CN113960143B - 一种基于ecl共反应剂加速剂的传感平台及制备方法和应用 - Google Patents

一种基于ecl共反应剂加速剂的传感平台及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及纳米功能材料、传感器领域，具体涉及一种基于ECL共反应剂加速剂的传感平台及制备方法和应用，包括以下步骤：S1.制备三维中空的SnS2，计为3D H‑SnS2；S2.将步骤S1得到的3D H‑SnS2与APTES、PTCA反应得到3D H‑SnS2‑APTES‑PTCA；S3.用步骤S2得到的3D H‑SnS2‑APTES‑PTCA修饰电极，得到3D H‑SnS2‑APTES‑PTCA修饰电极，即得。本发明获得的传感平台可以策略性地提高了获得的电化学发光传感器的灵敏性，可以应用到食品领域、医药等领域，实现对蛋白、大肠杆菌、重金属的超灵敏检测。

Description

一种基于ECL共反应剂加速剂的传感平台及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米功能材料、传感器领域，具体涉及一种基于ECL共反应剂加速剂的传感平台及制备方法和应用。
背景技术
电化学发光(ECL)是结合电化学与化学发光的灵敏分析技术，因其操作简单、灵敏度高、本底信号低而受到人们的广泛关注。到目前为止，为了提高ECL的检测性能，已经实施了一些信号放大策略，包括基于纳米材料的放大、酶信号放大、表面等离子体共振效应放大、以及核酸扩增信号放大等。然而，酶信号放大需要标记在生物识别元件的表面上，并需要充分考虑酶的活性问题。核酸扩增策略通常不仅需要标记识别单元，还涉及极其复杂的DNA或RNA转化，导致其费用的增加。表面等离子体共振放大则需要精确控制等离子体核材料和发光材料之间的距离，这在ECL系统中更为困难。考虑到上述问题，基于纳米材料的放大策略仍然很有前景，纳米材料因其具有大表面积、小尺寸效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等。
通常，纳米材料可分为零维(0D)、一维(1D)、二维(2D)和三维(3D)材料，其相应形状分别为球形、线性、平面和块状。据报道，与其他纳米材料相比，2D纳米材料有许多独特的进展，例如电子限制效应、大的横向尺寸和表面原子的高暴露。然而，2D材料也暴露了其自身固有的缺点，即活性的降低归因于聚集体的形成和与纳米结构相关的高表面能导致的结构坍塌。而三维分层纳米结构材料特殊的形貌和结构稳定性，可以解决二维纳米片的缺点，充分的发挥二维纳米材料的优势，展现三维材料的独特性能，如高比表面积、高孔隙率、，出色的骨骼稳定性等。此外，空心材料还广泛应用于光催化、锂离子电池、光电传感器或其他领域，因为其具有较高的光捕获效率、丰富的内表面积和空腔以及可调的扩散率。因此，进一步合成中空结构可以有效利用内表面积，使材料的性能进一步提高。
根据文献，SnS2纳米片作为一种典型的具有CdI2结构的2D材料，由于其无毒性，已广泛应用于光电探测器、光催化、气体传感、生物传感器、太阳能电池、阳极材料等领域，特点是其环境友好、化学状态稳定和地球储量丰富。现有技术中，合成三维SnS2纳米材料无法维持三维立体结构。而且，没有在电化学发光领域中的应用。
发明内容
本发明的目的在于，克服现有技术中的问题，提供一种基于ECL共反应剂加速剂的传感平台及制备方法和应用，实现对电化学发光信号的放大。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种基于ECL共反应剂加速剂的传感平台的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备三维中空的SnS2，计为3D H-SnS2；
S2.将步骤S1得到的3D H-SnS2与(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、3,4,9,10-苝四羧酸(PTCA)反应得到3D H-SnS2-APTES-PTCA；
S3.用步骤S2得到的3D H-SnS2-APTES-PTCA修饰电极，得到3D H-SnS2-APTES-PTCA修饰电极，即得。
优选地，所述步骤S1中的3D H-SnS2的制备包括：
S11.制备实心的ZnSn(OH)6分散液；
S12.在步骤S11得到的实心ZnSn(OH)6分散液中，缓慢加入浓度为1.5～2.5mol/L的NaOH溶液，然后搅拌5～8min后离心保留沉淀物；其中，NaOH溶液的体积为所述分散液体积的1/3～1/2；NaOH溶液的加入速度为4.5～5.5mL/min；
S13.将步骤S12得到的沉淀物洗涤以后，在50～70℃温度下真空干燥10～15h，得到H-ZnSn(OH)6；
S14.将步骤S13得到的H-ZnSn(OH)6与乙二胺四乙酸、硫代乙酸铵按照摩尔比为1:(3～5):(4～6)混合溶于水得到总浓度为0.1～0.2mol/L混合溶液，然后搅拌8～14min，再以180～220℃温度加热2～4h，冷却后洗涤，再在50～65℃温度下干燥，即得。
优选地，所述步骤S3中，通过底涂的方式将3D H-SnS2-APTES-PTCA修饰在电极表面。
所述基于ECL共反应剂加速剂的传感平台的制备方法所制备得到的传感平台。
所述传感平台在制备生物传感器中的应用，包括以下步骤：
S41.将物质A修饰在所述传感平台上；
S42.配置系列浓度的物质B溶液，所述物质B能够与物质A特异性结合；
S43.将不同浓度的物质B溶液滴加在步骤S41处理之后的传感平台上，然后在电化学发光测试体系中测试电化学发光强度，并绘制标准曲线；
