CN111272851B - 一种检测·oh的玻璃纳米孔传感器及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于玻璃纳米孔的传感检测技术领域，具体涉及一种检测·OH的玻璃纳米孔传感器及其制备和基于离子整流原理的电化学分析方法。本发明所述纳米孔传感器的方法包括：首先利用拉制仪拉制出玻璃锥形纳米孔，然后在纳米孔内壁均匀镀上一层金膜，最后通过Au‑S键的强相互作用和酰胺反应，依次在金膜上修饰半胱胺分子和原卟啉分子，最终得到功能化的玻璃纳米孔传感器。本发明还提供了一种由所述玻璃纳米孔传感器检测·OH的方法。本发明的工艺流程简单，无需昂贵的试剂和大型仪器，能在复杂体系中实现对·OH的高选择性，高灵敏度的快速响应，为食品安全、医疗卫生、环境监测等领域内·OH的检测，提供了便携高效的检测平台和方法设计。

Description

一种检测·OH的玻璃纳米孔传感器及其制备和应用

技术领域

本发明属于玻璃纳米孔的传感检测技术领域，具体涉及一种检测羟基自由基(·OH)的玻璃纳米孔传感器及其制备和基于离子整流原理对·OH的电化学分析方法。

背景技术

玻璃纳米孔是使用拉制仪拉制玻璃毛细管，形成的纳米尺度的尖端，纳米孔尖端处的开口形状和孔径大小可以通过给拉制仪设置不同的加热温度，速度，延迟时间，拉力值等参数进行调节。将制备好的纳米孔置于电化学工作站内搭建三电极体系，给纳米孔施加一个对称的电压，将会得到非对称的电流，此I-V曲线称为离子电流整流现象(ICR)。研究发现，在扫描速率，电压极性，电解质浓度，溶液pH等条件不变时，离子整流的程度和方向取决于纳米孔内壁的表面电荷密度。当体系中的目标分子进入纳米孔，与内壁上的修饰层发生作用时，纳米孔内壁表面电荷的种类和数量会发生相应改变，表面电荷的改变会通过整流曲线体现出来，分析整流曲线响应信号的差别，可以得到很多有价值的信息，这就是使用单个玻璃纳米孔作为分析检测平台，实现对目标分子传感检测的基本原理。玻璃纳米孔制备简单，可重复性强，修饰后的纳米孔生物相容性好，易于功能化，这些优势为玻璃纳米孔在生物传感分析中的应用开辟了极为广阔的空间。

·OH作为活性氧家族的重要成员，是生命体内重要的氧代谢产物和信号传导介质，低浓度的·OH维持着正常的体内平衡，然而，较高浓度的·OH会对体内几乎所有种类的生物分子构成伤害，包括碳水化合物、核酸、脂质，氨基酸等，进而诱发一系列活性氧相关疾病，例如恶性肿瘤，阿尔兹海默症等神经退行性疾病。因此，在单细胞水平上检测·OH的意义重大。但·OH的反应活性高，稳定性差(平均寿命只有10^-6s)，在细胞内的稳态浓度极低，且细胞内还同时存在着多种氧化物和抗氧化物的干扰。

传统的检测·OH的方法主要有电子自旋共振法、色谱法、荧光法等，但极少能够在单个活细胞内实现无损检测，即使目前一些荧光探针的检测极限达到了单细胞水平，但关于·OH的荧光探针普遍存在探针合成困难，检测选择性低，背景信号高，细胞毒性强，光稳定性差等局限。这些挑战使得生命体内·OH的检测技术难以取得实质性突破。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测·OH的新方法，通过在纳米孔内壁构筑功能化的传感材料，可采用微型化设备实现对·OH的高准确度，高灵敏度，高选择性，快速响应。

本发明提供的检测·OH的玻璃纳米孔传感器的制备方法，具体步骤为：

(1)对玻璃管用拉制仪拉制，形成玻璃纳米孔。

(2)在步骤(1)得到的纳米孔内壁均匀镀上一层金膜。

(3)在步骤(2)的基础上，通过Au-S键的强相互作用，在已镀金膜的纳米孔内壁修饰上半胱胺分子。

(4)在步骤(3)的基础上，利用酰胺反应，将原卟啉分子共价连接到半胱胺上，获得内壁功能化的玻璃纳米孔传感器。

本发明步骤(1)中，所述玻璃管(尺寸)外径1.0mm～1.2mm，优选1.0mm；内径0.5mm～0.9mm，优选0.78mm；内置引流管的毛细管。

本发明步骤(1)中，所述毛细管的材质为石英毛细管或硼硅酸盐毛细管；优选为硼硅酸盐毛细管。

本发明步骤(1)中，所述拉制仪优选激光拉制仪。所述拉制仪的参数设置为：HEAT＝320，Fil＝4，VEL＝40，DEL＝180，PUL＝225。

本发明步骤(1)中，所述玻璃纳米孔的孔径为30nm～200nm；优选为70nm。

本发明步骤(1)中，所述玻璃纳米孔的形状不能为管状纳米孔，需为锥形纳米孔。所述锥形纳米孔的角度为2°～10°，优选5°。锥形纳米孔的角度选择不当，会导致整流减弱。本发明中，当锥形纳米孔的角度为2°～10°，优选5°时整流程度最显著。

