JP5007905B2 - 分子鋳型を有するポリマーを備えたセンサー - Google Patents
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
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Description
本発明は、微量物質を分離、濃縮そして検出するためのセンサー、およびそれを備える微量物質を分離、濃縮そして検出するためシステムに関する。
環境中に存在する化学物質、農薬、または、食品、医薬品などに存在する汚染微生物、汚染微生物由来の物質は、微量であるにもかかわらず、ヒトの健康に大きく影響し得る。一般に、これらの物質は、微量であるためにその測定が困難であるか、その測定に時間と費用とを要するか、またはその測定に専門的な技術が必要である。
環境中に存在する微量物質を測定する方法として、特許文献１は、ガス漏れ警報器、排気ガスモニタなどとして用いられるガス検知素子を記載している。このガス検知素子は、導電性高分子、例えば、ポリチオフェン、ポリピロール、またはポリアセチレンなどからなる膜を用い、この導電性の高分子が、ガス、例えば、ＮＯに接触した場合に変化する導電率または吸収スペクトルを測定する。
特許文献２は、食品や香料の品質検査、悪臭公害の検知、焦げ臭検知による火災警報機などに用いられる、導電性高分子を用いるからなる感応膜を備えるにおいセンサーを記載する。特許文献２は、英国アロマスキャン社およびネオトロニクス社が、感応膜にポリピロールを主体とした導電性ポリマーを用い、においと接触するときに変化する抵抗値変化を測定するおいセンサーを商品化していることを記載している。
食品、医薬品の微生物汚染は、企業イメージに致命的な打撃を与える。また、病院、老人介護施設における施設内微生物感染が社会問題化している。さらに、多様な抗菌商品の流通、需要の高まりに見られるように、一般家庭における衛生管理にも関心高まり、微生物汚染を簡単に測定できる技術の必要性が近年急速に高まっている。
食中毒を引き起こす細菌は、一般に、公定法として、対象細菌の生理学的特性を検出する培地法を用いて検出されている。最近では、塩基配列、抗体などを利用した細菌の高感度迅速検出法も開発されている。
上記汚染微生物または汚染微生物由来の物質は、試料中に存在するＡＴＰを測定することによって間接的に測定され得る。ＡＴＰは、動物、植物、微生物などのすべての生物に存在するエネルギー物質であり、生体活性などを評価するマーカーとして用いられ得る。
ＡＴＰを簡易に検出する方法として、ルシフェラーゼと蛍光検出とを組合せる方法がある。この方法では、例えば、測定対象、例えば、まな板を綿棒でふきとってＡＴＰを収集し、これにルシフェラーゼを作用させることにより発する蛍光を計測する。しかし、この方法は、用いるルシフェラーゼ、蛍光試薬が高価であって、その取り扱いに熟練を要し、さらに、蛍光検出に用いる装置が必要である。また、この方法は、ＡＴＰの検出に蛍光検出を用いているため、蛍光強度の経時的変化に起因して迅速な測定が要求される。特に問題となるのは、ルシフェラーゼの保存である。ルシフェラーゼの保存には、冷凍または冷蔵が必要で、保存可能な期間も短いという本質的な欠陥を備えている。
非特許文献１、非特許文献２、および非特許文献３は、微量物質を特異的に取り込む技術として、ポリピロールが過酸化されるとき、ゲスト分子が高分子マトリックス内に取り込まれ、分子鋳型を形成する「モレキュラーインプリンティング法」を記載する。非特許文献３は、この「モレキュラーインプリンティング法」を用い、ゲスト分子としてＬ−グルタミン酸を用い、ポリピロールを過酸化する過程でＬ−グルタミン酸を高分子マトリックス内に取り込み、得られたポリピロール膜が、Ｌ−グルタミン酸を取り込むが、Ｄ−グルタミン酸は取り込まれないことを示した。非特許文献４は、Ｌ−乳酸をプリントした過酸化ポリピロールコロイドを記載している。非特許文献５は、分子鋳型を利用した皮膚コレステロール計測法を記載している。非特許文献６は、自己組織化単分子膜修飾電極を用いるドーパミンの選択的定量法を記載している。また、特許文献３は、ステアリルメルカプタンを用いて作製した自己組織化単分子膜を利用するコレステロールセンサーを記載している。