S44.将含有物质B的待测样品滴加在步骤S41处理之后的传感平台上，测试得到电化学发光强度，并通过步骤S43得到的标准曲线计算出样品中抗原的浓度。
优选地，所述物质A为心肌肌钙蛋白抗体，物质B为心肌肌钙蛋白抗原；或物质A为戊二醛，物质B为林可霉素；或物质A、物质B为互补的DNA序列；或物质A为富含T碱基的核酸；物质B为Hg2+。
优选地，步骤S41中物质A通过金纳米或壳聚糖修饰在所述传感平台上。
优选地，所述金纳米通过电化学沉淀的方法修饰在传感平台上。
优选地，当物质A、物质B为互补的核酸序列时，物质A的序列为：5’-NH2-(CH2)6-GAGCGG CGC AAC ATT TCA GGT CGA-3’；物质B的序列为：5’-TCG ACC TGA AAT GTT GCG CCGCTC-3’。上述互补序列为大肠杆菌互补的核酸序列片段，实现对大肠杆菌的检测。
优选地，所述物质A为富含T碱基的核酸时的序列为：：5'-SH-(CH2)6-TCT TTC TTCTTT CTT CCCCCC TTG TTT GTT GTT TGT-3'。上述富含T碱基的核酸序列可以和Hg2+形成特异性T-Hg2+-T的结合，从而实现对Hg2+的检测。
所述步骤S1中3D H-SnS2具体为：
氢氧化钠溶液在低浓度时，作为Zn2+和Sn2+的共沉淀剂，使得ZnSn(OH)6结晶成立方体形状的六面体，接着，较高浓度的氢氧化钠溶液继续加入时，打破原有的沉淀平衡，并且内核比表面的溶蚀速率快，最终形成中空的棱角变得稍微光滑的H-ZnSn(OH)6固体。接着我们进行一步化水热反应，具体在水溶液中同时加入H-ZnSn(OH)6、乙二胺四乙酸和硫代乙酰胺固体，置于高温高压反应釜中，在高温时，乙二胺四乙酸同时络合Zn2+和Sn2+，但是Zn2+的络合物比Sn2+的络合物更易溶于水，此时此刻，在结构中就被去除了Zn2+，同时在硫代乙酰胺(TAA)的作用下完成硫化过程，这样，原来的立方体形状的六面体就转变成了像插片一样的SnS2堆积起来的结构，整体还能维持原先中空六面体结构，只是体积稍微变大，最终得到我们所述的共反应剂加速剂3D H-SnS2。
步骤S2中，进一步将制得的共反应剂加速剂3D H-SnS2，首先做氨基化处理，采用(3-氨丙基)三乙氧基硅烷在乙醇与水溶液的作用下，发生水解，从而在3D H-SnS2表面，形成一个包裹氨基的结构，接着将我们有效的发射剂3,4,9,10-苝四羧酸(PTCA)先进行活化，之后通过酰胺反应连接在上述共反应剂加速剂3D H-SnS2的表面，形成一个以共反应剂加速剂三维中空硫化锡为基底的功能化复合物3D H-SnS2-APTES-PTCA。这样做的优势在于，该操作实现了PTCA不易从复合物中掉落的目的，从而增强了电刺激作用下发光信号的稳定性。与传统的直接将共反应剂加速剂分散到供试溶液中的方法相比，本工作的优势在于，将3D H-SnS2和PTCA直接交联在一起，形成自我增强的结构，信号增强更为显著。其原因如下：(i)有效地缩短了具有3D H-SnS2的S2O8 2-产生的SO4·-自由基与发光PTCA之间的距离，使SO4·-自由基直接作用于PTCA，提高了SO4·-的利用效率；(ii)3D H-SnS2结构中的插入式SnS2纳米片可以充分暴露表面上更多的活性位点。因此，在电的作用下，Sn2+/Sn4+可以起到电子转移的作用，促进S2O8 2-产生更多的SO4·-自由基；(iii)中空结构赋予共反应剂S2O8 2-充分渗透到3D H-SnS2的内部和外部，可有效产生更多SO4·-以增强发光。
进一步的，将上述以共反应剂加速剂三维中空硫化锡为基底的功能化复合物构建ECL传感器，用于敏感的检测目标物。
与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：
(1)本发明以晶体为基础的空心纳米材料的一步合成开辟了途径。本发明实现了对空心SnS2形貌的精确调控，在设计具有优异电活性的纳米材料上提供了一种策略，并在电化学和生物化学传感上具有潜在的应用价值。
(2)本发明进一步将一个以共反应剂加速剂三维中空硫化锡设计为功能化复合物3D H-SnS2-APTES-PTCA，该操作实现了PTCA不易从复合物中掉落的目的，从而增强了电刺激作用下发光信号的稳定性。
(3)本发明中将3D H-SnS2和PTCA直接交联在一起，有效地缩短了具有3D H-SnS2的S2O8 2-产生的SO4·-自由基与发光PTCA之间的距离，使SO4·-自由基直接作用于PTCA，提高了SO4·-的利用效率。
(4)本发明中3D H-SnS2结构中的像插片状的SnS2纳米片可以充分暴露表面上更多的活性位点，从而避免了普通方法制备的纳米片因相互堆叠或者像其他3D材料因结构垮塌而影响活性位点的屏蔽，减少了其材料活性位点的效率。
(5)本发明中中空结构赋予共反应剂S2O8 2-充分渗透到内部与外部，可有效产生更多SO4·-以增强发光。
(6)该方法简单方便，成本低廉，易于操作控制，重复性较好，其优异的电活性有望实现在电化学多种领域中的实际应用。
(7)以共反应剂加速剂三维中空硫化锡为基底的功能化复合物实现了对人类抗原心肌肌钙蛋白的检测，展现出良好的线性范围(16fgmL-1到16ngmL-1)和检出限(1.19fgmL-1)。与传统检测方法相比，本发明中所提出的电化学发光免疫传感检测方法具有操作简单，设备简单，灵敏度高，检测成本低等特点。
附图说明
图1是本发明的以共反应剂加速剂三维中空硫化锡为基底的功能化复合物制备过程的示意图及电化学发光传感器的构建示意图。
