JP6022480B2 - 分子インプリント導電性ポリマフィルム付き水性アミノ酸センサー - Google Patents
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Description
さらに、本発明は、分子インプリント導電性ポリマ(より詳しくはポリピロール)および金属酸化物修飾分子インプリント導電性ポリマフィルムをガラス状炭素電極(GCE:glassy carbon electrode)に被覆することを含むプロセスに関する。
特に、本発明は、特定のアミノ酸(より詳しくはL−チロシン及び/又はL−システイン)を他のアミノ酸の存在下で選択的に検出する分子インプリントポリピロールおよび金属酸化物修飾分子インプリントポリピロールフィルムをGCEに修飾することを含むプロセスに関する。
様々な化学修飾電極について、つまり、多層カーボンナノチューブ(MWCNT:multiwalled carbon nanotube)修飾GCE(Microchim. Acta 151(2005)47)、L−セリンポリマフィルム修飾GCE(Colloids & Surfaces B. Biointerfaces 50(2006)147)、MWCNT−4−アミノベンゼンスルホン酸修飾GCE(Colloids & surfaces B. Biointerfaces 61(2008)176)について言及されている。これらはチロシンの検出を目的とすることが記載されている。
Tangらは、L−チロシン、L−トリプトファンおよびL−システインの同時ボルタメトリー検出を目的とする電界紡糸カーボンナノファイバー修飾カーボンペースト電極の構成について報告している(Talanta 80(2010)2182)。
トリプトファンの検出を目的とする過酸化ポリピロール修飾カーボンペースト電極について言及されている(Anal. Sci.18 (2002) 417)。
また、水銀滴下電極を吊り下げて用いてチロシン(Fresnius J.Anal.Chem 351(1995)689)およびエンロフロキサシンを吸着ボルタメトリック定量することについて、さらに2
つの報告がされており、ボルタメトリック検出の間、銅(II)を用いることが記載されている。
吸着もしくは固定化したポリシロキサンが被覆されたバイオセンサー(Levon et. al Inter. Pat. No. WO 059507; 2005)、ピナコリル−メチル−ホスホネートを検出するモチーフを2重検出(表面プラスモン共鳴と蛍光検出)することを特徴とする化学センサー(Booksh et al, US Pat.No. 0031292; 2007)について言及されている。
有極性かつ有毒な種の検出を目的とする導電性ポリマが被覆された検出電極についての方法(Venkatasetty, US Pat.No.4,66,2,996;1987)、タンパク質が吸着した賦形性導電
性ポリマフィルム(Wolfgang et al, Euro.Pat.No.0658906;1994)、導電性ポリマであるポリアニリンのナノ粒子を含む基板から構成されるセンサー(Morrin et al, Int.Pub.No. WO2007/119229; 2007)、検体センサーを用いて検体濃度を定量する方法(Albarella et al, Euro.Pub. No. 0314009; 1988)について言及されている。検体センサーは、酵素
、抗原もしくはイオンが特異的結合部位に共有結合的に官能基化された導電性有機ポリマ
を用いており、液状媒質を選択的に分析する診断装置に採用される。
アミノ酸を検出する上述の基質の欠点は、選択性が欠如すること、安定性が乏しいこと、導電性ポリマまたはMWCNTやL−セリンなどの他の基質に選択的認識部分を組み込む必要があることである。
また、電気的に合成された分子インプリントポリマが修飾された電極についていくつか言及されている。すなわち、ドーパミンの検出を目的とするo−フェニレンジアミンとレゾルシノールとの共重合(J.Solid state chem. 14(2010)1909)、アスコルビン酸の検出を目的とするポリピロール(Sensors 8(2008)5792)、サルファメトキサゾールの検出を
目的とする過酸化ポリピロール(Sensors 8(2008)8463)、そして、アトラジンの検出を
目的とする白金電極に用いられる分子インプリントポリ−3,4−エチレンジオキソチオフェン、共通するチオフェン酢酸(Anal.Chim Acta 649(2009)236)について言及されて
いる。
No.0105076; 2010)、フェノール、モルヒネおよびフェノキシ酸系除草剤の検出を目的
とする、合成ポリマが修飾された親和性電極(Kroger & Mosbach GB Pat. No. 2337332;
1999)、コレステロールの分子インプリントが被覆されたISFET付き電位差測定セ
ンサーの製造方法(Vanaja et al, US Pat No. 0147683; 2010)、γヒドロキシ酪酸(GHB)、ケタミンおよびコルチゾールのような薬物の検出を目的とする分子インプリントセンサー装置(Murray et al US Pat. No.0197297; 2009)、電気化学振動子の生物工学
的ナノ検出フィルム(Zhou et al Chinese Pat.No.CN101196486; 2008)、ポリマを識別