本发明步骤(2)中，在纳米孔内壁均匀镀上金膜的方法是紫外光照还原法(即紫外光还原氯金酸的光照法)，将氯金酸的乙醇溶液注入玻璃纳米孔，再将玻璃纳米孔抽真空，然后将纳米孔置于紫外光照下照射，Au³⁺在紫外光和乙醇的还原作用下被还原成Au，在纳米孔内壁聚集形成金簇，接着以金簇为成核中心，逐渐在纳米孔内壁沉积成均匀的金膜。

其中，所述氯金酸的乙醇溶液为氯金酸溶液与乙醇混合获得的，其中氯金酸溶液和乙醇的体积比为1∶1～2∶1；优选地，为3：2。氯金酸溶液的浓度为5mmol/L～50mmol/L；优选地，为8mmol/L。

其中，所述紫外光的波长为200nm～400nm；优选地，为254nm。

其中，所述紫外光照射的时间为1h～5h；优选地为2h。

具体地，所述步骤(2)包括以下操作步骤：先将四水合氯金酸粉末用去离子水配成5mmol/L～50mmol/L的溶液，再与乙醇混合，注入玻璃纳米孔，再将纳米孔抽真空，以排尽气泡。然后将纳米孔置于紫外光下照射，Au³⁺在紫外光和乙醇的还原作用下被还原成Au，在纳米孔内壁聚集形成金簇，接着以金簇为成核中心，逐渐沉积成均匀的金膜。取出纳米孔，移除管内溶液，晾干，最后置于烘箱中烘烤(烘烤的目的使金膜牢固地附着在纳米孔内壁上)。其中，所述烘烤的温度为80℃～200℃；优选地，为100℃。其中，所述烘烤的时间为1h～10h；优选地为1h。

在一具体实施方式中，所述步骤(2)包括以下操作步骤：先将市售的四水合氯金酸粉末，用去离子水配成8mmol/L的溶液，再与乙醇，按照3∶2的体积比混合，用微量注射器取10uL注入玻璃纳米孔，再将玻璃纳米孔放入真空烘箱中抽真空10min，以排尽气泡。然后将玻璃纳米孔置于254nm，8W的紫外灯下，照射2h，Au³⁺在紫外光和乙醇的还原作用下，被还原成Au,在纳米孔内壁聚集形成金簇，接着以金簇为成核中心，逐渐沉积成均匀的金膜。取出，移除管内溶液，室温晾干，最后置于100℃烘箱中烘烤1h。

本发明采用抽真空排气泡的方法，取代了以往的指弹法或离心法的过程中容易把纳米孔弹断，费时耗力，成功率低)。抽真空排气泡这一步骤贯穿整个制备过程，但凡往纳米孔内注入溶液后，都需要进行此步骤，应用面广泛，大大提高了纳米孔的制备效率。

本发明步骤(3)中，在已镀金膜的纳米孔内壁修饰半胱胺的方法是，将半胱胺的乙醇溶液或半胱胺盐酸盐的乙醇溶液注入纳米孔，抽真空，在温度(5℃～40℃，优选25℃±3℃)静置40min～12h，使半胱胺分子中的巯基通过Au-S键与金膜结合，即可在已镀金膜的纳米孔内壁修饰上半胱胺分子。

其中，所述半胱胺的乙醇溶液或半胱胺盐酸盐的乙醇溶液的浓度为10^-3～10^{- 1}mol/L；优选地，为10^-2mol/L。

优选地，采用半胱胺盐酸盐的乙醇溶液修饰半胱胺。

优选地，所述静置的时间为8h。

在一具体实施方式中，所述步骤(3)包括以下操作步骤：称取0.011g半胱胺盐酸盐晶体，用乙醇做溶剂，配成10^-2mol/L的半胱胺盐酸盐溶液，注入纳米孔，抽真空10min以排尽管内气泡，室温下静置8h后，移除管内溶液，并用乙醇清洗，以洗去多余的或结合不牢固的半胱胺，室温晾干。

本发明步骤(4)中，向纳米孔中注入原卟啉溶液，在温度(8℃～40℃，优选25℃±3℃)进行酰胺反应，连接上原卟啉分子，获得内壁功能化的玻璃纳米孔传感器。

优选地，所述原卟啉溶液为原卟啉的DMF溶液；其中，所述原卟啉溶液的浓度为10^-6～10^-4mol/L，优选为10^-5mol/L。

其中，所述酰胺反应的时间为5～15h；优选地15h。

进一步优选地，所述原卟啉溶液为混合了EDC和NHS的原卟啉溶液。其中，EDC和NHS作为催化剂，在EDC和NHS的催化作用下，原卟啉中的-COOH与半胱胺中的-NH₂发生酰胺反应，使卟啉分子被连接到半胱胺上。其中，NHS不是必须添加的，但它的使用可以极大地提高偶联效率。其中，EDC和NHS相较于原卟啉是远远过量的。进一步地，EDC和NHS的用量比为nEDC∶nNHS＝2∶1；例如，当配置3mL10^-5mol/L的原卟啉溶液时，EDC为0.005g(0.02mol)和NHS为0.01g(0.01mol)。