特開昭６１−１４７１４５号公報
特開昭１１−２３５０８号公報
特開２００４−２８８８７号公報
Ｔ．Ｎａｇａｏｋａら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７２巻、１７号、２０００年、３９８９〜３９９４頁
Ｔ．Ｎａｇａｏｋａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２巻、２００１年、１３５〜１４６頁
Ｔ．Ｎａｇａｏｋａら、Ａｎａｌｙｓｔ、１２７巻、２００２、９３５〜９３９頁
Ｔ．Ｎａｇａｏｋａら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７４巻、１６号、２００２年、４１８４〜４１９０頁
長岡勉ら、生体医工学、４２巻、３号、２３〜２８頁、２００４年
長岡勉ら、分析化学、５３巻、１１号、１３２１〜１３２４頁、２００４年
本発明は、上記従来技術の課題を解決し、環境中に存在する化学物質、農薬、または、食品、医薬品などに存在する汚染微生物、汚染微生物由来の物質と、分子鋳型を有するポリマーとの相互作用によって引き起こされるこのポリマーの電気化学的性質を利用し、これら標的物質を簡便かつ効率良く、分離、濃縮、そして検知し得る手段を提供することを目的とする。
上記汚染微生物を検出するための従来法は、培地法を用いるために時間を要する。また、上記酵素、抗体などを含む生体物質を利用する方法は、これら生体物質は、一般に、安定性に乏しいため、取り扱いに熟練を要し、高額な設備や専門的な作業をともない、コストパーフォーマンスにも乏しい。
本発明は、標的分子に対して高い特異性を有する分子鋳型を備えたポリマーの電気化学的性質を利用し、上記従来技術の課題を解決する。本発明は、上記のような酵素などの生体物質を用いることなく、上記分子鋳型を備えたポリマーを利用することによって、コストパーフォーマンスに優れ、かつ、食品産業、病院、学校、福祉施設、一般家庭においても簡便に使用され得る微量標的物質測定様センサーおよびそれを備えたシステムを提供することを目的とする。本発明はまた、上記分子鋳型を備えたポリマーの電気化学的性質を利用した吸着剤を提供することを目的とする。
本発明は、分子鋳型を有するポリマーとこの分子鋳型と相補的な微量標的物質との相互作用を鋭意検討し、分子鋳型技術の特徴である微量標的物質との特異性に加え、分子鋳型の電気的性質を利用することによって、この分子鋳型が微量標的物質を特異的に結合することに加え、分子鋳型の周りにこの微量標的物質を濃縮することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、分子鋳型を有する過酸化ポリマー膜の電気化学的性質を利用する点を特徴の１つとし、センサーまたは吸着剤の一部として構成した点に特徴の１つを備えている。
より特定すれば、本発明は以下の項目に関する。
（項目１）アニオン分子を検出するセンサーであって、電極、上記電極上に配置されたポリマー層であって、上記アニオン分子の立体構造に相補的な三次元構造を有する分子鋳型を備えたポリマー層、上記ポリマー層の導電性の変化を導出する導出部を備え、上記三次元構造が、上記ポリマー層を形成する際に上記ポリマーのモノマーを上記標的分子の存在下で重合する工程、および得られた重合体を過酸化する工程によって形成される、センサー。
（項目２）上記電極が第１の電位にあるとき、上記アニオン分子を上記分子鋳型に捕捉し、上記電極が上記第１の電位とは異なる第２の電位にあるとき、捕捉されたアニオン分子から酸化あるいは還元電流を生じる、項目１に記載のセンサー。
（項目３）上記電極に接続される電源をさらに備え、上記電源が上記電極に上記第１の電位を印加することによって上記アニオン分子を上記分子鋳型に濃縮する、項目１に記載のセンサー。