する高分子の製造方法(Minoura et al, US Pat. No. 7741421; 2010)、放出サイトが合成されたペプチドインプリントポリマ(PIPIES)(Bright, US Pat. No.7598087; 2009)、癌バイオマーカーの検出を目的とする、チップ表面に被覆された金上の表面分子インプリント(SMI)と自己組織化単分子層(SAM)の生産物とを結合する方法(Levon et al US Pat. No.0318788; 2009)、そして、水媒体中で認識をインプリントする(刷り込みする)方法(Naraghi et al US Pat. No. 0099301; 2009)について言及されて
いる。
MIPは、生体外の診断装置において、標的分子を捕捉するテンプレート分子を解離する接着剤として説明されている(Meathrel et al US Pat. No. 0068820; 2010)。
しかしながら、本態様は、さらなる利点を有している。その利点は、インプリントポリマの高い選択性と、導電性ポリマつまりシグナル変換を大幅に改善するポリピロールの優れた導電特性とを同調させることである。
また、本態様は、金属酸化物により触媒活性が改良されており、高い感度および優れた選択性を有する優れた検出プラットフォームとなる。
サー」を提供し、これにより上述の欠点を解決することである。
本発明の別の目的は、GCE表面に分子インプリント導電性ポリマ(MICP)フィルムを作成することである。
本発明のさらに別の目的は、Cu2+,Hg2+,Pd2+,Au3+,Pt4+の存在下でGCE表面に金属酸化物修飾MICPフィルムを形成することである。
本発明のさらに別の目的は、L−チロシン及び/又はL−システインを他のアミノ酸の存在する水媒体中で測定するL−チロシン及び/又はL−システインセンサーを作成することである。
本発明のさらに別の目的は、MICP、及びGCE表面に被覆された金属酸化物修飾MICPフィルムを再利用および再生することである。
したがって、本発明は、分子インプリント導電性ポリマ(MICP)または金属酸化物修飾分子インプリント導電性ポリマ(MOMICP)から選択されるポリマが被覆された基板を備えるアミノ酸センサーに関する。
(a)L−チロシン、L−システインおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸のテンプレートの存在下で、前記テンプレートが、前記基板上の過塩素酸テトラブチルアンモニウム及びトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルにインプリントされるように、ピロールモノマーを電解重合して、分子インプリント導電性ポリマフィルム付き電極を得る;
(b)電気化学的に過酸化して、続いてpH2のリン酸緩衝液で循環することで洗浄し、その後pH5.5のリン酸緩衝液で安定化することによって、前記ステップ(a)で得られた電極から前記テンプレートを取り除き、前記テンプレートが取り除かれたMICPまたは2重テンプレートが取り除かれたMICPフィルムが被覆された電極を得る;
(c)前記ステップ(b)で得られた前記テンプレートが取り除かれて安定化されたMICPまたは二重テンプレートが取り除かれたMICP電極上に、Cu2+、Hg2+、Pd2+、Au3+、Pt4+からなる群から選択される金属を析出させ、続いて陽極スキャン
することにより、それぞれの金属酸化物修飾分子インプリント導電性ポリマフィルムが被覆され、アミノ酸センサーとして用いられる電極を得る。
を20ml、前記トリフルオロ酢酸の量を0.5以上35μl以下、前記過塩素酸テトラブチルアンモニウムの濃度を0.01以上0.1M以下とする。
度を40から70mV/sとして、少なくとも100回、電気化学的に過酸化する。
対して0以上0.9V以下、走査速度を75以上125mV/s以下として、少なくとも75回、リン酸緩衝溶液中で循環することにより洗浄する。
から0.15Mのリン酸緩衝液中に既知量のアミノ酸を含む電気化学セルに浸し、続いて50以上300mV以下の振幅変調で電位0V以上0.9V以下をスキャンして示差パルスボルタモグラムを記録することにより、作用電極および対電極間の電流をアミノ酸の濃度に対してプロットして校正グラフを作成する。
i)前記ステップ(b)又はステップ(c)で得られたアミノ酸センサーとしての前記被覆された電極を、pH5.5からpH7.0で分析されるサンプルを含む電気化学セルに挿入し、続いて50以上300mV以下の振幅変調で電位0以上0.9V以下をスキャン
して示差パルスボルタモグラムを記録する;
ii)校正グラフを参照することにより、アミノ酸の未知濃度を定量する。
・適切な基板、好ましくはガラス状炭素ディスク又は電極上に分子インプリント導電性ポリマ(MICP)を用いる、アミノ酸を検出する修飾電極を作成するプロセス;
・MICPを過酸化、洗浄および安定化すること;
・テンプレートが取り除かれたMICPを金属酸化物で修飾すること(Cu2+、Hg2+、Pd2+、Au3+、Pt4+等の溶液から金属を電解析出することにより)、および陽
極酸化すること;
・L−チロシン及び/又はL−システインをその他のアミノ酸の存在下で選択的に検出すること。
上述のアミノ酸検出フィルムは、指示電極上にディスク状に被覆されて、過酸化、洗浄および安定化のステップによりアミノ酸テンプレートを取り出した後、水溶液中の標的アミノ酸を選択的に検出する。
