CN111208178A - 一种基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号构建电化学发光传感器的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号构建电化学发光传感器的方法。在本发明中，苝四羧酸PTCA作为发光体负载在ZIF‑67上形成PTCA@ZIF‑67作为信号探针。其中，ZIF‑67作为增强剂可催化S₂O₈ ^2‑生成更多的SO₄ ^•‑，从而实现信号的双重放大。此外，本发明还引进了七肽HGC用以固定抗体，既维持了传感器的生物活性，又提高了抗体的孵化效率，从而极大地提高了构建传感器的灵敏度。不同浓度的β‑淀粉样蛋白Aβ可结合不同量的二抗标记物Ab₂‑Au‑PTCA@ZIF‑67，进而引起传感器发光强度的变化，实现对Aβ的超灵敏检测。

Description

一种基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号构建电 化学发光传感器的方法

技术领域

本发明设计了一种基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号构建电化学发光传感器的方法，具体以PTCA为发光体，ZIF-67为增强剂，制备一种检测Aβ的双重信号放大的电化学发光传感器，属于电化学发光检测技术领域。

背景技术

阿尔茨海默氏病是一种进行性神经肌肉萎缩症，最初的特点是学习和记忆障碍，最终将导致认知能力的丧失。此外，它是老年痴呆的最常见病因。遗传研究表明，Aβ在阿尔茨海默氏病的发展中起到关键作用，其可以作为监测和诊断阿尔茨海默氏病的重要指标。迄今为止，仅报道了几种定量检测Aβ的分析方法，例如化学发光免疫分析，表面等离子体共振和荧光分析。因此，开发快速而高效的方法实现Aβ的超灵敏测定变得尤为重要。

电化学发光ECL是发光体由激发态向基态跃迁产生的发光过程，现已成为各个领域中最重要的电化学检测手段之一。目前为止，ECL由于其灵敏度高，线性范围宽，反应迅速且可控性强等优势而受到了广泛的关注，已发展成为分析化学的一门重要分支学科。PTCA是一种具有大量羧基的多环芳烃，因其在S₂O₈ ^2-溶液中稳定的ECL发射而在ECL研究中具有广泛应用。此外，PTCA具有高的比表面积和优异的导电性，表明它可以作为发光体构建传感平台。然而，PTCA本身无法产生足够的ECL发射以满足痕量分析的需求，这促使我们找到一种有效的增强剂来改善其ECL信号。

MOFs材料由金属离子和有机配体组成，其具有多金属位点，多孔结构和高比表面积等优异的化学和物理性能，具体而言，多金属位点是提高其催化性能的关键，同时多孔结构可以充分利用这些原子分散的金属位点。因此，MOFs由于其优异的催化活性而在催化领域具有广泛的应用。ZIF-67具有大量原子分散的Co²⁺和高比表面积，不仅可以起到增强剂的作用实现S₂O₈ ^2-的高效催化，而且能结合更多的PTCA，从而大大增强了ECL信号。本发明采用PTCA为发光体获得了稳定的ECL信号，采用ZIF-67为增强剂，其可催化S₂O₈ ^2-生成更多的SO₄ ^•-，从而大大提高了PTCA的ECL排放，实现了信号的双重放大。

