检测双氯酚酸的成本低、灵敏度高、特异性强、操作简单。

Description

用于检测双氯酚酸的基于金纳米粒子的等离子共振增强型电 化学发光传感器及制备方法
技术领域
本发明属于电化学发光检测领域，具体涉及一种用于检测双氯酚酸的基于金纳米粒子的等离子共振增强型电化学发光传感器及制备方法。
背景技术
由于药品和个人护理产品(PPCP)在环境中无处不在，且具有引起不良生态影响的能力，在解决日益严重的水污染过程中PPCP作为新型污染物而受到广泛关注。双氯芬酸(DCF)是一种具有镇痛和解热特性的非甾体抗炎药，已被广泛用于缓解各种疼痛，如神经痛，癌症痛和创伤后疼痛等。但是，它也被认为是可以引起生态灾难的物质。此外，过度使用DCF，甚至在环境中长期暴露于DCF，都可能对人体的心脏和循环系统造成损害。
目前检测双氯酚酸的主要方法有毛细管电泳(CE)，高效液相色谱(HPLC)，液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)，以及固/液相微萃取法等。然而这些方法操作复杂、耗时、成本高、同时检测的灵敏度也不高。因此，有必要建立一种简单、快速、准确的方法来进行双氯酚酸的检测。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术检测双氯酚酸的不足，提供一种用于检测双氯酚酸的基于金纳米粒子的等离子共振增强型电化学发光传感器及制备方法。将苝四羧酸(PTCA)负载在CoP上，然后将Au NPs作为等离子体纳米颗粒用来增强PTCA/CoP的电化学发光信号。PTCA/CoP与Au NPs之间通过适配体(apt)连接，共同修饰在玻碳电极(GCE)上，具有特异性识别作用的适配体(apt)为识别元素；最后再在修饰电极上滴加cDNA(与适配体互补的DNA链)，使得形成双螺旋结构，具有紧密的刚性结构，从而使得PTCA/CoP与Au NPs之间发生等离子体共振。然后以cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE为工作电极，定量检测水中的双氯酚酸。
本发明采用的方案是将cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系检测双氯酚酸，具体步骤如下：
(1)PTCA/CoP复合材料的制备：
将0.1g苝四羧酸二酐(PTCDA)溶于10mL 0.1M NaOH中，在80℃下搅拌2h，得到黄绿色溶液后，滴入1.0M HCl直至完全沉淀，离心并用去离子水洗涤三次，60℃干燥得到暗红色粉末，即PTCA。
将Co(NO3)2·6H2O(2.3282g)、Na2HPO4(1.1357g)、尿素(1.9219g)溶解在40mL的去离子水中，并超声4h，待溶液混合均匀后，再加入90mL的乙二醇溶液并超声2h。最后以10000rpm离心10min，并用乙醇、去离子水洗涤两次，得到紫色粉末CoP。
取上述制备的CoP加入1mL含1mg/mL PTCA的DMF溶液中并且超声2h，得到淡红色溶液PTCA/CoP，其中，CoP和PTCA的质量比为1：1-3：1。
(2)Au NPs的制备：
将4mL的1％的柠檬酸三钠加入100mL沸腾的0.01％HAuCl4中，并快速搅拌，继续煮沸15min，直至溶液变成深红色，冷却至室温并继续搅拌1h。将得到的尺寸为18nm的Au NPs溶液储存在4℃的冰箱中待用。
(3)修饰电极cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE的制备：
将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用，用微量进样器移1-3μL PTCA/CoP的DMF溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到PTCA/CoP/GCE修饰电极，然后滴加含有0.005mol/L NHS和0.01M EDC的0.01mol/L的PBS(pH 7.5)溶液1-3μL，滴加后反应0.5-1.5h；接着滴加3μL浓度为1-3μmol/L的适配体apt并反应1-5h；再滴加1-3μL Au NPs反应1-5h，最后滴加1-3.0μL浓度为1-3μmol/L的cDNA反应1-3h，烘箱烘干成膜，得到cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE。将cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE修饰电极在4℃的冰箱中放置6h，即得到ECL传感器。
c DNA核苷酸序列为:
5'-TAA-CGT-TGC-ACC-GCC-AGT-CAG-TCG-CCC-ACC-ACC-CAA-GCC-AGG-TCT-3'；
apt序列为:
5'-NH2-(CH2)6-TCT-AAC-GTG-AAT-GAT-AGA-CCT-GGC-TTG-GGT-GGT-GGG-CGA-CTG-ACT-GGC-GGT-GCA-ACG-TTA-ACT-TAT-TCG-ACC-ATA-SH-3'。
上述适配体和cDNA均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
(4)含过硫酸钾(K2S2O8)的磷酸盐(PB)缓冲溶液的配制：
用pH 7.5的0.1mol/L PB缓冲溶液配制含0.01mol/L K2S2O8的PB缓冲溶液。
(5)不同浓度双氯酚酸标准溶液的配制