在一具体实施方式中，所述步骤(4)包括以下操作步骤：取市售的原卟啉粉末，用DMF做溶剂，配置3mL 10^-5mol/L的原卟啉溶液。加入相较于原卟啉的量远远过量的EDC和NHS(nEDC∶nNHS＝2∶1)，优选加入0.005gEDC和0.01gNHS，充分振荡后，取10μL立即注入纳米孔。

本发明还提供了一种由所述方法制备得到的玻璃纳米孔传感器。所述玻璃纳米孔传感器为纳米级的空心孔状材料，为功能化的玻璃纳米孔，对·OH的检测范围是5nM-120nM。

本发明还提供了所述玻璃纳米孔在检测·OH中的应用。本发明利用·OH特异性内剪切半胱胺碳链的原理，使相应数量的带电荷的原卟啉从纳米孔内壁脱落，带来纳米孔内壁表面电荷的改变，从而实现·OH的定量传感分析。本发明的传感器只对·OH有响应，对其他分子不响应，因此对目标分子的识别具有高度专一性，选择性；基于检测平台——玻璃纳米孔上构建的敏感膜，使用电化学信号检测目标分子，具有优异的灵敏度。

本发明还提供了一种由所述玻璃纳米孔传感器检测·OH的方法，所述方法包括如下步骤：

在检测前，向玻璃纳米孔传感器内注入Zn²⁺溶液，通过原卟啉与Zn²⁺的络合，使原卟啉带上正电荷，再向制备好的纳米孔传感器内注入电解质溶液，通过加入待测含·OH的溶液(如，利用Fenton反应产生的含·OH的溶液)，切断半胱胺碳链，导致正电荷的原卟啉分子从纳米孔内壁脱落下来，引起表面电荷变化，通过离子整流曲线记录纳米孔内壁表面电荷的变化，从而实现对·OH的检测。

具体地，由所述玻璃纳米孔传感器检测·OH的方法包括如下步骤：

(a)检测前，向玻璃纳米孔传感器内注入(10^-2～10^-6mol/L，优选10^-4mol/L的Zn²⁺溶液)，5℃～40℃，优选25℃±3℃，静置4～12h(优选8h)，移除未结合或结合不牢固的Zn²⁺溶液，并用蒸馏水洗涤。

(b)向步骤(a)中玻璃纳米孔传感器内注入电解质溶液；

(c)测试时，玻璃管内外的电解质溶液相同，在电化学工作站内搭建三电极工作体系，两根Ag|AgCl电极被用来给纳米孔施加电压，将一根Ag|AgCl电极插入玻璃纳米孔中，作为工作电极，另一根Ag|AgCl电极置于外部溶液中，作为参比/对电极。电压记录范围为-1V—+1V，电压阶跃幅度是50mV。当玻璃纳米孔传感器与体系接触时，体系中的·OH专一性地切割半胱胺的碳链，使带有正电荷的原卟啉分子从纳米孔内壁脱落下来，通过离子整流曲线记录纳米孔内壁表面电荷的变化，从而实现对·OH的高选择性检测。

标准曲线的绘制是在Ratio和C_·OH之间建立线性关系，Ratio＝|(I-I₀)/I₀|，其中，I为含羟基自由基的待测溶液在-1V下的电流值，I₀为羟基自由基浓度为0时候的-1V的电流值。

在测定过程中，电化学工作站直接在电脑屏幕上自动绘制出离子整流曲线，测定结束后，结合标准曲线，采用离子整流曲线对数据进行分析。

本发明步骤(b)中，所述电解质为含KCl的HEPES缓冲溶液、含NaCl的HEPES缓冲溶液、含KCl的PBS缓冲溶液、或含NaCl的PBS缓冲溶液；其中，KCl或NaCl的浓度为0.01～0.5mol/L，优选为0.1mol/L；HEPES或PBS的浓度为0.1mmol/L～100mmol/L；优选10mmol/L。进一步优选地，所述电解质为含KCl的HEPES缓冲溶液；进一步优选地，为含有KCl的10mmol/LHEPES缓冲溶液。

本发明步骤(b)中，所述电解质的pH范围为5.0～8.0，优选为pH7.0。

本发明步骤(c)中，所述离子整流曲线的获得步骤包括：搭建好三电极体系后，确认电极插入待测溶液中，选择“Linear Sweep Voltammetry”，开始扫描，数秒后扫描结束，电化学工作站自动绘制出离子整流曲线。

与现有检测·OH的技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明的工艺流程简单，无需昂贵的试剂和大型仪器。

(2)本发明改变了目前常用的检测·OH的单一模式，使用新颖的检测平台——玻璃纳米孔，无需复杂的前期样品准备，不需要使用昂贵的大型仪器，节约检测成本；所用的电化学工作站方便携带，适合做现场勘探。