图2是本发明的(A)S-ZnSn(OH)6的FE-SEM图像；(B)H-ZnSn(OH)6的FE-SEM图像；(C)和(D)均为3D H-SnS2的FE-SEM图像(D图是C图的局部放大视图)；(E)H-ZnSn(OH)6的TEM图像；(F)3D H-SnS2的TEM图像；(G)H-ZnSn(OH)6的HR-TEM晶格条纹图像；(H)3D H-SnS2的HR-TEM晶格条纹图像；(I)功能化的3D H-SnS2-APTES-PTCA复合物的FE-SEM图像。
图3是本发明的PTCA的FE-SEM图像。
图4是本发明的PTCA的荧光激发光谱与发射光谱图以及PTCA的紫外灯照射图。
图5是本发明的(A)(a)H-ZnSn(OH)6和(b)3D H-SnS2的X-射线粉末衍射图；(B)3DH-SnS2的X-射线光电子能谱的全谱图；(C)Sn3d的高分辨率X-射线光电子能谱图；(D)S 2p的高分辨率X-射线光电子能谱图；(E)(a)3D H-SnS2、(b)PTCA和(c)功能化的3D H-SnS2-APTES-PTCA复合物的紫外-可见吸收光谱图；(F)(a)3D H-SnS2、(b)PTCA和(c)功能化的3DH-SnS2-APTES-PTCA复合物的拉曼散射光谱图。
图6是本发明的3D H-SnS2的能量散射图以及原子百分含量。
图7是本发明的3D H-SnS2的Sn元素和S元素的元素分布图。
图8是本发明的(A)电化学发光-电位曲线图：裸GCE在30mmol L-1S2O8 2-溶液(a)，30mmol L-1S2O8 2-和0.5mg mL-1的3D H-SnS2溶液(b)，GCE/PTCA(c)，GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA(d)和GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA/Au(e)(30mmol L-1S2O8 2-在0.1mol L-1PBS(pH＝8.0)溶液中)；(B)循环伏安响应曲线：裸GCE在0.5mg mL-1 3D H-SnS2溶液(a)，30mmol L-1S2O8 2-溶液(b)，30mmol L-1S2O8 2-含有0.5mg mL-1 3D H-SnS2溶液(c)；(C)在不含和含有3D H-SnS2的S2O8 2-体系中PTCA的ECL发光机制。
图9是本发明的不同类型修饰电极在含有0.1mol L-1KCl与5mmol L-1[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的(A)循环伏安CV曲线和(B)电化学阻抗EIS曲线：裸玻碳电极GCE(a)；GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA(b)；GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA/Au(c)；GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA/Au/anti-cTnI(d)；GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA/Au/anti-cTnI/BSA(e)；GCE/3D H-SnS2-APTES-PTES-PTCA/Au/anti-cTnI/BSA/cTnI(f)(内插图为电化学阻抗EIS的等效电路图)。
图10是本发明的(A)构建的传感平台在不同浓度下的心肌肌钙蛋白抗原cTnI的ECL响应，从a到g的曲线依次为16fg mL-1、0.16pg mL-1、1.6pg mL-1、16pg mL-1、0.16ng mL-1、1.6ng mL-1和16ng mL-1的cTnI在含有30mmol L-1S2O8 2-的PBS(0.1mol L-1，pH＝8.0)溶液中的电化学发光响应；(B)为A中浓度所对应的检测cTnI的标准曲线；(C)制备的生物传感器(0.16pg mL-1cTnI)在连续电位扫描12个周期下的稳定性测试；(D)构建的生物传感器对于不同干扰物质的选择性：(a)空白；(b)16pg mL-1牛血清蛋白(BSA)，(c)16pg mL-1甲胎蛋白(AFP)，(d)16pg mL-1癌胚抗原(CEA)，(e)0.16pg mL-1心肌肌钙蛋白(cTnI)，(f)0.16pg mL- 1cTnI+16pg mL-1BSA的二元混合物，(g)0.16pg mL-1cTnI+16pg mL-1AFP的二元混合物，(h)0.16pg mL-1cTnI+16pg mL-1CEA的二元混合物，(i)0.16pg mL-1cTnI+16pg mL-1BSA+16pgmL-1AFP+16pg mL-1CEA的多元混合物。
图11是本发明的构建的电化学发光免疫传感器的重复性实验。
图12是本发明的ECL传感条件优化图：(A)pH值的影响；(B)K2S2O8浓度的影响；(C)3D H-SnS2与PTCA的浓度比例的影响；(D)电沉积金纳米粒子圈数的影响；(E)抗体捕获抗原免疫反应时间的影响。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
一种基于ECL共反应剂加速剂的传感平台的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：(1)制备中空的ZnSn(OH)6(H-ZnSn(OH)6)