发明内容

本发明目的之一是合成发光信号稳定的发光体和催化性能优异的增强剂。

本发明目的之二是构建基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号的电化学发光传感器。

本发明目的之三是通过构建的电化学发光传感器实现对Aβ的高灵敏检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1. 将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃泥浆抛光得到镜状表面，并用超纯水冲洗干净；将处理好的电极浸入质量分数为1 %的HAuCl₄溶液中，在-0.2 V的恒定电压下电沉积一层AuNPs，沉积时间为30 s；将沉积完毕的电极浸入50 ng/mL的HGC溶液中2 h，利用金硫键结合一定量的HGC；将8 μL 5 μg/mL的Ab₁滴涂于电极表面，在4 ^oC下进行孵化；将3 μL质量分数为1 %的BSA滴涂于电极表面，以封闭Ab₁上非特异性活性位点；将5 μL不同浓度的Aβ滴涂于电极表面，4 ^oC下孵化1 h；将8 µL 4-6 μg/mL的Ab₂-Au-PTCA@ZIF-67溶液滴涂于电极表面，4 ^oC下孵化2 h，实现了基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号的电化学发光传感器的构建；如上所述传感器构建过程中，每一步都需将所得修饰后电极用超纯水轻轻冲洗，以去除未结合的生物分子；本发明采用PTCA作为发光体，得到了稳定的发光信号；采用ZIF-67作为增强剂，利用其优异的催化活性催化S₂O₈ ^2-生成了更多的SO₄ ^•-，实现了信号的双重放大；传感器制备过程中首先电沉积一层AuNPs，促进了电子转移，既可以增强发光效率，又可以更好的吸附HGC；HGC的引入实现了抗体的定向固定，不仅维持了构建传感器的生物活性，还提升了抗体的孵化效率，从而进一步提高了传感器的灵敏度；将PTCA固载在ZIF-67上作为二抗标记物，既可以负载更多发光体以增强发光信号，又能使传感器对目标物的浓度变化反应更加灵敏，从而实现对Aβ的高灵敏检测。

2. 将0.1 g PTCDA分散在50 mL的NaOH溶液中，搅拌至完全溶解；随后，将稀释后浓度为1 M的HCl溶液缓慢加入到上述溶液中，至其颜色从黄绿色变为红色为止；接下来，将上述混合溶液离心并用超纯水和乙醇交替洗涤，洗涤至其PH为7.4；最后，将获得的PTCA分散在超纯水中备用；本发明制备了PTCA作为发光体，其发光信号稳定，特有的多环芳烃结构既可以减少生物毒物，又可以增加疏水性；此外，PTCA还具有优异的导电性和成膜能力，表明它可以作为发光体构建传感平台；

将5 mM的Co(NO₃)₂和20 mM的2-甲基咪唑分别溶解在含有甲醇和乙醇的混合溶液中，其中甲醇和乙醇的体积比为1:1；随后，将上述得到的两种溶液混合，溶液颜色迅速变为紫色，混合完毕后，将所得混合物静置24 h；最后，通过离心和甲醇洗涤获得ZIF-67，并将其溶于超纯水中备用；本发明制备了ZIF-67作为增强剂，其具有大量原子分散的Co²⁺和高的比表面积，不仅可以实现S₂O₈ ^2-的高效催化，而且还能结合更多的PTCA，从而大大增强了ECL信号；具体反应如下：二价钴离子Co²⁺可与SO₄ ^2-反应生成大量的三价钴离子Co³⁺和SO₄ ^•-，同时生成的Co³⁺被H₂O氧化生成大量的羟基自由基OH^•,进一步催化SO₄ ^2-生成更多的SO₄ ^•-，从而实现了信号的双重放大。

3. 首先，将制得的ZIF-67溶于甲苯中，然后将1 mL APTES加入其中，超声处理50分钟；随后，将所得混合溶液转移至高温高压反应釜中，在90 ^oC下反应24 h，得到ZIF-67-NH₂；接下来，将2 mL包含40 mM的EDC和10 mM的NHS混合溶液加入5 mL制得的PTCA溶液中，在4 ^oC下反应1 h，然后与5 mL ZIF-67-NH₂溶液反应；随后，在磁力搅拌下将1 mL质量分数为1 %的HAuCl₄溶液和20 mg PVP加入其中，搅拌12 h后，加入4 mL 50 mM的柠檬酸钠溶液和微量NaBH₄，进一步搅拌12小时后，再将所得混合溶液离心洗涤去除未结合的AuNP，并将其溶于PH为7.4的PBS中；最后，将BSA和Ab₂依次加入上述溶液中，在4 ^oC下孵育12小时，即成功制备了Ab₂-Au-PTCA@ZIF-67；本发明通过酰胺反应将PTCA固载在ZIF-67上，合成了PTCA@ZIF-67作为信号探针；ZIF-67具有高的比表面积，可以负载更多的发光体，从而提高了发光效率；将Ab₂连接在PTCA@ZIF-67上，使传感器对Aβ的浓度变化反应更加灵敏，实现了对Aβ的高灵敏检测。

4. 将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、所构建传感器作为工作电极构建三电极体系；将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，并将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为-1.6-0 V，扫描速率设置为0.1 V/s；使用10-100 mmol/L的K₂S₂O₈溶液作为检测底液，利用三电极体系检测不同浓度Aβ下的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与Aβ浓度对数的线性关系绘制工作曲线；