（項目４）上記導出部に接続され、上記導電性の変化を計測する検知部をさらに備える、項目１に記載のセンサー。
（項目５）上記電極、上記ポリマー層、および上記導出部が感応部を構成し、上記感応部と、上記電源および上記検知部とが脱着可能に連結されている、項目４に記載のセンサー。
（項目６）上記モノマーが、ピロール、アニリン、チオフェンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、項目１に記載のセンサー。
（項目７）上記アニオン分子が、ＡＴＰ、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、無機アニオン、有機アニオン、およびこれら化合物を含む高分子化合物からなる群から選択される分子である、項目１に記載のセンサー。
（項目８）上記アニオン分子が、ペプチド、ＤＮＡおよび糖からな群から選択される、項目１に記載のセンサー。
（項目９）上記ペプチドが、ベロ毒素、エンテロトキシンを含む細菌毒素である、項目８に記載のセンサー。
上記電極としては、導電体である任意の材料が用いられ得、これには、金、炭素、白金、ＩＴＯなどが含まれるが、これらに制限されるわけではない。上記ポリマーからの電流を導出部に伝導し得る限り任意の導電体を用い得る。
本発明は、また、アニオン分子を吸着する吸着剤に関し、この吸着剤は、支持体、この支持体上に配置されたポリマー層であって、該アニオン分子の立体構造に相補的な三次元構造を有する分子鋳型を備えたポリマー層、このポリマー層の導電性の変化を導出する導出部を備え、上記三次元構造が、上記ポリマーの層を形成する際に上記ポリマーのモノマーを該標的分子の存在下で重合する工程、および得られた重合体を過酸化する工程によって形成される。
上記支持体は、任意の形状を有し得、微量物質の吸着剤として、例えば、円筒形のカラムに充填して使用する場合は、通常、球形または卵形などの形状であり、この上に分子鋳型を有するポリマー層が配置された吸着剤は、このカラムに効率的に充填される。
上記支持体が第１の電位にあるとき、上記アニオン分子を上記分子鋳型に捕捉し得、上記支持体が上記第１の電位より大きい第２の電位にあるとき、捕捉されたアニオン分子を解放し得る。
本発明によって、物質の分離のみに限られていた、従来の分子鋳型を有するポリマーを、標的物質と、分子鋳型を有するポリマーとの相互作用によって生じる電気化学的事象を利用し、物質の分離のみならず、物質の濃縮、および感知することを可能にする吸着剤、センサー、およびこれらを含むシステムが提供される。
例として、本発明のセンサーは、従来のルシフェラーゼを用いたＡＴＰ測定法に対し、以下の利点を提供する。
ｉ）酵素を使用しないので、酵素反応のための試薬、およびその混合操作を必要とせず、酵素の失活を防ぐための冷蔵保存などの操作を必要とせず、蛍光強度の経時的変化、洗剤や消毒薬のなどの混入による酵素の失活を考慮する必要がない。
ｉｉ）酵素を含む試薬を保存するために設備が不要であるため、小規模事業所、一般家庭においても使用可能。
ｉ）酵素を使用しないので、酵素反応のための試薬、およびその混合操作を必要とせず、酵素の失活を防ぐための冷蔵保存などの操作を必要とせず、蛍光強度の経時的変化、洗剤や消毒薬のなどの混入による酵素の失活を考慮する必要がない。
ｉｉ）酵素を含む試薬を保存するために設備が不要であるため、小規模事業所、一般家庭においても使用可能。
（実施形態１）ＡＴＰの分子鋳型を有するポリピロール膜を備えたセンサーの調製
電極上に、ＡＴＰの分子鋳型を有するポリピロール膜を調製する方法の概略を図１に示す。図１の（ａ）は、ＡＴＰ陰イオン存在下のピロールの酸化的重合反応の模式図であり、ポリピロール膜は、電極上を図１の（ａ）に示される右向きの矢印の方向に成長する。図１の（ｂ）は、重合後のポリピロール膜の模式図である（図中ＰＰｙは、ポリピロールの略である）。ポリピロールは、重合の過程で電極に電子を放出するためにそれ自体は陽電荷を有し、この陽電荷を補償するためにＡＴＰ陰イオンがポリマー内に取り込まれる（ドープされる）。