テンプレートの存在しない環境で作成されたNICPは、インプリントされた空洞に検体が再結合することにより検出を引き起こすようなMICPとは違って、検体を表面に吸着することで検出を示す。
しかしながら、NICPは、検体とは特別に結合しないことから選択性に乏しい。本発明は、以下の顕著な特徴を有する。
・MICP、および金属酸化物修飾MICPフィルムが被覆されたGCEを作成するプロセスが特徴的である。金属酸化物の電極触媒効果は、MOMICPの場合、分析信号を増幅させることに加えて、MICPによる選択性を生じさせる。
・MICPの場合、フィルムの前処理(過酸化、洗浄および安定化)が行われる(テンプレート分子を取り出すため)。
・水溶液中の標的アミノ酸を選択的に検出することが特徴的である。
ガラス状炭素電極上に、適合する分子インプリント導電性ポリマ(MICP)フィルムを作成するには、以下のように行う。
i)テンプレート:L−チロシン及び/又はL−システインが存在し、0.01Mの過塩素酸テトラブチルアンモニウムを含有するアセトニトリル媒体中で、ピロールモノマーを電解重合する(テンプレートの溶解を促進するためトリフルオロ酢酸の存在下で)。
図1及び図2は、MICPフィルム付きL−チロシン及び/又はL−システインセンサーの作成プロセスのフロー図および概要図を示す。ノンインプリント導電性ポリマ(NI
CP)フィルムは、テンプレート分子を取り除く以外は上述の手段に従って、類似の方法で作成された。
金属酸化物修飾MICPフィルムは、アミノ酸テンプレートが取り除かれたMICPフィルムを、pH5.5のリン酸緩衝液中においてCu2+、Hg2+、Pd2+、Au3+、Pt4+等のそれぞれの金属イオンの存在下で−0.30Vで5秒間、処置し、陽極スキ
ャンすることにより、作成された(図2を参照)。
ある金属イオン/酸化物が所定の電極触媒特性を示すことを考慮して、金属イオンを組み込むことにより、分析信号を強めることができる。
金属酸化物の島の電極触媒作用は、図2に示すように、金属−アミノ酸錯体形成と同様に電極−溶液界面でL−チロシンの酸化を促進させて、結果的に陽極のピーク電流を増大させる。
ii)フィルムの前処理
図1では、MICPおよびNICPフィルムの前処理を含む詳細なステップについてフロー図の形式で強調されている。
MICP及びNICPフィルムは、テンプレートを取り除くため、0.1MのNaOH溶液中において0.8から1.2Vで100回、動電位による電気化学的過酸化が行われる。
それから、フィルムは、弱酸性のリン酸緩衝液において0以上0.9V以下の範囲内の電位で循環させることを75回繰り返すことにより洗浄される。そして、pH5.5のリン酸塩媒体において0V以上0.9V以下の範囲内の電位で循環させることを20回繰り返すことにより安定化される。これにより、取り除かれたフィルムを得る。
iii)選択的検出
アミノ酸(L−チロシン及び/又はL−システイン)センサーを作成するプロセスは、図1及び図2に図式的に示される。結果的に生じるセンサーは、検体であるアミノ酸と、その他のアミノ酸とを識別する。アミノ酸(より詳しくはL−チロシン)の検出信号におけるpHの影響を図3に示す。
20mlの電気化学セルに、0.1Mのリン酸緩衝液(pH5.5)におけるL−チロシン及び/又はL−システインの適当量(1×10−8から8×10−6M)を添加する。作用電極がNICP、MICP及びMOMICPフィルム被覆電極である3電極系を電気化学セルに入れる。
振幅変調を100mVとして0から0.9Vの電位窓でスキャンすることにより、示差パルスボルタモグラムを記録する。
校正グラフを参照することにより、L−チロシン及び/又はL−システインの未知濃度を定量する。
銅酸化物修飾MICP及び関連するNICPが被覆されたGCEを用いて、L−チロシン及び他のアミノ酸に対する選択性について詳細に研究を行った。
得られた結果を図4A及び4Bのそれぞれに示す。
混合物におけるL−チロシンの選択性係数は、それぞれ、セリン、システイン、バリン、フェニルアラニン及びロイシンと比較して約50から60倍、D−チロシンと比較して1.2倍、トリプトファンに対して1.5倍を示す。
分子インプリントでは、単独および混合物(主に本物のサンプル溶液をシミュレーションした)にかかわらず、選択性係数が高い結果となっており、重要なインプリント効果が示される。
表1に、ヒト合成尿のサンプルを分析した結果を示す。
ヒト尿サンプルに相当する割合となるように、8×10−7Mのセリン、8×10−7Mのアラニン、4×10−7Mのバリン、4×10−7Mのフェニルアラニン及び4×10−7Mのロイシンをそれぞれ混合し、疑似合成尿のサンプルを作成した。
上述の合成サンプルを含む0.1Mのリン酸緩衝液(pH5.5)におけるL−チロシンの適当量(1×10−7から4×10−6M)を20mlの電気化学セルに添加する。作用電極としてのMOMICPと、対電極としての白金箔と、参照電極としてのAg/AgClとからなる3電極系を電気化学セルに入れる。
振幅変調を100mVとして0から0.9Vの電位窓でスキャンすることにより、示差パルスボルタモグラムを記録する。
L−チロシンのピーク電位で作用電極と白金箔対電極との間に流れる電流により描かれる校正グラフを参照することにより、L−チロシンの未知濃度を定量する。
表1に示すように、混入されたサンプルが定量的に回収されることが確認された。