所述K₂S₂O₈溶液，pH为6.5-8.5，利用10-100 mmol/L的K₂S₂O₈和100 mmol/L的KCl溶于0.1 M的PBS配制。

5. 在稀释的血清样品中加入不同浓度的Aβ，采用标准加入法测定血清样品中Aβ的相对标准偏差和平均回收率，所得血清样品中Aβ的相对标准偏差为1.01-1.25 %，回收率为99.6-101 %，表明本发明可应用于实际样品的检测，且结果准确可靠。

本发明的有益成果

1. 本发明合成了PTCA作为发光体，得到了稳定的ECL信号；合成了催化性能优异的ZIF-67，其作为增强剂催化S₂O₈ ^2-生成了更多的SO₄ ^•-，从而显著增强了PTCA的发光强度，满足了痕量分析的需求。

2. 本发明成功构建了基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号的电化学发光传感器。

3. 本发明通过构建的电化学发光传感器实现了对Aβ的超灵敏检测，检测结果具有优异的稳定性，选择性和重现性，线性范围为10 fg/mL-100 ng/mL，检测限为3.67 fg/mL。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述，本发明保护范围不仅局限于实施例，该领域专业人员对本发明技术方案所作的改变均属于本发明保护范围。

实施例1

将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃泥浆抛光得到镜状表面，并用超纯水冲洗干净；将处理好的电极浸入质量分数为1 %的HAuCl₄溶液中，在-0.2 V的恒定电压下电沉积一层AuNPs，沉积时间为30 s；将沉积完毕的电极浸入50 ng/mL的HGC溶液中2 h，利用金硫键结合一定量的HGC；将8 μL 5 μg/mL的Ab₁滴涂于电极表面，在4 ^oC下进行孵化；将3 μL质量分数为1 %的BSA滴涂于电极表面，以封闭Ab₁上非特异性活性位点；将5 μL不同浓度的Aβ滴涂于电极表面，4 ^oC下孵化1 h；将8 µL 4 μg/mL的Ab₂-Au-PTCA@ZIF-67溶液滴涂于电极表面，4 ^oC下孵化2 h，实现了基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号的电化学发光传感器的构建；如上所述传感器构建过程中，每一步都需将所得修饰后电极用超纯水轻轻冲洗，以去除未结合的生物分子。

实施例2

将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃泥浆抛光得到镜状表面，并用超纯水冲洗干净；将处理好的电极浸入质量分数为1 %的HAuCl₄溶液中，在-0.2 V的恒定电压下电沉积一层AuNPs，沉积时间为30 s；将沉积完毕的电极浸入50 ng/mL的HGC溶液中2 h，利用金硫键结合一定量的HGC；将8 μL 5 μg/mL的Ab₁滴涂于电极表面，在4 ^oC下进行孵化；将3 μL质量分数为1 %的BSA滴涂于电极表面，以封闭Ab₁上非特异性活性位点；将5 μL不同浓度的Aβ滴涂于电极表面，4 ^oC下孵化1 h；将8 µL 5 μg/mL的Ab₂-Au-PTCA@ZIF-67溶液滴涂于电极表面，4 ^oC下孵化2 h，实现了基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号的电化学发光传感器的构建；如上所述传感器构建过程中，每一步都需将所得修饰后电极用超纯水轻轻冲洗，以去除未结合的生物分子。

实施例3

将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃泥浆抛光得到镜状表面，并用超纯水冲洗干净；将处理好的电极浸入质量分数为1 %的HAuCl₄溶液中，在-0.2 V的恒定电压下电沉积一层AuNPs，沉积时间为30 s；将沉积完毕的电极浸入50 ng/mL的HGC溶液中2 h，利用金硫键结合一定量的HGC；将8 μL 5 μg/mL的Ab₁滴涂于电极表面，在4 ^oC下进行孵化；将3 μL质量分数为1 %的BSA滴涂于电极表面，以封闭Ab₁上非特异性活性位点；将5 μL不同浓度的Aβ滴涂于电极表面，4 ^oC下孵化1 h；将8 µL 6 μg/mL的Ab₂-Au-PTCA@ZIF-67溶液滴涂于电极表面，4 ^oC下孵化2 h，实现了基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号的电化学发光传感器的构建；如上所述传感器构建过程中，每一步都需将所得修饰后电极用超纯水轻轻冲洗，以去除未结合的生物分子。