電極上に、ＡＴＰの分子鋳型を有するポリピロール膜を調製する方法の概略を図１に示す。図１の（ａ）は、ＡＴＰ陰イオン存在下のピロールの酸化的重合反応の模式図であり、ポリピロール膜は、電極上を図１の（ａ）に示される右向きの矢印の方向に成長する。図１の（ｂ）は、重合後のポリピロール膜の模式図である（図中ＰＰｙは、ポリピロールの略である）。ポリピロールは、重合の過程で電極に電子を放出するためにそれ自体は陽電荷を有し、この陽電荷を補償するためにＡＴＰ陰イオンがポリマー内に取り込まれる（ドープされる）。
そしてその後、ポリマーをさらに酸化（過酸化）すると、ポリマーが電気的に中性となるため、ＡＴＰは膜外に排出されてＡＴＰの分子鋳型が形成される（図１の（ｃ）：図中ＯＰＰｙは、過酸化ポリピロールの略である）。この過酸化は、ポリマーの硬化をも引き起こし、このＡＴＰの分子鋳型を安定化する。
形成される鋳型の三次元構造は、過酸化反応の溶液組成、過酸化反応を引き起こすための電圧に依存して変動し得る。一般に、過酸化反応が徐々に進行するような条件下では、標的陰シオンの立体構造により緊密な三次元構造を有する分子鋳型が形成される。
（実施形態２）センサーへの標的陰イオンの吸着とその検出
図２は、センサーへの標的陰イオンの吸着とその検出の概略を示す模式図である。
図２は、センサーへの標的陰イオンの吸着とその検出の概略を示す模式図である。
ＡＴＰは４価の陰イオンとして存在し、陽分極した電極とＡＴＰの間の静電的親和力を相互作用の一部とし、ＡＴＰと特異的な三次元構造を有するように形成された分子鋳型と特異的に結合する。ＡＴＰは、電極上の分子鋳型と結合することによって、試料溶液からセンサー表面上に効率良く濃縮される（図２の（ａ））。電極の周りに分子鋳型を配置することは、試料溶液からの標的物質の分子鋳型への結合、それによるセンサー表面への標的物質の濃縮に加え、分子鋳型を有するポリマーおよび電極に、高感度測定に好適な導電特性を与える。ＡＴＰの電気化学的検出は、ＡＴＰの蛍光検出法に比べて必ずしも高感度ではないが、このような試料溶液からセンサー表面上への濃縮によってＡＴＰの高感度検出が達成され得る。
ＡＴＰは、以下に示されるように、電極に電圧を印加することによってさらに試料溶液から濃縮され得る。
分子鋳型に捕捉されたＡＴＰは、電極に付加的な電圧を印加することによって酸化され、そのときに生じる酸化電流の値（図２の（ｂ）において左向きの矢印で示される）から、ポリピロール膜に捕捉されたＡＴＰの量を測定でき、その結果、試料中のＡＴＰの量を算出することができる。
上記分子鋳型は、電極表面上に、複数の分子鋳型がマトリックス状に配置されたアレイとして形成され得る。アレイ内の分子鋳型の配置もまた、ＡＴＰの濃縮効率を変更するために改変され得る。
（実施形態３）分子鋳型を有するポリマー膜を有するセンサーを備えたシステム
上記実施の形態１に記載のＡＴＰの分子鋳型を有するポリピロール膜を備えたセンサーは、ＡＴＰを含むアニオン系分子が、過酸化ポリピロール膜の分子鋳型に捕集されることによる過酸化ポリピロール膜の導電性、すなわち酸化還元特性の変化を電気化学的に計測することでアニオン系分子の高感度の測定を可能にするシステムの構築を可能にする。図１０は、このようなシステムの一例を示す。上記実施の形態１に従って、電極の周りにポリピロールなどの導電性高分子の分子鋳型を形成することにより、アニオン系分子の選択、濃縮に加えて、電気化学的測定時に導電性高分子に付与される特有の導電特性によって、アニオン系分子のより高感度の測定を可能にする。図１０に示されるシステムは、電極、電極上に形成された分子鋳型を有するポリマー層、およびケーブル４に接続され、このケーブル４を介して検知部６に導出される導出部（図示せず）を備える感応部５と、電圧／電流計を備える検知部６と、被検試料Ｓを拭き取ってサンプリングを行う綿棒Ｓ’を浸漬する試料溶解液を含む容器９とを備えている。感応部は、採取した試料を溶解した容器９に浸漬して、後の実施例で詳述される電気化学的測定を行う。