発達した検出方法は、ヒト尿サンプルにおいてL−チロシンを分析することに適用される。
尿サンプルの存在する0.1Mのリン酸緩衝液(pH5.5)におけるL−チロシンの適当量(1×10−6および2×10−6M)を20mlの電気化学セルに添加する。作用電極としてのMOMICPと、対電極としての白金箔と、参照電極としてのAg/AgClとからなる3電極系を電気化学セルに入れる。
振幅変調を100mVとして0から0.9Vの電位窓でスキャンすることにより、示差パルスボルタモグラムを記録する。
L−チロシンのピーク電位で作用電極と白金箔対電極との間に流れる電流により描かれる校正グラフを参照することにより、L−チロシンの未知濃度を定量する(表2を参照)。
表2では、ヒト尿サンプルに対して既知量のチロシンを混入しても定量的に回収することが示されている。
(実施例1)
10−3MのL−チロシンテンプレートが存在し、0.01Mの過塩素酸テトラブチルアンモニウム及び35μlのトリフルオロ酢酸を含む、支持電解質としてのアセトニトリル20ml中で、0.002M(0.134μg/ml)のピロールをガラス状炭素電極上に電解重合することによって、MICPフィルムを作成した。このとき、析出電位をAg/AgClに対して0.9V、時間を60秒とした。
それから電極を取り出した。そして、水酸化ナトリウム(>0.1M)中で、電位窓をAg/AgClに対して0.8から1.2V、走査速度を50mV/sとして、少なくと
も100回、循環を繰り返すことにより電気化学的な過酸化を行い、テンプレートを取り除いた。
テンプレートが取り除かれたMICPフィルム電極を、電位窓をAg/AgClに対し
て0から0.9V、走査速度を100mV/sとして、少なくとも75回循環することにより洗浄した。
その後、上述のフィルム電極を、pH5.5のリン酸緩衝液中で、電位窓を0から0.9V、走査速度を50mV/sとして、少なくとも20回循環することにより安定化した。これにより、L−チロシンを検出するMICPフィルム付き電極を得た。
L−チロシン、L−システイン又はこれらの組み合わせのテンプレート10−3Mが存在し、0.01Mの過塩素酸テトラブチルアンモニウム及び35μlのトリフルオロ酢酸を含む、支持電解質としてのアセトニトリル20ml中で、0.003M(0.201μg/ml)のピロールをガラス状炭素電極上に電解重合することによって、MICPフィルムを作成した。このとき、析出電位をAg/AgClに対して0.9V、時間を60秒
とした。
それから電極を取り出した。そして、水酸化ナトリウム(>0.1M)中で、電位窓をAg/AgClに対して0.8から1.2V、走査速度を50mV/sとして、少なくと
も100回、循環を繰り返すことにより電気化学的な過酸化を行い、テンプレートを取り除いた。
テンプレートが取り除かれたMICPフィルム電極を、電位窓をAg/AgClに対し
て0から0.9V、走査速度を100mV/sとして、少なくとも75回循環することにより洗浄した。
その後、上述のフィルム電極を、pH5.5のリン酸緩衝液中で、電位窓を0から0.9V、走査速度を50mV/sとして、少なくとも20回循環することにより安定化した。これにより、L−チロシン、L−システイン又はこれらの組み合わせを検出するMICPフィルム付き電極を得た。
10−3MのL−チロシンテンプレートが存在し、0.01Mの過塩素酸テトラブチルアンモニウム及び35μlのトリフルオロ酢酸を含む、支持電解質としてのアセトニトリル20ml中で、0.004M(0.268μg/ml)のピロールをガラス状炭素電極上に電解重合することによって、MICPフィルムを作成した。このとき、析出電位をA
g/AgClに対して0.9V、時間を60秒とした。
それから電極を取り出した。そして、水酸化ナトリウム(>0.1M)中で、電位窓をAg/AgClに対して0.8から1.2V、走査速度を50mV/sとして、少なくと
も100回、循環を繰り返すことにより電気化学的な過酸化を行い、テンプレートを取り除いた。
テンプレートが取り除かれたMICPフィルム電極を、電位窓をAg/AgClに対し
て0から0.9V、走査速度を100mV/sとして、少なくとも75回循環することにより洗浄した。
その後、上述のフィルム電極を、pH5.5のリン酸緩衝液中で、電位窓を0から0.9V、走査速度を50mV/sとして、少なくとも20回循環することにより安定化した。これにより、L−チロシンを検出するMICPフィルム付き電極を得た。
アセトニトリル20ml中の過塩素酸テトラブチルアンモニウムを0.1Mとして、実施例1、2及び3と同様に電解重合してMICPフィルムを作成した。
電解重合中の析出電位を0.8Vとして、実施例1、2、3及び4と同様にMICPフィルムを作成した。
電解重合の時間を65秒として、実施例1、2、3、4及び5と同様にMICPフィルムを作成した。
電解重合の時間を55秒として、実施例1、2、3、4、5及び6と同様にMICPフィルムを作成した。
トリフルオロ酢酸を0.5μl、テンプレートのL−チロシンを10−5Mとして、実施例1、2、3、4、5、6及び7と同様にMICPフィルムを作成した。
(実施例9)
0.01Mの過塩素酸テトラブチルアンモニウム及び35μlのトリフルオロ酢酸を含む、支持電解質としてのアセトニトリル20ml中で、0.002M(0.134μg/ml)のピロールを電解重合することによって、NICPフィルムを作成した。このとき、析出電位をAg/AgClに対して0.9V、時間を60秒とした。