准确称取双氯酚酸，用去离子水配制成浓度1.0×10-4mol/L的双氯酚酸溶液，再稀释得到一系列不同浓度的双氯酚酸标准溶液，浓度范围为1.0×10-5mol/L-1.0×10-13mol/L。
(6)标准曲线的绘制
将修饰电极cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于上述含一系列不同浓度双氯酚酸溶液中浸泡40min，在-1.8-0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线(E-ECL)，建立加入双氯酚酸前后的发光强度差值与双氯酚酸浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；
(7)样品检测
实际样品先经过前处理，按照与上述步骤(6)同样的电化学发光测试条件进行测试，记录发光强度，所得发光强度，用步骤(6)所得标准曲线所对应的线性回归方程计算出待测样品中双氯酚酸的浓度。
本发明的显著优点是开发了一种检测双氯酚酸的电化学发光传感器及其制备方法，与普通的电化学发光传感器相比，具有以下显著优点：
CoP与PTCA结合形成了一种新型1D-2D结构的纳米材料；Au NPs作为等离子共振体极大地增强了PTCA/CoP的电化学发光信号；利用双氯酚酸对等离子共振系统的抑制作用来灵敏检测双氯酚酸。
本发明基于PTCA/CoP与Au NPs之间存在的等离子共振机制以及双氯酚酸对其机制的抑制作用，以cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE为工作电极，构建了定量检测实际水样中的双氯酚酸的电化学发光分析方法。由于PTCA/CoP(供体)的电化学发光发射光谱与AuNPs(受体)的紫外可见吸收光谱之间存在较大的重叠面积，并且通过采用DNA双螺旋结构来控制供体与受体之间的距离大于10nm，所以两者之间存在等离子共振机制。基于双氯酚酸对其机制的抑制作用，导致修饰电极的荧光减弱，并且减弱的光强与双氯酚酸的浓度具有线性关系。本发明不仅具有电化学发光分析的灵敏度高、特异性强、线性范围宽和仪器简单等优点，同时对于水样中的双氯酚酸的检测具有重要的现实意义。
附图说明
图1是该发明中的传感器的制备以及对双氯酚酸的检测的流程图。
图2是CoP与PTCA的质量比对实验的影响，双氯酚酸浓度为0.1nmol/L。
图3是复合物PTCA/CoP的涂滴量对实验的影响，双氯酚酸浓度为0.1nmol/L。
图4是加入双氯酚酸前后发光强度的差值和双氯酚酸浓度对数的标准曲线。
图5是CoP(A)、PTCA(B)、PTCA/CoP(C)的扫描电镜图和Au NPs(D)的透射电镜图。
具体实施方式
本发明下面结合实施例作进一步详述。
实施例1
(1)PTCA/CoP复合材料的制备：
将0.1g苝四羧酸二酐(PTCDA)溶于10mL 0.1M NaOH中，在80℃下搅拌2h，得到黄绿色溶液后，滴入1.0M HCl直至完全沉淀，离心并用去离子水洗涤三次，60℃干燥得到暗红色粉末，即PTCA。
将Co(NO3)2·6H2O(2.3282g)、Na2HPO4(1.1357g)、尿素(1.9219g)溶解在40mL的去离子水中，并超声4h，待溶液混合均匀后，再加入90mL的乙二醇溶液并超声2h。最后以10000rpm离心10min，并且用乙醇、去离子水洗涤两次，得到紫色粉末CoP。
将1mg CoP加入1mL含1mg/mL PTCA的DMF溶液中并且超声2h，得到淡红色溶液PTCA/CoP。
(2)Au NPs的制备：
将4mL的1％的柠檬酸三钠加入100mL沸腾的0.01％HAuCl4中，并快速搅拌，继续煮沸15min，直至溶液变成深红色，冷却至室温并继续搅拌1h。将得到的尺寸为18nm的Au NPs溶液储存在4℃的冰箱中待用。
(3)修饰电极cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE的制备：
将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用，用微量进样器移3.0μL PTCA/CoP的DMF溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到PTCA/CoP/GCE修饰电极；然后滴加含有0.005mol/L NHS和0.01M EDC的0.01mol/L的PBS(pH 7.5)溶液3μL，滴加后反应1.5h；接着，将3.0μL 2.0μmol/L的apt滴加到PTCA/CoP/GCE的表面反应3h，得到apt/PTCA/CoP/GCE；然后将3.0μL Au NPs溶液滴加到apt/PTCA/CoP/GCE反应2小时，得到Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE修饰电极，再将3.0μL 2.0μmol/L的cDNA滴加到Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE的表面反应3小时，得到cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE修饰电极。最后，将cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE修饰电极在4℃的冰箱中放置6h，即得到ECL传感器。
其中，c DNA核苷酸序列为:
5'-TAA-CGT-TGC-ACC-GCC-AGT-CAG-TCG-CCC-ACC-ACC-CAA-GCC-AGG-TCT-3'；
apt序列为:
5'-NH2-(CH2)6-TCT-AAC-GTG-AAT-GAT-AGA-CCT-GGC-TTG-GGT-GGT-GGG-CGA-CTG-ACT-GGC-GGT-GCA-ACG-TTA-ACT-TAT-TCG-ACC-ATA-SH-3'。
(4)标准曲线的绘制
将修饰电极cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于上述含一系列不同浓度双氯酚酸的标准溶液中浸泡40min，并以含有0.01mol/L的K2S2O8的pH＝7.5的0.1mol/L PB缓冲液作为空白溶液检测发光强度。
将三电极体系置于一系列双氯酚酸浓度(1.0×10-5mol/L、1.0×10-6mol/L、1.0×10-7mol/L、1.0×10-8mol/L、1.0×10-9mol/L、1.0×10-10mol/L、1.0×10-11mol/L、1.0×10- 12mol/L、1.0×10-13mol/L)含有0.01mol/L的K2S2O8的pH 7.5的0.1mol/L PB的缓冲溶液中，在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，放大倍数为3，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线(E-ECL)，建立加入双氯酚酸前后的发光强度差值与双氯酚酸浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程为：ΔIECL＝27191.14+1940.99Log C(mol/L)，相关系数(R2)为0.998。线性回归方程的检测范围为1.0×10-5～1.0×10-13mol/L，最低检测限为7.2×10-14mol/L。
(5)样品的检测
取一定量处理后的湖水加入到含有0.01mol/L的K2S2O8的pH 7.5的0.1mol/L PB的缓冲溶液中，用于电化学发光检测，按上述步骤(2)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中双氯酚酸的浓度，其结果列于表1中。
从图5中可看PTCA呈一维纳米棒状，CoP呈二维纳米片状结构。
实施例2
PTCA/CoP复合材料的制备过程中CoP和PTCA的质量比改为2：1，其他同实施例1。
实施例3
PTCA/CoP复合材料的制备过程中CoP和PTCA的质量比改为3：1，其他同实施例1。
实施例4
PTCA/CoP复合材料的涂滴量改为1.0μL，其他同实施例1。其涂滴量为1.0μL时，很难覆盖整个电极表面，导致后面滴涂的其他物质会掉落，从而只能检测到较大浓度的双氯芬酸。
实施例5
PTCA/CoP复合材料的涂滴量改为2.0μL，其他同实施例1。
比较例1：
(1)PTCA/CoP/GCE修饰电极的制备
将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用微量进样器移取3.0μL 1.0mg/mL PTCA/CoP材料的DMF溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到PTCA/CoP/GCE修饰电极，作为电化学发光测试的工作电极。
(2)标准曲线的绘制
以PTCA/CoP/GCE修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，并以含有0.01mol/L的K2S2O8的pH＝7.5的0.1mol/L PB缓冲液为空白溶液检测发光强度，将三电极体系置于一系列双氯酚酸浓度(1.0×10-5mol/L、1.0×10- 6mol/L、1.0×10-7mol/L、1.0×10-8mol/L、1.0×10-9mol/L、1.0×10-10mol/L、1.0×10- 11mol/L、1.0×10-12mol/L、1.0×10-13mol/L)的标准溶液中浸泡40min，在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，放大级数为3，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录E-ECL曲线，建立加入双氯酚酸前后的发光强度差值与双氯酚酸浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
(3)样品的检测
取一定量处理后的湖水加入到含有0.01mol/L的K2S2O8的pH 7.5的0.1mol/L PB缓冲溶液中，用于电化学发光检测，按上述步骤(2)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中双氯酚酸的浓度，其结果列于表1中。
比较例2：
(1)Au NPs/GCE修饰电极的制备
将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用微量进样器移取3.0μL Au NPs滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到Au NPs/GCE修饰电极，作为电化学发光测试的工作电极。
(2)标准曲线的绘制