上記実施の形態１に記載のＡＴＰの分子鋳型を有するポリピロール膜を備えたセンサーは、ＡＴＰを含むアニオン系分子が、過酸化ポリピロール膜の分子鋳型に捕集されることによる過酸化ポリピロール膜の導電性、すなわち酸化還元特性の変化を電気化学的に計測することでアニオン系分子の高感度の測定を可能にするシステムの構築を可能にする。図１０は、このようなシステムの一例を示す。上記実施の形態１に従って、電極の周りにポリピロールなどの導電性高分子の分子鋳型を形成することにより、アニオン系分子の選択、濃縮に加えて、電気化学的測定時に導電性高分子に付与される特有の導電特性によって、アニオン系分子のより高感度の測定を可能にする。図１０に示されるシステムは、電極、電極上に形成された分子鋳型を有するポリマー層、およびケーブル４に接続され、このケーブル４を介して検知部６に導出される導出部（図示せず）を備える感応部５と、電圧／電流計を備える検知部６と、被検試料Ｓを拭き取ってサンプリングを行う綿棒Ｓ’を浸漬する試料溶解液を含む容器９とを備えている。感応部は、採取した試料を溶解した容器９に浸漬して、後の実施例で詳述される電気化学的測定を行う。
（実施形態４）分子鋳型を有するポリマー膜を有するセンサーの選択吸着能評価
ポリマー内に取り込まれるドーパントとしてＨ３ＰＯ４またはＡＴＰを用い、実施形態１に従って、Ａｕ平面電極上にＯＰＰｙ／Ｈ３ＰＯ４膜またはＯＰＰｙ／ＡＴＰ膜を形成し、Ｈ３ＰＯ４の分子鋳型またはＡＴＰの分子鋳型を有するポリマーを備えた電極をそれぞれ得た。
ポリマー内に取り込まれるドーパントとしてＨ３ＰＯ４またはＡＴＰを用い、実施形態１に従って、Ａｕ平面電極上にＯＰＰｙ／Ｈ３ＰＯ４膜またはＯＰＰｙ／ＡＴＰ膜を形成し、Ｈ３ＰＯ４の分子鋳型またはＡＴＰの分子鋳型を有するポリマーを備えた電極をそれぞれ得た。
得られたＯＰＰｙ／ＡＴＰ膜−Ａｕ平面電極、およびＯＰＰｙ／Ｈ３ＰＯ４膜−Ａｕ平面電極のそれぞれについて、試料液としてＡＴＰ溶液（１０−６ＭのＡＴＰ溶液）を用い、ＡＴＰが吸着されるか否かを調べた。各々の分子鋳型を有するポリマーを備えた各電極へのＡＴＰの吸着は、試料液と上記各電極とを接触させた後、塩溶液（１０ｍＭのＫＣｌ溶液）で各電極に吸着したＡＴＰを遊離させ、溶液中のＡＴＰ濃度を酵素基質法によって測定した。その結果、ＯＰＰｙ／ＡＴＰ膜−Ａｕ平面電極では、ＡＴＰの特異的捕捉が起こり、ＯＰＰｙ／Ｈ３ＰＯ４膜−Ａｕ平面電極では、ＡＴＰの特異的捕捉が起こらないことを示す結果を得た。
以下、発明を実施例によって説明する。以下の実施例は、本発明を例示するものであって、本発明を制限する意図はない。
以下１〜３の実施例において、電気化学測定は電気化学測定システム（ＨＺ−３０００、北斗電工（株）製）を用いて行い、カーボン平面電極はグラッシーカーボン電極（電極面積７ｍｍ２、（株）ビー・エー・エス製（ＰＡＲＴＳ＃００２０１２））、参照電極をＡｇ／ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、対極をＰｔ棒（直径１ｍｍ、長さ４ｃｍ、（株）ニラコ製）とし、電位はこの参照電極の電位に対する値を記載している。また１〜５の実施例において、使用したリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）は、滅菌処理済純水中にＫＨ２ＰＯ４（特級、和光純薬工業（株）製）およびＮａ２ＨＰＯ４（特級、和光純薬工業（株）製）を溶解してｐＨ７．０に調整したものを用いた。
（実施例１）ＡＴＰの分子鋳型をもつ過酸化ポリピロール膜の作製
上記実施の形態１に従い、詳細には以下の手順に従って、カーボン平面電極上に過酸化ポリピロール膜を作製した。
１）カーボン平面電極をコンパウンド（粒子サイズ０．１μｍ、（株）ソフト９９コーポレーション製）で５分間研磨した後、超音波洗浄を１分間行った。