实施例4

将0.1 g PTCDA分散在50 mL的NaOH溶液中，搅拌至完全溶解；随后，将稀释后浓度为1M的HCl溶液缓慢加入到上述溶液中，至其颜色从黄绿色变为红色为止；接下来，将上述混合溶液离心并用超纯水和乙醇交替洗涤，洗涤至其PH为7.4；最后，将获得的PTCA分散在超纯水中备用；将5 mM的Co(NO₃)₂和20 mM的2-甲基咪唑分别溶解在含有甲醇和乙醇的混合溶液中，其中甲醇和乙醇的体积比为1:1；随后，将上述得到的两种溶液混合，溶液颜色迅速变为紫色，混合完毕后，将所得混合物静置24 h；最后，通过离心和甲醇洗涤获得ZIF-67，并将其溶于超纯水中备用。

实施例5

首先，将制得的ZIF-67溶于甲苯中，然后将1 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES加入其中，

超声处理50分钟；随后，将所得混合溶液转移至高温高压反应釜中，在90 ^oC下反应24h，得到ZIF-67-NH₂；接下来，将2 mL包含40 mM的EDC和10 mM的NHS混合溶液加入5 mL制得的PTCA溶液中，在4 ^oC下反应1 h，然后与5 mL ZIF-67-NH₂溶液反应；随后，在磁力搅拌下将1 mL质量分数为1 %的HAuCl₄溶液和20 mg聚乙烯吡咯烷酮PVP加入其中，搅拌12 h后，加入4 mL 50 mM的柠檬酸钠溶液和微量硼氢化钠NaBH₄，进一步搅拌12小时后，再将所得混合溶液离心洗涤去除未结合的AuNP，并将其溶于PH为7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS中；最后，将BSA和Ab₂依次加入上述溶液中，在4 ^oC下孵育12小时，即成功制备了Ab₂-Au-PTCA@ZIF-67。

实施例6

将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、所构建传感器作为工作电极构建三电极体系；将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，并将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为-1.6-0V，扫描速率设置为0.1 V/s；使用10 mmol/L的过硫酸钾K₂S₂O₈溶液作为检测底液，利用三电极体系检测不同浓度Aβ下的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与Aβ浓度对数的线性关系绘制工作曲线；所述K₂S₂O₈溶液，pH为6.5，利用10 mmol/L的K₂S₂O₈和100mmol/L的KCl溶于0.1 M的PBS配制。

实施例7

将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、所构建传感器作为工作电极构建三电极体系；将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，并将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为-1.6-0V，扫描速率设置为0.1 V/s；使用50 mmol/L的过硫酸钾K₂S₂O₈溶液作为检测底液，利用三电极体系检测不同浓度Aβ下的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与Aβ浓度对数的线性关系绘制工作曲线；所述K₂S₂O₈溶液，pH为7.4，利用50 mmol/L的K₂S₂O₈和100mmol/L的KCl溶于0.1 M的PBS配制。

实施例8

将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、所构建传感器作为工作电极构建三电极体系；将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，并将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为-1.6-0V，扫描速率设置为0.1 V/s；使用100 mmol/L的过硫酸钾K₂S₂O₈溶液作为检测底液，利用三电极体系检测不同浓度Aβ下的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与Aβ浓度对数的线性关系绘制工作曲线；所述K₂S₂O₈溶液，pH为8.5，利用100 mmol/L的K₂S₂O₈和100 mmol/L的KCl溶于0.1 M的PBS配制。

实施例9

在稀释的血清样品中加入不同浓度的Aβ，采用标准加入法测定血清样品中Aβ的相对标准偏差和平均回收率，所得血清样品中Aβ的相对标准偏差为1.01-1.25 %，回收率为99.6-101 %，表明本发明可应用于实际样品的检测，且结果准确可靠。

Claims (5)