(3)本发明利用在玻璃纳米孔内壁而非外壁构筑传感材料，检测时，待测复杂体系中的干扰成分对传感材料的破坏较小，传感材料的稳定性强(见附图5，插入细胞前后的电化学信号稳定图)。

(4)本发明的检测平台——玻璃纳米孔是纳米级的空心孔状材料，插入生物体时，对细胞的刺激较小，可以实现无损检测(见附图6，细胞在被插入纳米孔前后，存活率的对比图)。

(5)本发明首次提出通过Au-S键的强相互作用，并利用酰胺反应，制备玻璃纳米孔传感器，利用·OH特异性内剪切半胱胺碳链的原理，检测过程中使相应数量的带电荷的原卟啉从纳米孔内壁脱落，带来纳米孔内壁表面电荷的改变，从而实现·OH的定量传感分析检测，能在复杂体系中实现对·OH的高度专一性，选择性和灵敏度的快速响应。此传感原理对目标分子的识别具有高度专一性，选择性和灵敏度(见附图7)。

(6)本发明制备的功能化的玻璃纳米孔，在水溶液和细胞体系中，均表现出优异的上述性能，提供了便携高效的检测平台和方法设计，在食品安全、医疗卫生、环境监测等领域有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明玻璃纳米孔的传感原理示意图。

表示半胱胺分子，

表示带正电荷的原卟啉分子。传感原理是：待测体系中的·OH特异性地内剪切半胱胺分子的碳链，使带正电荷的原卟啉分子从纳米孔内壁脱落，导致纳米孔内壁的表面电荷发生改变。

图2是本发明制备玻璃纳米孔传感器中，在纳米孔内壁上实施的逐步修饰流程图。

图3是本发明实施例1制备玻璃纳米孔传感器中，得到的未经任何修饰的玻璃纳米孔(即，用拉制仪拉出的玻璃纳米孔尖端，其未修饰金、半胱胺、原卟啉、锌离子等，目的是为了表征玻璃纳米孔尖端的形态)的形态不同角度的扫描电子显微镜SEM的表征图。从图中可以看出，纳米孔的形态呈圆锥形，尖端的孔径在70nm左右。

图4是本发明实施例1制备玻璃纳米孔传感器过程中，修饰金膜前后，金元素的TEM和能谱点扫描对比表征图；其中，A、B是修饰金膜前后，玻璃纳米孔的透射电子显微镜TEM的对比表征图；从图中可以看出，相较于未经修饰的纳米孔(A图)，覆盖了金膜之后的纳米孔(B图)的透明度明显变低。图4的C、D是修饰金膜前后，玻璃纳米孔的能谱点扫描的对比表征图；从图中可以看出，相较于未经修饰的纳米孔(C图)，覆盖了金膜之后的纳米孔(D图)上，出现了Au元素，进一步证明了金膜的成功修饰。

图5是本发明实施例1制备玻璃纳米孔传感器过程中，修饰了金膜的能谱面扫描表征图。A为修饰了金膜的玻璃纳米孔尖端的暗场透射电子显微镜TEM的表征图；B、C、D分别为Au(B图)、O(C图)、Si(D图)三种元素的表征图，其中O、Si是硼硅酸盐毛细管材质中固有的。将B图与A、C、D图对比可以看出，修饰的金膜呈现出和锥形纳米孔完美贴合的形态。

图6是本发明实施例1制备玻璃纳米孔传感器逐步修饰过程中，Au(A图)、S(C图)、N(B图)、Zn(D图)四种元素的X射线光电子能谱分析XPS的跟踪表征图；其中，ⅰ是第一步金膜修饰完毕，即Au；ⅱ是第二步在金膜上结合半胱胺完毕，即Au/Cys；ⅲ是第三步在半胱胺上连接原卟啉完毕，即Au/Cys/PP；ⅳ是第四步在原卟啉上络合锌离子完毕，即Au/Cys/PP-Zn。从A图的跟踪表征图中，可以看到从ⅰ开始后都出现了金元素的两个特征峰，证明金膜的修饰成功；从C图和B图可以看出，从ⅱ开始出现了S元素的特征峰和N元素的特征峰，证明半胱胺的结合成功；同时，因为原卟啉中含有大量的N元素而不含S元素，C图中S元素峰的轻微降低和B图中N元素峰的轻微升高，证明了原卟啉的连接成功；从D图中可以看出，ⅳ中出现了Zn元素的峰，证明锌离子的络合成功；B、C、D的ⅴ曲线可以看出，·OH的出现，使N元素、S元素、Zn元素的峰消失，即半胱胺和带锌离子的原卟啉分子脱落，证明了·OH内剪切半胱胺碳链，导致带正电的原卟啉分子离开材料表面，这一原理具有可行性。