采用室温共沉淀法制备实心的ZnSn(OH)6(S-ZnSn(OH)6)之后采用高浓度强碱刻蚀的方法制备菱角稍有光滑的中空ZnSn(OH)6(H-ZnSn(OH)6)，具体实施为：称取2mmol的SnCl4·5H2O溶解于10mL的无水乙醇中，将上述溶液添加到由2mmol的ZnCl2和2mmol的一水合柠檬酸组成的20mL混合水溶液中，然后将溶液磁力搅拌10min后，迅速加入50mL 0.5molL-1的NaOH溶液，形成实心的立方体固体，再继续搅拌10min之后，然后在4min内缓慢滴加20mL的2mol L-1NaOH溶液，继续搅拌6min后，沉淀离心，用超纯水和无水乙醇洗涤2～3次，在60℃真空干燥箱中干燥12h，这样样品H-ZnSn(OH)6就被制备了。用场发射扫描电镜(FE-SEM)来观察合成的实心的和空心的ZnSn(OH)6的形貌，如图2A所示，实心的ZnSn(OH)6呈现整齐的六面体形状，直径大约1μm，而被高浓度的强碱刻蚀之后呈现菱角稍变光滑的六面体形状(如图2B所示)，直径仍大约1μm。进一步用透射电子显微镜观察空心的ZnSn(OH)6，观察到明显的中空结构，壁厚几十个纳米，高倍透射电子显微镜观察其晶格条纹，如图2G所示，0.39nm的对应其结构中的(200)晶面。
(2)制备3,4,9,10-苝四羧酸(PTCA)短棒状物质
制备3,4,9,10-苝四乙酸(PTCA)采用碱溶解酸沉淀法，首先将30mg苝-3,4,9,10-四羧酸二酐(PTCDA)加入100mL烧杯中，然后将30mL NaOH(1mol L-1)溶液倒入烧杯中，伴随着超声和连续手动搅拌15min，此时溶液变成黄绿色，然后缓慢滴加1mol L-1HCl溶液直到完全沉淀，溶液变成橙红色悬浮液。样品离心后，用超纯水和无水乙醇洗涤2～3次，在40℃的真空烘箱中干燥12h。用场发射扫描电子显微镜观察制备的PTCA形状，如图3所示，呈现短棒状结构。进一步如图4A所示，其荧光光谱的激发光谱与发射光谱呈现对称状态，在紫外灯照射下，可以明显的观察到绿色荧光发射(图4B)。
(3)制备三维中空的SnS2(3D H-SnS2)
采用水热的方法制备三维中空的SnS2，具体操作为，先将0.25mmol的H-ZnSn(OH)6、1mmol的乙二胺四乙酸(EDTA)、1.25mmol的硫代乙酰胺(TAA)加入到50mL烧杯中，然后将15mL超纯水倒入并超声，磁力搅拌10min后，所得溶液转移到25mL聚四氟乙烯内衬不锈钢高温高压反应釜中，在200℃下加热3h，冷却至室温，沉淀用超纯水和无水乙醇离心洗涤2～3次，在60℃真空烘箱中干燥12h，这样就得到三维中空的SnS2(3D H-SnS2)。使用场发射扫描电子显微镜去观察合成的3D H-SnS2的形貌，如图2C所示，合成的中空硫化锡仍然为近立方的形态，并且表面被像插片一样的纳米片堆积，与之前合成的中空ZnSn(OH)6结构相比，体积有所膨胀，直径变化到约2μm左右，我们进一步放大观察其结构，如图2D所示，其表面被大量纳米片相互穿插在一起，并且纳米片厚度约为28nm，在透射电子显微镜下观察，发现其仍可以保持原来的中空结构(如图2F所示)，但是结构发生了转化。采用高倍透射电子显微镜观察其晶格条纹，0.32nm与0.59nm的条纹对应其结构中的(100)和(001)晶面(图2H)。
(4)制备以共反应剂加速剂三维中空硫化锡为基底的功能化复合物
在2mL的3D H-SnS2(0.5mgmL-1，乙醇与水分散，体积比为49：1)悬浮液中加入40μL的(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)，磁力搅拌3h，得到氨基功能化的3D H-SnS2。然后离心，用乙醇和蒸馏水洗涤2～3次。此后，沉淀物在2mL蒸馏水中重新分散。同时，将600μL的N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)(300μL，35mmol L-1)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(300μL，10mmol L-1)的混合溶液加入到2mL的0.5mgmL-13,4,9,10-苝四羧酸(PTCA)溶液中，反应30min以充分活化PTCA的羧基基团(-COOH)。将上述重新分散的2mL的3DH-SnS2悬浮液加入到上述活化的PTCA溶液中进行酰胺反应3h，得到具有酰胺键连接的功能化的3D H-SnS2-APTES-PTCA化合物，然后离心，用蒸馏水洗涤2～3次。最后，将沉淀重新分散到2mL的蒸馏水中，并储存在4℃的冰箱中以备进一步使用。
性能测试:
1、对制备的以共反应剂加速剂三维中空硫化锡进行表征测试，结果如下：
X射线衍射图谱、光电子能谱图、能量散射图和元素分布图
利用X射线衍射光谱(XRD)进一步表征了3D H-SnS2的结构。从图5A中可以看出，特征衍射峰在19.62°、22.72°、32.41°、40.04°、46.64°、52.42°和57.72°处的峰(曲线b)分别对应于H-ZnSn(OH)6的(111)、(200)、(220)、(222)、(400)、(420)和(422)晶面。曲线a在15.03°、28.20°、32.12°、41.89°、49.96°、52.45°、54.96°和60.62°处的特征衍射峰，分别与3D H-SnS2的(001)、(100)、(101)、(102)、(110)、(111)、(103)和(201)晶面相一致。