以Au NPs/GCE修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，并以含有0.01mol/L的K2S2O8的pH＝7.5的0.1mol/L PB缓冲液为空白溶液检测发光强度，将三电极体系置于一系列双氯酚酸浓度(1.0×10-5mol/L、1.0×10- 6mol/L、1.0×10-7mol/L、1.0×10-8mol/L、1.0×10-9mol/L、1.0×10-10mol/L、1.0×10- 11mol/L、1.0×10-12mol/L、1.0×10-13mol/L)的标准溶液中浸泡40min，在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，放大级数为3，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录E-ECL曲线，建立加入双氯酚酸前后的发光强度差值与双氯酚酸浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
(3)样品的检测
取一定量处理后的湖水加入到含有0.01mol/L的K2S2O8的pH 7.5的0.1mol/L PB缓冲溶液中，用于电化学发光检测，按上述步骤(2)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中双氯酚酸的浓度，其结果列于表1中。
对照例3
(1)PTCA/Ag3PO4的制备方法
将0.1g苝四羧酸二酐(PTCDA)溶于10mL 0.1M NaOH中，在80℃下搅拌2h，得到黄绿色溶液后，滴入1.0M HCl直至完全沉淀，离心并用去离子水洗涤三次，60℃干燥得到暗红色粉末，即PTCA。
称取2.5481g AgNO3溶于25mL的去离子水中，并称取1.7907g Na2HPO4溶于25mL的去离子水中，然后将Na2HPO4溶逐滴加入到AgNO3溶液中，得到金黄色沉淀，反复用蒸馏水洗涤后，然后在60℃下干燥12h得到Ag3PO4。
将1mg Ag3PO4加入1mL含1mg/mL PTCA的DMF溶液中并且超声2h，得到棕色溶液PTCA/Ag3PO4。
(2)cDNA/Au NPs/apt/PTCA/Ag3PO4/GCE修饰电极的制备
具体制备方法参照实施例1，仅将PTCA/CoP换成PTCA/Ag3PO4。
标准曲线的绘制和样品的检测同实施例1。
对照例4
(1)修饰电极Au NPs/PTCA/CoP/GCE的制备：
将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用，用微量进样器移3.0μL 1.0mg/mL PTCA/CoP的DMF溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到PTCA/CoP/GCE修饰电极；接着，将3.0μL Au NPs溶液滴加到PTCA/CoP/GCE，得到AuNPs/PTCA/CoP/GCE修饰电极。
标准曲线的绘制和样品的检测同实施例1。当不加适配体时，PTCA/CoP和Au NPs两者直接接触，它们之间会产生共振能量转移，使得基础光强变得很小，从而无法检测到较低浓度得双氯芬酸。
对照例5
(1)修饰电极Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE的制备：
将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用，用微量进样器移3.0μL 1.0mg/mL PTCA/CoP的DMF溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到PTCA/CoP/GCE修饰电极；接着，将3.0μL 2.0μmol/L的apt滴加到PTCA/CoP/GCE的表面，得到apt/PTCA/CoP/GCE；然后将3.0μL Au NPs溶液滴加到apt/PTCA/CoP/GCE，得到Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE修饰电极。最后，将Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE修饰电极在4℃的冰箱中放置6h，即得到ECL传感器。
标准曲线的绘制和样品的检测同实施例1。
表1水样中双氯酚酸的测定结果
Figure BDA0002843132530000111
Figure BDA0002843132530000121
/>
如表1所示，样品平行检测3次，相对标准偏差小于5％，加标回收率范围为96％-102％。
改变CoP和PTCA的质量比或PTCA/CoP的涂滴量，发现均无法检测到低浓度的双氯酚酸，这说明CoP和PTCA的最优质量比应选为1：1，且最优涂滴量为3.0μL.当不用cDNA/AuNPs/apt/PTCA/CoP复合材料修饰而单独用PTCA/CoP，AuNPs，PTCA/Ag3PO4或是Au NPs/PTCA/CoP修饰的玻碳电极无法检测双氯酚酸；而用Au NPs/apt/PTCA/CoP修饰的玻碳电极对样品进行检测时，相对标准偏差大于20％，并且回收率也不高。说明本发明用于检测湖水中的双氯酚酸是可行的。
以上实施例仅用于本发明说明使用，并非对本发明的限制，有关领域的技术人员可在不脱离本发明的范围内，还可以作出相应的各种变化，因此所有等同替换或等效变型的方式形成的技术方案均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于金纳米粒子的等离子共振增强型电化学发光传感器，其特征在于，所述传感器用于检测双氯酚酸；
所述基于金纳米粒子的等离子共振增强型电化学发光传感器的制备方法步骤如下：
（1）PTCA/CoP复合材料的制备：