图7是本发明实施例1制备玻璃纳米孔传感器过程中修饰10uM原卟啉的紫外吸收光谱图(因在纳米孔内原位修饰无法测固体紫外吸收光谱，因此，该测定过程由以下方法代替：在平板玻璃上模拟修饰过程测定紫外吸收光谱，修饰步骤和用量和实施例1制备玻璃纳米孔传感器完全相同，目的是证明原卟啉可以通过本发明所述方法连接上去)。图中是逐步修饰的固体紫外吸收光谱图，其中ⅰ是第一步金膜修饰完毕，即Au；ⅱ是第二步在金膜上结合半胱胺完毕，即Au/Cys；ⅲ是第三步在半胱胺上连接原卟啉完毕，即Au/Cys/PP。主图在ⅲ中出现原卟啉的特征吸收峰，证明原卟啉连接成功。

图8是本发明实施例1制备玻璃纳米孔传感器过程中，传感原理用Zeta电位进行演示的结果图。即在中性溶液中，不同浓度的·OH(横坐标)与Au NCs/Cys/PP-Zn²⁺颗粒相互作用，导致的Zeta电位变化。最初，8mmol/LAuNCs的Zeta电位为-4.38mV，和图9镀上金膜的纳米孔呈现负整流的表现一致；当AuNCs和Cys孵育8h之后，AuNCs/Cys的Zeta电位由-4.38mV上升为-1.11mV，同图9的电流上升趋势表现一致；进一步地，当AuNCs/Cys表面结合上原卟啉之后，AuNCs/Cys/PP的Zeta电位上升为4.63mV，同图9的电流上升趋势表现一致；最后，当锌离子连接上之后，AuNCs/Cys/PP-Zn²⁺的Zeta电位上升为8.53mV，同图9的电流上升趋势表现一致。整个Zeta电位实验的目的，一是为了证明上述逐步修饰的Zeta电位的变化趋势和图9的电化学表征数据吻合，证明图9的逐步修饰的电化学表征是正确的；二是为了证明图10A和图8的电流变化趋势相同，因此图10A羟基自由基引起的电流变化也是正确的；从图中趋势可以分析得出，·OH的浓度越大，带正电的原卟啉分子脱落得越多，颗粒表面的电位越负。进一步验证了·OH内剪切半胱胺碳链，导致带正电的原卟啉分子离开材料表面这一原理的可行性。

图9是本发明实施例1制备玻璃纳米孔传感器过程中逐步修饰过程的离子整流表征图。未经修饰的玻璃纳米孔内壁由于硅羟基的解离，使得玻璃内壁表面带上负电荷，因此呈现负整流(图中的“空管”曲线)；镀上金膜的纳米孔内壁，由于镀金膜使用的氯金酸溶液里包含大量氯离子，使得玻璃内壁表面进一步带上大量负电荷，故负整流的程度更深了(图中的“Au”曲线)；在金膜上结合了半胱胺的纳米孔内壁，半胱胺的pKa＝8.23，在pH7.0的电解质溶液中发生氨基的质子化，故整流的方向正向移动(图中的“Au/Cys”曲线)；在半胱胺上连接了原卟啉的纳米孔内壁，由于原卟啉上的烃氨基发生质子化，故整流的方向继续正向移动(图中的“Au/Cys/PP”曲线)；最后给原卟啉连接了锌离子的纳米孔内壁，由于锌离子使纳米孔内壁带上了正电荷，故整流方向进一步正向移动(图中的“Au/Cys/PP/Zn²⁺”曲线)。

图10是本发明实施例1制备的玻璃纳米孔传感器用于检测水溶液中·OH浓度的离子整流曲线图、及·OH浓度与电流的线性关系；其中，图10A是0～145nM的·OH产生的离子整流信号，从图中可以看出，·OH的浓度越大，带正电的原卟啉分子脱落得越多，电流负值越大；

图10B是·OH的浓度与电流的线性关系。

图11是本发明实施例4制备的玻璃纳米孔传感器的选择性和竞争性实验图。

图12是本发明实施例3制备的玻璃纳米孔传感器的插入细胞前后，细胞的存活率实验图。

图13是本发明实施例2制备的玻璃纳米孔传感器的检测细胞质中·OH浓度的离子整流图。

图14是本发明实施例5制备的玻璃纳米孔传感器的的稳定性实验图。

图15是本发明实施例6制备的玻璃纳米孔传感器的的重现性实验图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1利用Fenton反应检测水溶液中产生的·OH

(1)玻璃纳米孔传感器的制备

使用拉制仪拉制出孔径70nm，锥形纳米孔角度5°的玻璃锥形纳米孔，注入8mmol/L氯金酸的乙醇溶液(V_氯金酸∶V_乙醇＝3∶2)10μL，254nm的紫外灯下照射2h，用乙醇清洗纳米孔，室温晾干，100℃下烘烤1h，使金膜被牢固地覆盖在纳米孔内壁上。然后配置10^-2mol/L的半胱胺盐酸盐的乙醇溶液，注入纳米孔10μL，室温下静置8h，使半胱胺分子中的巯基通过Au-S键与金膜结合，之后用乙醇清洗，去除多余的或结合不牢固的半胱胺。最后，取混合了EDC和NHS的原卟啉溶液(10^-5mol/L)，(取市售的原卟啉粉末，用DMF作溶剂，配成3mL，10^-5mol/L的原卟啉溶液，并加入0.005g EDC和0.01gNHS作催化剂；取配好的溶液10μL使用)注入纳米孔，在EDC和NHS的催化作用下，原卟啉中的-COOH与半胱胺中的-NH₂发生酰胺反应，使原卟啉分子被连接到半胱胺上，室温下反应15h后，洗涤以除去未结合或结合不牢固的原卟啉，即制备得到·OH玻璃纳米孔传感器。