それから、電極を、水酸化ナトリウム(>0.1M)中で、電位窓をAg/AgClに
対して0.8から1.2V、走査速度を50mV/sとして、少なくとも100回、循環を繰り返すことにより、電気化学的な過酸化を行った。
NICPフィルム電極を、電位窓をAg/AgClに対して0から0.9V、走査速
度を100mV/sとして、少なくとも75回循環することにより洗浄した。
その後、上述のフィルム電極を、pH5.5のリン酸緩衝液中で、電位窓を0から0.9V、50mV/sとして、少なくとも20回循環することにより安定化した。これにより、L−チロシン及び/又はL−システインを検出するNICPフィルム付き電極を得た。
(実施例10)
L−チロシンの選択的検出に対応する金属酸化物被覆を形成するため、3×10−5MのCu2+、Hg2+、Pd2+、Au3+又はPt4+等の溶液から、テンプレートが取り除かれたMICPフィルム上に−0.3Vで5秒間、金属を定電位析出し、その後、0から0.9Vの電位窓で陽極スキャンすることにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
L−チロシンの選択的検出に対応する金属酸化物被覆を形成するため、1×10−4MのCu2+、Hg2+、Pd2+、Au3+又はPt4+等の溶液から、テンプレートが取り除かれたMICPフィルム上に−0.3Vで5秒間、金属を定電位析出し、その後、0から0.9Vの電位窓で陽極スキャンすることにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
時間を5秒、−0.28Vとして、実施例10及び11と同様に定電位析出することにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
時間を5秒、−0.32Vとして、実施例10及び11と同様に定電位析出することにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
時間を4秒、−0.3Vとして、実施例10及び11と同様に定電位析出することにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
時間を4秒、−0.28Vとして、実施例10及び11と同様に定電位析出することにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
時間を4秒、−0.32Vとして、実施例10及び11と同様に定電位析出することにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
(実施例17)
L−システインの選択的検出に対応する金属酸化物被覆を形成するため、テンプレートが取り除かれたMICPフィルム上に、3×10−5MのCu2+溶液を−0.3Vで5秒間、定電位析出し、その後0から0.9Vの電位窓で陽極スキャンすることにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
L−システインの選択的検出に対応する金属酸化物被覆を形成するため、テンプレートが取り除かれたMICPフィルム上に、1×10−4MのCu2+溶液を−0.3Vで5秒間、定電位析出し、その後0から0.9Vの電位窓で陽極スキャンすることにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
時間を5秒、−0.28Vとして、実施例17及び18と同様に定電位析出することに
より、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
時間を5秒、−0.32Vとして、実施例17及び18と同様に定電位析出することにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
時間を4秒、−0.3Vとして、実施例17及び18と同様に定電位析出することにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
時間を4秒、−0.28Vとして、実施例17及び18と同様に定電位析出することにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
時間を4秒、−0.32Vとして、実施例17及び18と同様に定電位析出することにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
(実施例24)
L−チロシン及びL−システインの選択的検出に対応する金属酸化物被覆を形成するため、3×10−5MのCu2+溶液から、テンプレートが抽出されたMICPフィルム上に−0.3Vで5秒間、定電位析出し、その後0から0.9Vの電位窓で陽極スキャンすることにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
L−チロシン及びL−システインの選択的検出に対応する金属酸化物被覆を形成するため、1×10−4MのCu2+溶液から、テンプレートが抽出されたMICPフィルム上に−0.3Vで5秒間、定電位析出し、その後0から0.9Vの電位窓で陽極スキャンすることにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