此外，为了进一步确定合成的3D H-SnS2的表面化学价态，利用X射线光电子能谱(XPS)分析了其价态组成。如图5B所示，在3D H-SnS2的全谱谱图中存在Sn和S的特征峰。从图5C中可以看出，高分辨率XPS在486.8eV和495.2eV处的峰为Sn元素的Sn 3d5/2态和Sn3d3/2态，属于3D H-SnS2的Sn4+。在485.6eV处没有明显的峰值，表明Sn2+是缺乏的。如图5D所示，XPS光谱中161.7eV和162.9eV的峰属于S的S 2p3/2态和S 2p1/2态。
此外，通过EDS能谱分析和STEM元素分布图进一步确定了锡和硫的原子数和元素组成。如图6所示，Sn和S的原子百分比为4.87:10.62，接近1：2的原子比。从元素分布图(图7)可以看出Sn和S元素整齐的均匀存在。以上结果表明，成功地合成了共反应剂加速剂3DH-SnS2。
2、对制备的以共反应剂加速剂三维中空硫化锡为基底的功能化复合物进行表征测试
为了证明功能化3D H-SnS2-APTES-PTCA复合物的成功制备，首先，如图2I所示，场发射的扫描电子显微镜可以观察到3D H-SnS2结构中纳米片表面有许多小的短棒状的物质，初步证明了功能化3D H-SnS2-APTES-PTCA复合物的成功制备。为了进一步验证，实验中研究了3D H-SnS2、PTCA、3D H-SnS2-APTES-PTCA的紫外-可见吸收光谱(UV-vis)。如图5E所示，3D H-SnS2在约500nm处有一个较弱的肩峰(曲线a)。同时，PTCA在460nm、528nm和568nm处显示出三个特征吸收峰，这与芳香族的π-π*跃迁有关(曲线b)。此外，3D H-SnS2-APTES-PTCA在528nm处呈现宽带吸收，在568nm处呈现特征吸收，这是由于3D H-SnS2与PTCA的交联作用所致。图5F所示的拉曼光谱结果也进一步证明了上述结果，3D H-SnS2在316cm-1处出现特征拉曼峰(曲线a)，此外，PTCA在1048cm-1、1308cm-1、1383cm-1和1569～1612cm-1处出现峰或谱带散射强度(曲线b)，更进一步，c曲线上出现了上述的所呈现的全部峰或谱带散射强度，进一步证明了3D H-SnS2-APTES-PTCA复合物的成功制备。
3、对制备的以共反应剂加速剂三维中空硫化锡为基底的功能化复合物进行机理探究
为了理解3D H-SnS2在PTCA/S2O8 2-系统中的作用及其可能的ECL机理，本实验采用了ECL响应曲线和CV响应曲线进行了分析。图8A中的分析系统分为以下类型：(a)S2O8 2-溶液，(b)S2O8 2-+3D H-SnS2溶液，(c)GCE/PTCA+S2O8 2-溶液，(d)GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA+S2O8 2-溶液，(e)GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA/Au+S2O8 2-，测试都置于0.1mol L-1PBS(pH＝8.0)溶液中。如图8A所示，裸GCE在30mmol L-1S2O8 2-溶液中具有微弱的发光，这归因于单线态的氧1(O2)2*的发光。同时，裸GCE置于30mmol L-1S2O8 2-和0.5mgmL-1 3D H-SnS2溶液中时，产生的信号是先前信号的两倍以上，这也归因于1(O2)2*的发光，表明3D H-SnS2可以与S2O8 2-相互作用以促进发光。另外，当GCE/PTCA置于30mmol L-1S2O8 2-溶液中时，观察到明显的ECL信号，表明PTCA是本实验中的发光物质。值得注意的是，当GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA浸泡在30mmol L-1S2O8 2-溶液中时，出现了一个非常强的信号，这意味着3D H-SnS2可以作为共反应加速剂来增强PTCA的发射。在进一步的实验中，在此基础上电沉积一层金纳米粒子后，电化学发光信号进一步增强，这可能是由于金纳米粒子具有良好的导电性，可以加速微结构的电子转移效率。
此外，测量了三种溶液的CV曲线，进一步证明3D H-SnS2可以与S2O8 2-相互作用，从而有效增强PTCA的ECL强度。如图8B所示，当裸GCE电极在0.5mg mL-1 3D H-SnS2溶液中测试时，未观察到明显的氧化还原峰(曲线a)。当使用裸电极GCE测试30mmol L-1S2O8 2-溶液时，在-1.0V处出现明显的还原峰(曲线b)。更重要的是，使用裸电极GCE测试30mmol L-1S2O8 2-和0.5mg mL-1 3D H-SnS2溶液，观察到非常强的氧化还原峰(曲线c)，并且由于3D H-SnS2的引入，氧化还原峰电位向负电位发生了位移。这表明3D H-SnS2作为有效的共反应剂加速剂，可以有效促进S2O8 2-的还原，并产生更多的SO4·-自由基离子。图8C为3D H-SnS2增强PTCA电化学发光可能的机理图。
实施例2
以共反应剂加速剂三维中空硫化锡为基底的功能化复合物传感检测蛋白应用
(1)玻碳电极GCE的清理以及ECL免疫传感器的制备
用0.3μm和0.05μm氧化铝粉末浆料对玻碳电极(GCE，Φ＝3mm)进行抛光，获得像镜面清洁的表面。然后，在超纯水、乙醇和超纯水中各超声处理GCE 10min。最后用氮气流干燥打磨干净的电极，以备进一步使用。接下来，电化学发光免疫传感器构建过程如图1所示。将6uL 3D H-SnS2-APTES-PTCA悬浮液滴到清洁的玻碳电极GCE上。在室温下干燥后，将电极浸泡在0.5mM HAuCl4溶液(0.1M PBS，pH＝7.4)中，用循环伏安法(CV)电沉积5圈，电位窗口设置为-0.2～0.8V，扫描速率设置为50mVs-1。然后在修饰电极表面滴加4μL的1.5μgmL-1抗体(anti-cTnI)溶液，反应3h，以Au-S键将抗体固定在修饰电极表面。接下来，用0.1M PBS(pH＝7.4)溶液冲洗电极几次，以去除未结合的anti-cTnI。然后，将3μL 1wt％的BSA溶液分散在电极上反应1.5h以阻断非特异性结合位点，紧接着用0.1M PBS(pH＝7.4)冲洗数次。通过上述构建，我们获得了一个新型的GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA/Au/anti-cTnI/BSA传感界面。