(2)水溶液·OH的检测

检测前，先向玻璃纳米孔传感器内注入10^-4mol/L的Zn²⁺溶液，室温(25℃±3℃)下，静置8h，移去未结合或结合不牢固的Zn²⁺溶液，并用蒸馏水洗涤。然后再向孔内注入pH7.0的电解质溶液(含有0.1mol/LKCl，pH7.0，10mmol/L的HEPES缓冲溶液)。

将本实施例(1)中制备好的纳米孔传感器插入含·OH的水溶液，获得离子整流曲线，-1V下电流的变化来检测·OH，如图10所示。其中，图10A是纳米孔传感器对不同浓度的羟基自由基产生的离子整流响应信号；图10B是羟基自由基的浓度与-1V时电流比率值的关系。

从图10A中可以看出，待测体系中·OH的浓度越大，其-1V时的电流越低，离子整流曲线随目标分子浓度的变化呈现规律性变化。原因是·OH专一性地切割半胱胺碳链，使带正电的原卟啉分子离开纳米孔内壁，纳米孔内壁的表面电荷减少，整流曲线负向移动。从图10B中可以看出，·OH的浓度与-1V时电流的比率值之间存在良好的线性关系，横轴x代表·OH的浓度，单位nmol/L(nM)，纵轴y代表比率，比率Ratio＝|(I-I₀)/I₀|，其中，I为含羟基自由基的待测溶液在-1V下的电流值，I₀为·OH浓度为0时候的-1V的电流值，线性方程为：y＝0.05153x+0.16898，其中y为比率，x为·OH的浓度，单位nM。

本实施例中，Fenton反应制备·OH的步骤：将硫酸亚铁固体和30％过氧化氢溶液，按照Fe²⁺:H₂O₂＝1:6的比例混合，在酸性条件下，H₂O₂在Fe²⁺的催化作用下产生具有高反应活性的羟基自由基(·OH)，得到的·OH的量与二价铁的量相同，配制5nM～145nM的·OH。将纳米孔插入溶液体系，待Fenton反应产生的·OH与内壁充分作用后，读取离子整流信号。其中，离子整流曲线的获得步骤包括：搭建好三电极体系后，确认电极插入待测溶液中，选择“Linear Sweep Voltammetry”，开始扫描，数秒后扫描结束，电化学工作站自动绘制出离子整流曲线。

实施例2利用药物刺激、抑制细胞，检测细胞中的·OH

(1)玻璃纳米孔传感器的制备

制备方法同实施例(1)。

(2)细胞中·OH的检测

检测前，先向玻璃纳米孔传感器内注入10^-4mol/L的Zn²⁺溶液，室温(25℃±3℃)下，静置8h，移去未结合或结合不牢固的Zn²⁺溶液，并用蒸馏水洗涤。然后再向孔内注入pH7.0的电解质溶液(含有0.1mol/LKCl，pH7.0，10mmol/L的HEPES缓冲溶液)。

RAW264.7小鼠单核巨噬细胞在细胞培养基(成分包括10％牛血清白蛋白，100unit/mL的盘尼西林，100ug/mL的链霉素)，37℃下，5％的CO₂的培养箱中培养，在测试的前一天，将细胞转移至直径35mm，高度14mm的培养皿中，使细胞粘附并自由生长24h。测试之前，在共聚焦显微镜下，用200nM的Deep Red FM对细胞线粒体所在区域即细胞质进行染色。

将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7分为三组，第一组加入LPS刺激细胞发炎(1μg/mL的LPS作用1h)，产生超量的·OH；第二组加入LPS之前，加入0.1％(质量百分含量)DMSO抑制细胞产生·OH；第三组不加入任何药物，作为对照组。将本实施例(1)制备的玻璃纳米孔插入细胞的相应区域(线粒体所在区域)，15min后取出，通过离子整流曲线记录纳米孔内壁表面电荷的变化，实现细胞内·OH的检测，如图13所示。

其中，离子整流曲线的获得步骤包括：搭建好三电极体系后，确认电极插入待测溶液中，选择“Linear Sweep Voltammetry”，开始扫描，数秒后扫描结束，电化学工作站自动绘制出离子整流曲线。

图13中，a曲线是本实施例制备的纳米孔传感器插入细胞的细胞质之前的离子整流曲线，b曲线是插入未使用任何药物的细胞的细胞质的离子整流曲线(对照组/第三组)，d曲线是插入用LPS刺激的细胞的细胞质的离子整流曲线(第一组)，c图是插入先用DMSO处理，再用LPS刺激的细胞的细胞质的离子整流曲线(第二组)。从图中可以看出，自然状态下细胞的细胞质中的·OH浓度为45nM；用LPS刺激后，细胞中·OH急剧升高；而DMSO可以有效地起到抑制细胞生成·OH的作用。实验结果说明，本发明纳米孔传感器灵敏度高，实用性很强，可以应用到单细胞中进行检测。