1.一种基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号构建电化学发光传感器的方法，其特征在于：

将直径为4 mm的玻碳电极用三氧化二铝Al₂O₃泥浆抛光得到镜状表面，并用超纯水冲洗干净；将处理好的电极浸入质量分数为1 %的氯金酸HAuCl₄溶液中，在-0.2 V的恒定电压下电沉积一层金纳米粒子AuNPs，沉积时间为30 s；将沉积完毕的电极浸入50 ng/mL的HGC溶液中2 h，利用金硫键结合一定量的HGC；将8 μL 5 μg/mL的一抗Ab₁滴涂于电极表面，在4 ^oC下进行孵化；将3 μL质量分数为1 %的牛血清白蛋白BSA滴涂于电极表面，以封闭Ab₁上非特异性活性位点；将5 μL不同浓度的Aβ滴涂于电极表面，4 ^oC下孵化1 h；将8 µL 4-6 μg/mL的Ab₂-Au-PTCA@ZIF-67溶液滴涂于电极表面，4 ^oC下孵化2 h，实现了基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号的电化学发光传感器的构建；

如上所述传感器构建过程中，每一步都需将所得修饰后电极用超纯水轻轻冲洗，以去除未结合的生物分子。

2.一种基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号构建电化学发光传感器的方法，有关苝四羧酸和钴基金属有机框架物的制备，其特征在于，步骤如下：

将0.1 g苝四羧酸二酐PTCDA分散在50 mL的氢氧化钠NaOH溶液中，搅拌至完全溶解；随后，将稀释后浓度为1 M的盐酸HCl溶液缓慢加入到上述溶液中，至其颜色从黄绿色变为红色为止；接下来，将上述混合溶液离心并用超纯水和乙醇交替洗涤，洗涤至其PH为7.4；最后，将获得的PTCA分散在超纯水中备用；

将5 mM的硝酸钴Co(NO₃)₂和20 mM的2-甲基咪唑分别溶解在含有甲醇和乙醇的混合溶液中，其中甲醇和乙醇的体积比为1:1；随后，将上述得到的两种溶液混合，溶液颜色迅速变为紫色，混合完毕后，将所得混合物静置24 h；最后，通过离心和甲醇洗涤获得ZIF-67，并将其溶于超纯水中备用。

3.如权利要求1所述的一种基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号构建电化学发光传感器的方法，所述Ab₂-Au-PTCA@ZIF-67的制备，其特征在于，步骤如下：

首先，将制得的ZIF-67溶于甲苯中，然后将1 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES加入其中，

超声处理50分钟；随后，将所得混合溶液转移至高温高压反应釜中，在90 ^oC下反应24h，得到ZIF-67-NH₂；接下来，将2 mL包含40 mM的EDC和10 mM的NHS混合溶液加入5 mL制得的PTCA溶液中，在4 ^oC下反应1 h，然后与5 mL ZIF-67-NH₂溶液反应；随后，在磁力搅拌下将1 mL质量分数为1 %的HAuCl₄溶液和20 mg聚乙烯吡咯烷酮PVP加入其中，搅拌12 h后，加入4 mL 50 mM的柠檬酸钠溶液和微量硼氢化钠NaBH₄，进一步搅拌12小时后，再将所得混合溶液离心洗涤去除未结合的AuNP，并将其溶于PH为7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS中；最后，将BSA和Ab₂依次加入上述溶液中，在4 ^oC下孵育12小时，即成功制备了Ab₂-Au-PTCA@ZIF-67。

4.如权利要求1所述的一种基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号构建电化学发光传感器的方法，所述Aβ的检测，其特征在于：

将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、所构建传感器作为工作电极构建三电极体系；将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，并将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为-1.6-0V，扫描速率设置为0.1 V/s；使用10-100 mmol/L的过硫酸钾K₂S₂O₈溶液作为检测底液，利用三电极体系检测不同浓度Aβ下的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与Aβ浓度对数的线性关系绘制工作曲线；

所述K₂S₂O₈溶液，pH为6.5-8.5，利用10-100 mmol/L的K₂S₂O₈和100 mmol/L的KCl溶于0.1 M的PBS配制。

5.如权利要求1所述的一种基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号构建电化学发光传感器的方法，在血清样本中对Aβ的检测，其特征在于：

在稀释的血清样品中加入不同浓度的Aβ，采用标准加入法测定血清样品中Aβ的相对标准偏差和平均回收率，所得血清样品中Aβ的相对标准偏差为1.01-1.25 %，回收率为99.6-101 %，表明本发明可应用于实际样品的检测，且结果准确可靠。