(2)电化学发光免疫传感器检测心肌肌钙蛋白抗原
将不同浓度的6μL抗原(cTnI)滴在已制备的传感界面上，然后将抗原和抗体在4℃的冰箱中孵育40min，之后用PBS(pH＝7.4)冲洗未结合的抗原数次。最终的ECL免疫传感器(GCE/3D-H-SnS2-APTES-PTCA/anti-cTnI/BSA/cTnI)被测试，使用6mL含有30mmol L-1K2S2O8的0.1M PBS(pH＝8.0)溶液作为ECL测试溶液，电位窗口设置为-1.7～0V，光电倍增管的偏压设置为750V，扫描速率为0.2Vs-1。最后，使用传统的三电极系统，以修饰的玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl(内含饱和的KCl溶液)电极为参比电极，铂丝作为对电极，将电极置于ECL池中，用西安瑞迈的MPI-B型电化学发光分析仪对其信号进行监测分析。
采用循环伏安曲线CV和电化学阻抗EIS对电极的修饰过程进行了表征。
循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)用于表征ECL免疫传感器传感界面的构建过程，选取溶液为5mmol L-1的[Fe(CN)6]3-/4-(包含0.1M的KCl)溶液中，首先，如图9A所示，裸GCE电极呈现了对称的氧化还原峰(曲线a)。当3D H-SnS2-APTES-PTCA修饰在电极上时，GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA由于导电率的降低而表现出显著的电流降低(曲线b)。然后，电沉积一层金纳米粒子后，由于贵金属的良好导电性，氧化还原电流(c曲线)呈现出了比b曲线强，接着连接anti-cTnI、BSA和cTnI后，修饰电极界面在溶液中的导电性不断降低，相应的氧化还原电流依次下降(曲线d、e和f)，这是由于蛋白质的绝缘作用，以上结果表明成功构建了ECL免疫传感器。
此外，EIS也很好地说明了电极界面逐层构建的过程。如图9B所示，裸GCE的EIS显示一个较小的半圆(曲线a)，表明电极界面有较小的电子阻碍。当3D H-SnS2-APTES-PTCA引入到电极界面时，由于电极表面电导率的迅速降低，b曲线的半圆明显增大，这与CV结果相一致。随后，当金纳米粒子被沉积在修饰电极上时，c曲线的半圆减小，这归因于金纳米粒子可以有效的促进电子转移的能力。加入anti-cTnI、BSA和cTnI后，由于蛋白质导电性较差，d、e和f曲线的半圆呈现增大趋势。上述结果与CV的结果相一致，这进一步证明该免疫传感器已经成功构建。
传感响应曲线、稳定性、选择性、稳定性性能表征：
为了测试传感器的性能，在最佳的实验条件下，利用构建的免疫传感界面对不同浓度16fgmL-1至16fgmL-1的心肌肌钙蛋白I抗原(cTnI)进行检测，结果如10A所示。图10B为对应的对数线性响应曲线，相应的线性回归方程为y＝-1436.96lgC+3695.01，线性回归系数为R2＝0.9936，检出限(LOD)为1.19fgmL-1。传感器的稳定性非常重要，它直接关系到传感器的实用性。如图10C所示，在循环伏安法(CV)的作用下，对构建的传感器(0.16pgmL-1cTnI)连续扫描12次，结果是令人满意的，相对标准偏差(RSD)为2.23％。此外，为了测试其抗干扰能力，在系统中加入了几种高浓度的干扰物质，如牛血清白蛋白(BSA)、甲胎蛋白抗原(AFP)和癌胚抗原(CEA)，如图10D所示。结果表明，构建的生物传感器对BSA(16pgmL-1)，AFP(16pgmL-1)和CEA(16pgmL-1)几乎没有响应，但cTnI(0.16pgmL-1)出现时信号明显发生减弱。此外，当检测二元混合物(0.16pgmL-1cTnI+16pgmL-1BSA、0.16pgmL-1cTnI+16pgmL-1AFP、0.16pgmL-1cTnI+16pgmL-1CEA)或甚至四元混合物(0.16pg mL-1cTnI+16pgmL-1BSA+16pgmL- 1AFP+16pgmL-1CEA)时，信号接近于单独检测cTnI(0.16pgmL-1)时的信号，表明ECL免疫传感器具有很强的选择性。进一步，进行了重复性实验。选择了5根浓度为0.16pgmL-1不同的电极。如图11所示，五个电极在可接受的波动范围内，相对标准偏差(RSD)为1.46％，证明构建的生物传感器具有良好的重复性。
实施例3
为了使制备的电化学发光生物免疫传感器表现出最优异的性能，其制备过程的相关参数进行了优化如下。