实施例3无损插细胞实验

(1)玻璃纳米孔传感器的制备

制备方法同实施例(1)。

(2)无损插细胞实验

检测前，先向玻璃纳米孔传感器内注入10^-4mol/L的Zn²⁺溶液，室温下，静置8h，移去未结合或结合不牢固的Zn²⁺溶液，并用蒸馏水洗涤。然后再向孔内注入pH7.0的电解质溶液(含有0.1mol/LKCl，pH7.0，10mmol/L的HEPES缓冲溶液)。

本实施例采用的是Hela cell海拉细胞，培养方式和实施例2小鼠单核巨噬细胞RAW264.7相同。实验前，将细胞用荧光染料进行染色：Calcein-AM被用来给活细胞染色，PI被用来给死细胞染色。将玻璃纳米孔传感器插入细胞15min后再取出，通过荧光图来对比活细胞、死细胞数量的变化，实验结果如图12所示，细胞在被插入玻璃纳米孔传感器前后的存活率对比结果显示，本实施例制备的玻璃纳米孔传感器的插入不会导致细胞死亡。

实施例4选择性和竞争性实验

(1)玻璃纳米孔传感器的制备

制备方法同实施例(1)。

(2)选择性实验

检测前，先向玻璃纳米孔传感器内注入10^-4mol/L的Zn²⁺溶液，室温下，静置8h，移去未结合或结合不牢固的Zn²⁺溶液，并用蒸馏水洗涤。然后再向孔内注入pH7.0的电解质溶液(含有0.1mol/LKCl，pH7.0，10mmol/L的HEPES缓冲溶液)。

为了模仿细胞内环境，排除细胞中细胞裂解物lysate和其他种类的ROS/RNS分子ClO^-、¹O₂、O₂ ^·、ROO^·、H₂O₂、ONOO^-对检测·OH的干扰，本发明分别进行了选择性实验和竞争性实验。

在选择性实验中，本发明分别配制0.1mM单一的(lysate、ClO^-、¹O₂、O₂ ^·、ROO^·、H₂O₂、ONOO^-)，和16nM的·OH溶液。将本实施例制备的纳米孔传感器分别插入上述单一溶液中，并对响应信号的Ratio值进行比较。

在竞争性实验中，本发明分别配制其他种类ROS/RNS和·OH的混合溶液(即0.1mM的其他种类ROS/RNS和16nM的·OH。将本实施例制备的纳米孔传感器分别插入各混合溶液中，并对响应信号的Ratio值进行比较。

实验结果如图11选择性试验结果图。其中，图11A为选择性实验结果，数据表明，即使干扰性物质的浓度大于目标分子浓度10³倍，本实施例制备的纳米孔传感器对其他种类ROS/RNS分子的电化学信号响应微乎其微。图11B为竞争性实验结果，在其他种类ROS/RNS分子与·OH同时存在，且其他种类ROS/RNS分子的浓度大于·OH浓度10³倍的情况下，本实施例制备的纳米孔传感器的电化学信号响应信号没有明显改变。

实施例5稳定性试验

(1)玻璃纳米孔传感器的制备

制备方法同实施例(1)。

(2)稳定性实验

检测前，先向玻璃纳米孔传感器内注入10^-4mol/L的Zn²⁺溶液，室温下，静置8h，移去未结合或结合不牢固的Zn²⁺溶液，并用蒸馏水洗涤。然后再向孔内注入pH7.0的电解质溶液(含有0.1mol/LKCl，pH7.0，10mmol/L的HEPES缓冲溶液)。

每隔5h，将一支新的玻璃纳米孔传感器插入浓度为3nM的·OH溶液中。

实验结果如图14稳定性试验结果图，该实验证明了本发明制备的纳米孔传感器具有良好的稳定性。

实施例6重现性实验

(1)玻璃纳米孔传感器的制备

制备方法同实施例(1)。

(2)重现性实验

检测前，先向玻璃纳米孔传感器内注入10^-4mol/L的Zn²⁺溶液，室温下，静置8h，移去未结合或结合不牢固的Zn²⁺溶液，并用蒸馏水洗涤。然后再向孔内注入pH7.0的电解质溶液(含有0.1mol/L KCl，pH7.0，10mmol/L的HEPES缓冲溶液)。

随机抽取5支玻璃纳米孔传感器，插入RAW 264.7细胞的细胞质中，15min后取出，分别得到所有5支玻璃纳米孔传感器的离子整流曲线，实验结果如图15所示。以上实验证明，纳米孔传感器在细胞检测中具有良好的重现性。同时该实验还说明，插入细胞，细胞里的内容物不会堵塞纳米孔电极。其中，A、B、C、D、E分别指代随机抽取的5支传感器。

上述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的范围。凡依据本发明所做的等效变化与修饰，都应为本发明的保护范畴。

Claims (17)