時間を5秒、−0.28Vとして、実施例24及び25と同様に定電位析出することにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
時間を5秒、−0.32Vとして、実施例24及び25と同様に定電位析出することにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
時間を4秒、−0.3Vとして、実施例24及び25と同様に定電位析出することにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
時間を4秒、−0.28Vとして、実施例24及び25と同様に定電位析出することにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
時間を4秒、−0.32Vとして、実施例24及び25と同様に定電位析出することに
より、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
(実施例31)
0.1Mのリン酸緩衝液(pH5.5)におけるL−チロシンの適当量(1×10−8および8×10−6M)を20mlの電気化学セルに添加した。それから、作用電極が、銅酸化物修飾MICPフィルムが被覆したガラス状炭素電極、対電極が白金(Pt)箔、そして参照電極がAg/AgClである、3電極系を電気化学セルに入れた。
振幅変調を100mVとして、0から0.9Vの電位窓でスキャンすることにより、示差パルスボルタモグラムを記録した。
校正グラフを参照することにより、L−チロシンの未知濃度を定量した。
(実施例32)
0.1Mのリン酸緩衝液(pH5.5)におけるL−システインの適当量(1×10−8から8×10−6M)を20mlの電気化学セルに添加した。それから、作用電極が、銅酸化物修飾MICPフィルムが被覆したガラス状炭素電極、対電極が白金箔、そして参照電極がAg/AgClである、3電極系を電気化学セルに入れた。
振幅変調を100mVとして、0から0.9Vの電位窓でスキャンすることにより、示差パルスボルタモグラムを記録した。
校正グラフを参照することにより、L−システインの未知濃度を定量した。
(実施例33)
0.1Mのリン酸緩衝液(pH5.5)におけるL−チロシン及びL−システインの適当量(1×10−8から8×10−6M)を20mlの電気化学セルに添加した。それから、作用電極が、銅酸化物修飾MICPフィルムが被覆したガラス状炭素電極、対電極が白金箔、そして参照電極がAg/AgClである、3電極系を電気化学セルに入れた。
振幅変調を100mVとして、0から0.9Vの電位窓でスキャンすることにより、示差パルスボルタモグラムを記録した。
校正グラフを参照することにより、L−チロシン及びL−システインの未知濃度を定量した。
(実施例34)
金属酸化物修飾MICPフィルム付きセンサーでは、実施例31、32、33のそれぞれで説明した定量方法を用いることにより、水溶液中にL−セリン、L−バリン、L−ロイシン、L−フェニルアラニン、L−チロシン及びL−システインの混合物などの他のアミノ酸が同じ量存在するときに、L−チロシン又はL−システインに対する選択的な応答が得られた(図4)。
(実施例35)
10−3MのL−チロシンテンプレートが存在し、0.01Mの過塩素酸テトラブチルアンモニウム及び35μlのトリフルオロ酢酸を含む、支持電解質としてのアセトニトリル20ml中で、0.002M、0.003Mおよび0.004Mのピロールをガラス状炭素電極上に電解重合することによって、MICPフィルムを作成した。このとき、析出電位をAg/AgClに対して0.9V、時間を60秒とした。
それから電極を取り出した。そして、水酸化ナトリウム(>0.1M)中で、電位窓をAg/AgClに対して0.8から1.2V、走査速度を50mV/sとして、少なくと
も100回、循環を繰り返すことにより電気化学的な過酸化を行い、テンプレートを取り除いた。
テンプレートが取り除かれたMICPフィルム電極を、電位窓をAg/AgClに対し
て0から0.9V、走査速度を100mV/sとして、少なくとも75回循環することにより洗浄した。
その後、上述のフィルム電極を、pH5.5のリン酸緩衝液中で、電位窓を0から0.9V、走査速度を50mV/sとして、少なくとも20回循環することにより安定化した。これにより、L−チロシンを検出するMICPフィルム付き電極を得た。
MICP修飾GC電極では、電位窓を0から0.9Vとして、示差パルスボルタモグラムをスキャンすることにより、L−チロシンを検出することができる。
検出面は、pH5.5のリン酸緩衝液中で1分以上5分以下撹拌して酸化チロシンを除去することによって再生され、未使用のMICPフィルムを被覆する前に25から35回
再利用できる。
実施例1〜8で説明したプロセスにより作成されるL−システイン、L−チロシン及びL−システインを検出するMICPフィルムでは、pH5.5のリン酸緩衝液中で撹拌して酸化チロシン及び/又は酸化システインを除去することによって再生され、未使用のMICPフィルムを被覆する前に30回再利用できる。
(実施例37)
10−3MのL−チロシン及び/又はL−システインテンプレートが存在し、0.01Mの過塩素酸テトラブチルアンモニウム及び35μlのトリフルオロ酢酸を含む、支持電解質としてのアセトニトリル20ml中で、0.003Mのピロールをガラス状炭素電極上に電解重合することによって、MICPフィルムを作成した(上述の実施例2と同様に)。このとき、析出電位をAg/AgClに対して0.9V、時間を60秒とした。