为了获得最佳的实验结果，实验中对pH值、K2S2O8浓度、3D H-SnS2与PTCA的浓度比、电沉积金纳米粒子的圈数以及抗体anti-cTnI与抗原cTnI的免疫反应时间进行了优化。首先，如图12A所示，随着pH值从6.5增加到8.0，ECL的强度一直在增加，8.0后降低，原因可能是质子的快速还原抑制了低pH下的发光，而在高pH下，SO4·-更容易与OH-反应，并且高的pH也会影响蛋白的活性，导致ECL强度降低。因此，选择pH值为8.0为本实验的最佳条件。然后，如图12B所示，优化K2S2O8的浓度。随着K2S2O8浓度从5mmol L-1增加到30mmol L-1，生成了更多的SO4·-，有效地促进了PTCA的发光。然而，随着K2S2O8浓度的继续增加，PTCA的激发态(PTCA*)可能会被K2S2O8分解，导致了发光降低。因此，K2S2O8的最佳浓度为30mmol L-1。此外，还优化了共反应剂加速剂3D H-SnS2与发光体PTCA浓度之间的关系。将不同浓度比例的3DH-SnS2与PTCA混合后直接滴加在电极上，使用壳聚糖(CS)封膜。如图12C所示，当3D H-SnS2与PTCA的浓度比例从3:1到1:1时，ECL的信号强度增加。其原因是共反应剂加速剂用量是比较少的，信号强度随着PTCA用量的增加而增大。但是，当PTCA的比率继续增加时，如图12C所示，发光物质的信号强度反而降低。此时，可能的原因是PTCA的信号分子相互干扰，内滤效应增强。因此，3D H-SnS2与PTCA的浓度比例为1:1是合成功能化3D H-SnS2-APTES-PTCA复合物的最佳比例。此外，在连接抗体(anti-cTnI)之前，还优化了电沉积金纳米粒子(Au NPs)的圈数。如图12D所示，电沉积循环5圈是最合适的循环圈数。当沉积循环圈数较少时，随着沉积循环圈数的增加，信号强度显著的增加，这是由于贵金属纳米粒子具有良好的导电性。当沉积达到一定程度时，信号强度不但没有增加，反而降低。其原因可能是金纳米粒子过于致密，阻碍了发光。最后，如图12E所示，抗体(anti-cTnI)和抗原(cTnI)的免疫反应时间也得到了优化。随着反应时间的增加，ECL信号逐渐减弱，这是由于蛋白的空间位阻效应阻碍了电子传递。40min以后，由于抗原(cTnI)的捕获过程已经完成，信号改变不再明显。因此，40min是抗原抗体最适宜的孵育时间。因此，最佳实验条件为：pH为8.0，K2S2O8浓度为30mmolL-1，3D H-SnS2与PTCA的浓度比为1:1，电沉积循环圈数为5圈，免疫反应时间为40min。
实施例4
将实施例1制备的以共反应剂加速剂三维中空硫化锡为基底的功能化复合物的用于ECL传感器检测林可霉素(Lin)。
在实施例2中得到的修饰电极GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA滴加6μL 0.1wt％壳聚糖(CS)，室温干燥30min；再滴加6μL 5wt％戊二醛溶液，室温孕育1h，PBS缓冲液洗去过量的戊二醛(GA)；之后滴加6μL 5μM林可霉素适配体(aptamer)溶液，在37℃液孵育1h，然后用PBS缓冲液淋洗除去非化学键合的适配体，得到GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA/CS/GA/aptamer电极；随后，将5μL浓度为1×10-11mol L-1～5×10-9mol L-1的Lin分别滴加到GCE/3DH-SnS2-APTES-PTCA/CS/GA/aptamer电极上，并在4℃下孵育8h，用PBS缓冲液淋洗干净后，将上述各孵育完成后的修饰电极放入含有6mLPBS(pH＝8,0.1mol L-1)的K2S2O8溶液ECL池中，进行电化学发光测试(测试条件大致与实施例2相同)。实验结果发现，电化学发光响应值与林可霉素浓度的对数值呈现良好的线性关系，其检出限可达到5.6×10-12mol L-1。
实施例5
将实施例1制备的以共反应剂加速剂三维中空硫化锡为基底的功能化复合物的用于ECL传感器检测大肠杆菌毒素DNA的寡核苷酸序列。
捕获探针序列(S1)：5’-NH2-(CH2)6-GAG CGG CGC AAC ATT TCA GGT CGA-3’；
互补序列(S2)：5’-TCG ACC TGA AAT GTT GCG CCG CTC-3’；
采用EDC/NHS作为活化剂将5’-NH2修饰的探针NDA(S1)经由酰胺化反应共价固载到修饰电极表面。制备步骤如下：在实施例2中得到的修饰电极GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA滴加6μL 0.1wt％壳聚糖(CS)，室温干燥30min，之后滴加3μLEDC/NHS充分活化修饰中羧酸基团，之后滴加5μL含0.1μM S1的TE缓冲液中分别进行藕合交联反应12h，并用TE缓冲溶液充分淋冼，然后室温下晾干获得的修饰电极记为GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA/CS/S1，随后，滴加6μL含有不同浓度(1.0×10-6mol L-1～8.0×10-1mol L-1)的S2目标分析物的溶液，在42℃条件下进行杂交反应25min，并用TE缓冲液淋冼杂交反应后的修饰电极以除去物理性吸附的靶DNA(S2)，最后得到杂交反应完成的修饰电极GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA/CS/S1/S2。将上述完成后的修饰电极放入含有6mLPBS(pH＝8，0.1mol L-1)的K2S2O8溶液的ECL池中，进行电化学发光测试，获得一个相对较低的检测限值(6.25×10-7mol L-1)。
实施例6
将实施例1制备的以共反应剂加速剂三维中空硫化锡为基底的功能化复合物的用于ECL传感器检测重金属Hg2+