将苝四羧酸二酐PTCDA溶于NaOH中搅拌得到黄绿色溶液，滴入HCl直至完全沉淀，离心并用去离子水洗涤三次，干燥得到苝四羧酸PTCA暗红色粉末；
将Co(NO3)2•6H2O、Na2HPO4、尿素溶解在去离子水中并超声，待溶液混合均匀后，加入乙二醇溶液并超声，最后离心，并用乙醇、去离子水洗涤两次，得到紫色粉末CoP；
取CoP加入含苝四羧酸PTCA的DMF溶液中并且超声处理，得到淡红色溶液PTCA/CoP；
所述PTCA的DMF溶液的浓度为1 mg/mL；CoP和PTCA的质量比为1：1-3：1；
（2）Au NPs的制备：
将柠檬酸三钠加入沸腾的HAuCl4中，并快速搅拌，继续煮沸直至溶液变成深红色，冷却至室温并继续搅拌，得到Au NPs溶液，然后将其储存在4℃的冰箱中待用；
（3）电化学发光传感器cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE的制备：
将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用，用微量进样器移PTCA/CoP的DMF溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到PTCA/CoP/GCE修饰电极；然后滴加含有NHS和EDC的PBS溶液，并在室温下反应后，将apt、Au NPs和cDNA依次滴加到PTCA/CoP/GCE的表面，得到cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE，最后，将cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE修饰电极在4℃的冰箱中放置，得到ECL传感器。
2.根据权利要求1所述的基于金纳米粒子的等离子共振增强型电化学发光传感器，其特征在于，步骤（2）所述Au NPs尺寸为18 nm。
3.根据权利要求1所述的基于金纳米粒子的等离子共振增强型电化学发光传感器，其特征在于，步骤（3）所述cDNA核苷酸序列为: 5'-TAA-CGT-TGC-ACC-GCC-AGT-CAG-TCG-CCC-ACC-ACC-CAA-GCC-AGG-TCT-3'；
apt序列为: 5'-NH2-(CH2)6-TCT-AAC-GTG-AAT-GAT-AGA-CCT-GGC-TTG-GGT-GGT-GGG-CGA-CTG-ACT-GGC-GGT-GCA-ACG-TTA-ACT-TAT-TCG-ACC-ATA-SH-3'。
4.根据权利要求1所述的基于金纳米粒子的等离子共振增强型电化学发光传感器，其特征在于，步骤（3）所述CoP/PTCA的DMF溶液的涂滴量为1-3 μL；含有NHS和EDC的PBS溶液的涂滴量为1-3 μL，滴加后反应0.5-1.5 h；apt的浓度为1-3 μmol/L，涂滴量为3.0 μL；AuNPs涂滴量为1-3 μL；cDNA的浓度为1-3 μmol/L，涂滴量为1-3 μL；apt和cDNA的反应时间分别为1-5 h、1-3 h。
5.根据权利要求1所述的基于金纳米粒子的等离子共振增强型电化学发光传感器，其特征在于，检测方法为：以cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE作为电化学发光测试的工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系进行电化学发光检测双氯酚酸。
6.根据权利要求5所述的基于金纳米粒子的等离子共振增强型电化学发光传感器，其特征在于，所述方法具体步骤如下：
（1）含过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液的配制；
（2）含不同浓度双氯酚酸标准溶液的配制；
准确称取双氯酚酸，用去离子水配制1.0×10-4 mol/L溶液，制备一系列不同浓度的双氯酚酸标准溶液，浓度范围为1.0×10-5 mol/L-1.0×10-13 mol/L；
（3）标准曲线的绘制
将修饰电极cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于上述一系列不同浓度的双氯酚酸标准溶液中浸泡，并以含过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液作为空白溶液检测发光强度；
在-1.8-0 V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800 V，放大级数为3，扫速0.1 V/s，进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线，建立加入双氯酚酸前后的发光强度差值与双氯酚酸浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；
（4）实际样品检测
实际样品检测先作前处理再调节pH，按照上述步骤(3)中的线性回归方程进行计算。
7.根据权利要求6所述的基于金纳米粒子的等离子共振增强型电化学发光传感器，其特征在于，步骤（1）所述的磷酸盐缓冲溶液含0.01 mol/L过硫酸钾，磷酸盐缓冲溶液的pH为7.5，其浓度为0.1 mol/L。
8.根据权利要求6所述的基于金纳米粒子的等离子共振增强型电化学发光传感器，其特征在于，步骤（3）所述修饰电极cDNA/Au NPs/apt/PTCA/CoP/GCE浸泡时间为40 min。
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