それから電極を取り出し、水酸化ナトリウム(>0.1M)中で、電位窓をAg/AgClに対して0.8から1.2V、走査速度を50mV/sとして、少なくとも100
回、循環を繰り返すことにより電気化学的な過酸化を行い、テンプレートを取り除いた。
テンプレートが取り除かれたMICPフィルム電極を、電位窓をAg/AgClに対し
て0から0.9V、走査速度を100mV/sとして、少なくとも75回循環することにより洗浄した。
その後、上述のフィルム電極を、pH5.5のリン酸緩衝液中で、電位窓を0から0.9V、走査速度を50mV/sとして、少なくとも20回循環することにより安定化した。これにより、L−チロシン及び/又はL−システインを検出するMICPフィルム付き電極を得た。
L−チロシン及び/又はL−システインの選択的検出に対応する金属酸化物被覆を形成するため、3×10−5MのCu2+、Hg2+、Pd2+、Au3+又はPt4+等の溶液から、−0.3Vで5秒間、金属を定電位析出し、その後0Vから0.9Vの電位窓で陽極スキャンすることにより、金属酸化物修飾MICPフィルムを作成した。
電極上に形成された金属酸化物の島は隔てており、分子インプリントポリピロール表面は、電極を−0.15から0.075Vの範囲の電位で7から10秒保持し(金属酸化物修飾MICPの場合)、続いてpH5.5のリン酸緩衝液中で1以上5分以下撹拌して酸化アミノ酸を除去する(あらゆる修飾電極で)ことにより、次の周期までに再び満たされる。
このプロセスは、検出基板を新しくすることなく、少なくとも25から35回繰り返すことができる。
実施例10〜30で説明されたプロセスを組み合わせることにより作成された金属酸化物修飾MICPフィルムは、上述の実施例37と同様に、再生および再利用が可能である。
電極上に形成された金属酸化物の島は隔てており、分子インプリントポリピロール表面は、電極を0Vで10秒保持し(金属酸化物修飾MICPの場合)、続いてpH5.5のリン酸緩衝液中で撹拌して酸化アミノ酸を除去する(あらゆる修飾電極で)ことにより、次の周期までに再び満たされる(金属酸化物修飾MICPの場合)。
このプロセスは、検出基板を新しくすることなく、少なくとも30回繰り返すことができる。
(実施例39)
全ての修飾電極は、以下のステップを組み合わせて用いることもできる。
i)実施例1〜8に記載のようにMICPを作成するプロセス
ii)実施例1〜8に記載のようにMICPフィルムを過酸化する
iii)実施例1〜8に記載のように調整して安定化する
iv)実施例10〜30に記載のように、金属酸化物被覆MICPフィルム(MOMICPs)を作成するプロセス
v)実施例10〜30に記載のように、電位窓を0Vから0.9Vとして示差パルスモー
ドで陽極スキャンする
vi)実施例31〜33に記載のように、アミノ酸(L−チロシン及び/又はL−システイン)を定量する
vii)実施例35〜38で説明されたステップに基づいて検出フィルムを再生および再利
用する。セリン、バリン、フェニルアラニン、システイン、ロイシンのような様々なアミノ酸の存在下におけるセンサーの選択性では、チロシンの選択性がそれぞれのアミノ酸に対して40倍以上であることが示されている。本発明のセンサーを、背景で述べた現行の電極と比較すると、選択性に優れていることが示される。
金属酸化物(Cu2+、Hg2+、Pd2+、Au3+、Pt4+等の)の修飾によるさら
なる利点は、ボルタメトリック検出の際の選択性を著しく高め、探知の限界を低減することである。
水溶液は、分子インプリントポリマを用いて生分子を検出する際の主な障害のうちの一つとなるが、全てのフィルム被覆センサーでは、水溶液との親和性が高い。
電極を0.0Vで10秒保持し、pH5.5のリン酸緩衝液で撹拌することにより、MICP及び金属酸化物修飾MICPフィルムを容易に再生する。
様々なフィルムで被覆されたGC電極は、再利用可能であり、L−チロシン及び/又はL−システインを順次または同時に示差パルス・ボルタメトリック検出できる。
Claims (14)
- 分子インプリント導電性ポリマ(MICP)または金属酸化物修飾分子インプリント導電性ポリマ(MOMICP)から選択されるポリマが被覆された基板を備えるアミノ酸センサーの作成プロセスであって、
(a)L−チロシン、L−システインおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸のテンプレートの存在下で、前記テンプレートが、前記基板上の過塩素酸テトラブチルアンモニウム及びトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルにインプリントされるように、ピロールモノマーを電解重合して、分子インプリント導電性ポリマフィルム付き電極を得るステップと、
(b)電気化学的に過酸化して、続いてpH2のリン酸緩衝液で循環することで洗浄し、その後pH5.5のリン酸緩衝液で安定化することによって、前記ステップ(a)で得られた電極から前記テンプレートを取り除き、前記テンプレートが取り除かれたMICPまたは2重テンプレートが取り除かれたMICPフィルムが被覆された電極を得るステップと、
(c)前記ステップ(b)で得られた前記テンプレートが取り除かれて安定化されたMICPまたは前記2重テンプレートが取り除かれたMICP電極上に、Cu2+、Hg2+、