由于富含T碱基的Hg2+核酸适体DNA(序列为：5'-SH-(CH2)6-TCT TTC TTC TTT CTTCCCCCC TTG TTT GTT GTT TGT-3')与Hg2+可以通过两者之间的特异性作用形成二元复合物(即MSA-Hg2+络合物)，基于此原理即可构建Hg2+的ECL适体传感器。具体实施如下：在实施例2中得到的修饰电极GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA滴加6μL 0.1wt％壳聚糖(CS)，室温干燥30min，之后滴加6μL含10-7molL-1核酸适体探针(MSA)DNA的BR溶液(40mmolL-1，pH＝7.0)，并于4℃下培育12h，取出，用PBS淋洗表面以除去未组装的MSA，得到适体DNA修饰电极记为GCE/3D H-SnS2-APTES-PTCA/CS/MSA。随后滴加6μL的1mmolL-1的6-巯基己醇(MCH)中室温条件下作用2h，以封闭电极表面多余的活性位点，淋洗干燥之后得到的修饰电极记为GCE/3DH-SnS2-APTES-PTCA/CS/MSA/MCH。之后将不同浓度的Hg2+，滴加6μL于上述修饰电极上，置于常温30min，紧接着用PBS缓冲液淋洗电极表面，以去除未与适体结合的Hg2+，将上述完成后的修饰电极放入含有6mL PBS(pH＝8，0.1mol L-1)的K2S2O8溶液的ECL池中，进行电化学发光测试，该功能复合物制备的ECL核酸适体传感器对Hg2+的检测线性范围为6.5×10-13molL-1～5.4×10-8molL-1，其检测限低至5.4pmolL-1。同时，该适体ECL传感器对实际水样中Hg2+的检测也得到了满意的结果。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.一种基于ECL共反应剂加速剂的传感平台的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 制备三维中空的SnS2，计为3D H-SnS2；
S2. 将步骤S1得到的3D H-SnS2与(3-氨丙基)三乙氧基硅烷（APTES）、3,4,9,10-苝四羧酸（PTCA）反应得到3D H-SnS2-APTES-PTCA；
S3. 用步骤S2得到的3D H-SnS2-APTES-PTCA修饰电极，得到3D H-SnS2-APTES-PTCA修饰电极，即得。
2. 根据权利要求1所述基于ECL共反应剂加速剂的传感平台的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的3D H-SnS2的制备包括：
S11. 制备实心的ZnSn(OH)6分散液；
S12. 在步骤S11得到的实心ZnSn(OH)6分散液中，缓慢加入浓度为1.5~2.5 mol/L的NaOH溶液，然后搅拌5~8 min后离心保留沉淀物；其中，NaOH溶液的体积为所述分散液体积的1/3~1/2；NaOH溶液的加入速度为4.5~5.5 mL/min；
S13. 将步骤S12得到的沉淀物洗涤以后，在50~70℃温度下真空干燥10~15h，得到H-ZnSn(OH)6；
S14. 将步骤S13得到的H-ZnSn(OH)6与乙二胺四乙酸、硫代乙酸铵按照摩尔比为1:(3~5):(4~6)混合溶于水得到总浓度为0.1~0.2 mol/L混合溶液，然后搅拌8~14min，再以180~220℃温度加热2~4h，冷却后洗涤，再在50~65℃温度下干燥，即得。
3. 根据权利要求1所述基于ECL共反应剂加速剂的传感平台的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，通过底涂的方式将3D H-SnS2-APTES-PTCA修饰在电极表面。
4.权利要求1至3任一项所述基于ECL共反应剂加速剂的传感平台的制备方法所制备得到的传感平台。
5.权利要求4所述传感平台在制备生物传感器中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S41. 将物质A修饰在所述传感平台上；
S42. 配置系列浓度的物质B溶液，所述物质B能够与物质A特异性结合；
S43. 将不同浓度的物质B溶液滴加在步骤S41处理之后的传感平台上，然后在电化学发光测试体系中测试电化学发光强度，并绘制标准曲线；
S44. 将含有物质B的待测样品滴加在步骤S41处理之后的传感平台上，测试得到电化学发光强度，并通过步骤S43得到的标准曲线计算出样品中抗原的浓度。
6.权利要求5所述传感平台在生物传感器中的应用，其特征在于，所述物质A为心肌肌钙蛋白抗体，物质B为心肌肌钙蛋白抗原；或物质A为戊二醛，物质B为林可霉素；或物质A、物质B为互补的DNA序列；或物质A为富含T碱基的核酸；物质B为Hg2+。
7.根据权利要求4所述传感平台在制备生物传感器中的应用，其特征在于，步骤S41中物质A通过金纳米或壳聚糖修饰在所述传感平台上。
8.根据权利要求7所述传感平台在制备生物传感器中的应用，其特征在于，所述金纳米通过电化学沉淀的方法修饰在传感平台上。
9. 根据权利要求6所述传感平台在制备生物传感器中的应用，其特征在于，当物质A、物质B为互补的核酸序列时，物质A的序列为：5’-NH2-(CH2)6-GAG CGG CGC AAC ATT TCAGGT CGA-3’；物质B的序列为：5’- TCG ACC TGA AAT GTT GCG CCG CTC-3’。
10. 根据权利要求6所述传感平台在制备生物传感器中的应用，其特征在于，所述物质A为富含T碱基的核酸时的序列为：：5'-SH-(CH2)6-TCT TTC TTC TTT CTT CCCCCC TTG TTTGTT GTT TGT-3'。
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