1.一种检测·OH的玻璃纳米孔的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)对玻璃管用拉制仪拉制，形成玻璃纳米孔；

(2)在步骤(1)得到的纳米孔内壁均匀镀上一层金膜；

(3)在步骤(2)的基础上，通过Au-S键的强相互作用，在已镀金膜的纳米孔内壁修饰上半胱胺分子；

(4)在步骤(3)的基础上，利用酰胺反应，将原卟啉分子共价连接到半胱胺上，获得内壁功能化的玻璃纳米孔传感器。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述玻璃管外径1.0mm～1.2mm，内径0.5mm～0.9mm；为内置引流管的毛细管。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述拉制参数设置为：HEAT＝320，Fil＝4，VEL＝40，DEL＝180，PUL＝225。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述玻璃纳米孔的孔径为30nm～200nm。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述玻璃纳米孔为锥形纳米孔，所述锥形纳米孔的角度为2°～10°。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，在纳米孔内壁均匀镀上金膜的方法是紫外光照还原法。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述紫外光照还原法为：采用浓度为5mmol/L～50mmol/L的氯金酸的乙醇溶液，其中V_氯金酸∶V_乙醇＝3∶2，将玻璃纳米孔抽真空，在200nm～400nm的紫外光下照射1h～5h，80℃～200℃下烘烤1h～10h修饰而成。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，在已镀金膜的纳米孔内壁修饰半胱胺的方法是，将半胱胺的乙醇溶液或半胱胺盐酸盐的乙醇溶液注入纳米孔，抽真空，在温度5℃～40℃静置40min～12h，使半胱胺分子中的巯基通过Au-S键与金膜结合，即可在已镀金膜的纳米孔内壁修饰上半胱胺分子。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述半胱胺的乙醇溶液或半胱胺盐酸盐的乙醇溶液的浓度为10^-3～10^-1mol/L。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的修饰半胱胺的步骤，使用的是10^-2mol/L的半胱胺盐酸盐的乙醇溶液，室温下，反应8h，修饰而成。

11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，向纳米孔中注入原卟啉溶液，在温度8℃～40℃下进行酰胺反应，连接上原卟啉分子，获得内壁功能化的玻璃纳米孔传感器。

12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述原卟啉溶液中是混合了EDC和NHS作催化剂的10^-5mol/L的原卟啉溶液。

13.由权利要求1-12之任一项所述制备方法得到的检测·OH的玻璃纳米孔传感器。

14.根据权利要求13所述的玻璃纳米孔传感器在检测·OH中的应用。

15.一种由权利要求13所述的玻璃纳米孔传感器检测·OH的方法，具体操作如下：

向制备好的纳米孔传感器内注入电解质溶液，通过加入含·OH的溶液，切断半胱胺碳链，导致正电荷的原卟啉分子从纳米孔内壁脱落下来，引起表面电荷变化，通过离子整流曲线记录纳米孔内壁表面电荷的变化，从而实现对·OH的检测。

16.根据权利要求15所述的检测·OH的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)检测前，向玻璃纳米孔传感器内注入10^-2～10^-6mol/L的Zn²⁺溶液，5℃～40℃，静置4～12h，移除未结合或结合不牢固的Zn²⁺溶液，并用蒸馏水洗涤；

(b)向步骤(a)中玻璃纳米孔传感器内注入电解质溶液；

(c)测试时，玻璃管内外的电解质溶液相同，在电化学工作站内搭建三电极工作体系，两根Ag|AgCl电极被用来给纳米孔施加电压，将一根Ag|AgCl电极插入玻璃纳米孔中，作为工作电极，另一根Ag|AgCl电极置于外部溶液中，作为参比/对电极；电压记录范围为-1V—+1V，电压阶跃幅度是50mV；当玻璃纳米孔传感器与体系接触时，体系中的·OH专一性地切割半胱胺的碳链，使带有正电荷的原卟啉分子从纳米孔内壁脱落下来，通过离子整流曲线记录纳米孔内壁表面电荷的变化，从而实现对·OH的高选择性检测。

17.根据权利要求16所述的检测·OH的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)检测前，向玻璃纳米孔传感器内注入10^-4mol/L的Zn²⁺溶液，5℃～40℃，静置8h，移除未结合或结合不牢固的Zn²⁺溶液，并用蒸馏水洗涤；

(b)向步骤(a)中玻璃纳米孔传感器内注入电解质溶液；

(c)测试时，玻璃管内外的电解质溶液相同，在电化学工作站内搭建三电极工作体系，两根Ag|AgCl电极被用来给纳米孔施加电压，将一根Ag|AgCl电极插入玻璃纳米孔中，作为工作电极，另一根Ag|AgCl电极置于外部溶液中，作为参比/对电极；电压记录范围为-1V—+1V，电压阶跃幅度是50mV；当玻璃纳米孔传感器与体系接触时，体系中的·OH专一性地切割半胱胺的碳链，使带有正电荷的原卟啉分子从纳米孔内壁脱落下来，通过离子整流曲线记录纳米孔内壁表面电荷的变化，从而实现对·OH的高选择性检测。

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