Pd2+、Au3+、Pt4+からなる群から選択される金属を析出させ、続いて陽極スキャンすることにより、それぞれの金属酸化物修飾分子インプリント導電性ポリマフィルムが被覆され、アミノ酸センサーとして用いられる電極を得るステップと、
を有するアミノ酸センサーの作成プロセス。 - 請求項1に記載のアミノ酸センサーの作成プロセスにおいて、ピロールと前記テンプレートとの比率を400:1から2:1の範囲内、ピロールの濃度を2×10−3以上4×10−3M以下、および前記テンプレートの濃度を10−5以上10−3M以下とするアミノ酸センサーの作成プロセス。
- 請求項1に記載のアミノ酸センサーの作成プロセスにおいて、前記ステップ(a)では、前記アセトニトリルの量を20ml、前記トリフルオロ酢酸の量を0.5以上35μl以下、前記過塩素酸テトラブチルアンモニウムの濃度を0.01以上0.1M以下とするアミノ酸センサーの作成プロセス。
- 請求項1に記載のアミノ酸センサーの作成プロセスにおいて、前記ステップ(a)では、析出電位をAg/AgClに対して0.8以上0.9V以下として55以上65秒以下で電解重合するアミノ酸センサーの作成プロセス。
- 請求項1に記載のアミノ酸センサーの作成プロセスにおいて、前記ステップ(a)では、前記基板がガラス状炭素電極(GCE)の表面であるアミノ酸センサーの作成プロセス。
- 請求項1に記載のアミノ酸センサーの作成プロセスにおいて、前記ステップ(b)では、NaOH0.08から0.1Mの存在下で、電位をAg/AgClに対して0.8以上1.2V以下、走査速度を40から70mV/sとして、少なくとも100回、電気化学的に過酸化するアミノ酸センサーの作成プロセス。
- 請求項1に記載のアミノ酸センサーの作成プロセスにおいて、前記ステップ(b)では、電位をAg/AgClに対して0以上0.9V以下、走査速度を75以上125mV/s以下として、少なくとも75回、リン酸緩衝溶液中で循環することにより洗浄するアミノ酸センサーの作成プロセス。
- 請求項1に記載のアミノ酸センサーの作成プロセスにおいて、前記ステップ(b)では、電位を0以上0.9V以下、走査速度を50以上70mV/s以下として、少なくとも20回、安定化するアミノ酸センサーの作成プロセス。
- 請求項1に記載のアミノ酸センサーの作成プロセスにおいて、前記ステップ(c)では、前記ステップ(b)で得られた電極をポテンショスタットにより−0.28以上−0.32V以下で4.5以上5秒以下保持することにより、前記電極上に金属を析出させるアミノ酸センサーの作成プロセス。
- 請求項1に記載のアミノ酸センサーの作成プロセスにおいて、前記ステップ(c)では、電位を0以上0.9V以下として陽極スキャンするアミノ酸センサーの作成プロセス。
- 請求項1に記載のアミノ酸センサーの作成プロセスにおいて、前記ステップ(b)又はステップ(c)の前記被覆された電極は、開始電位を−0.15以上0.075V以下に戻し、pH5.5のリン酸緩衝液中で撹拌することにより、25から35回再生および再利用できるアミノ酸センサーの作成プロセス。
- 請求項1に記載のアミノ酸センサーの作成プロセスにおいて、前記ステップ(b)又はステップ(c)の前記被覆された電極は、金属酸化物修飾MICPの場合、使用後、電位−0.15以上0.075V以下で7以上10秒以下保持して金属酸化物を除去し、続いてpH5.5のリン酸緩衝液中で全ての修飾電極を1以上5分以下撹拌して酸化チロシンを除去することにより、再生可能となるアミノ酸センサーの作成プロセス。
- 請求項1に記載のアミノ酸センサーの作成プロセスにおいて、さらに、アミノ酸センサーを校正するステップを有しており、前記ステップ(b)又はステップ(c)における作用電極としての前記被覆された電極、白金箔対電極およびAg/AgCl参照電極を、0.075から0.15Mのリン酸緩衝液中に既知量のアミノ酸を含む電気化学セルに浸し、続いて50以上300mV以下の振幅変調で電位0以上0.9V以下をスキャンして示差パルスボルタモグラムを記録することにより、作用電極および対電極間の電流をアミノ酸の濃度に対してプロットして校正グラフを作成するアミノ酸センサーの作成プロセス。
- 請求項1に記載のアミノ酸センサーの作成プロセスで作成されるアミノ酸センサーを用いるアミノ酸の選択的検出方法であって、
i)前記ステップ(b)又はステップ(c)で得られたアミノ酸センサーとしての前記被覆された電極を、pH5.5からpH7.0で分析されるサンプルを含む電気化学セルに挿入し、続いて50以上300mV以下の振幅変調で電位0以上0.9V以下をスキャンして示差パルスボルタモグラムを記録するステップと、
ii)下記の校正グラフを参照することにより、アミノ酸の未知濃度を定量するステップと、
を有するアミノ酸の選択的検出方法。
ただし、前記校正グラフは、前記ステップ(b)又はステップ(c)における作用電極としての前記被覆された電極、白金箔対電極およびAg/AgCl参照電極を、0.075から0.15Mのリン酸緩衝液中に既知量のアミノ酸を含む電気化学セルに浸し、続いて50以上300mV以下の振幅変調で電位0以上0.9V以下をスキャンして示差パルスボルタモグラムを記録することにより、作用電極および対電極間の電流をアミノ酸の濃度に対してプロットして作成した校正グラフである。
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