２）純水を溶媒とし、１０ｍＭ濃度のＡＴＰ（アデノシン−５’−三リン酸二ナトリウム、生化学用、キシダ化学（株）製）および０．１Ｍ濃度のピロール（特級、和光純薬工業（株）製）を含む溶液を調製した。
３）この溶液中で、作用極をカーボン平面電極、参照電極をＡｇ／ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、対極をＰｔ棒とし、電気化学測定システムにおいて作用極に定電位０．９８Ｖを３６０秒間加えることによってピロールを酸化重合し、作用極上にＡＴＰがドープされたポリピロール（ＰＰｙ／ＡＴＰ）膜を析出させた。
４）０．１ＭのＮａＯＨ（特級、和光純薬工業（株）製）溶液中で、作用極をＰＰｙ／ＡＴＰ電極とし、電気化学測定システムにおいて、サイクリックボルタンメトリを掃引速度５ｍＶｓ−１で作用極初期電位０．００Ｖ、折り返し電位１．２０Ｖとして２サイクル行い、カーボン平面電極上にＡＴＰ鋳型を有するポリピロール膜を過酸化ポリピロール（ＯＰＰｙ／ＡＴＰ）膜として作製した。
上記実施の形態１に従い、詳細には以下の手順に従って、カーボン平面電極上に過酸化ポリピロール膜を作製した。
１）カーボン平面電極をコンパウンド（粒子サイズ０．１μｍ、（株）ソフト９９コーポレーション製）で５分間研磨した後、超音波洗浄を１分間行った。
２）純水を溶媒とし、１０ｍＭ濃度のＡＴＰ（アデノシン−５’−三リン酸二ナトリウム、生化学用、キシダ化学（株）製）および０．１Ｍ濃度のピロール（特級、和光純薬工業（株）製）を含む溶液を調製した。
３）この溶液中で、作用極をカーボン平面電極、参照電極をＡｇ／ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、対極をＰｔ棒とし、電気化学測定システムにおいて作用極に定電位０．９８Ｖを３６０秒間加えることによってピロールを酸化重合し、作用極上にＡＴＰがドープされたポリピロール（ＰＰｙ／ＡＴＰ）膜を析出させた。
４）０．１ＭのＮａＯＨ（特級、和光純薬工業（株）製）溶液中で、作用極をＰＰｙ／ＡＴＰ電極とし、電気化学測定システムにおいて、サイクリックボルタンメトリを掃引速度５ｍＶｓ−１で作用極初期電位０．００Ｖ、折り返し電位１．２０Ｖとして２サイクル行い、カーボン平面電極上にＡＴＰ鋳型を有するポリピロール膜を過酸化ポリピロール（ＯＰＰｙ／ＡＴＰ）膜として作製した。
（実施例２）過酸化ポリピロール膜を用いたＡＴＰの検出
得られたカーボン平面電極上に作製したＯＰＰｙ／ＡＴＰ膜を用いて、測定対象試料として５．０ｍＭ濃度のＡＴＰ溶液を用いて以下の手順により酸化電流を測定した。
得られたカーボン平面電極上に作製したＯＰＰｙ／ＡＴＰ膜を用いて、測定対象試料として５．０ｍＭ濃度のＡＴＰ溶液を用いて以下の手順により酸化電流を測定した。
まず、上記実施例１で得られたＯＰＰｙ／ＡＴＰ膜を備えた電極を用い、
５）リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、作用極をＯＰＰｙ／ＡＴＰ電極、参照電極をＡｇ／ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、対極をＰｔ棒とし、電気化学測定システムにおいて作用極に電位幅０.００〜２．００Ｖ（３サイクル、掃引速度５ｍＶｓ−１）の電位走査を行うことによりポリピロール膜の過酸化処理が確実に行われたことの確認を行った。
６）次に図３の電位プロファイルに従い電極のクリーニング、ＡＴＰの濃縮及び酸化的検出を行った。−０．５０Ｖを３０秒間電極に印加し、膜内に残存する可能性のあるＡＴＰを排除する。次に０．８０Ｖを１５秒間印加して被検溶液内のＡＴＰを膜内に濃縮する。その後、１．８０Ｖを１５秒間印加してＡＴＰの電解酸化検出を行う。まず、空試験として、図３のＢの電位プロファイルで実験を行った。リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、作用極をＯＰＰｙ／ＡＴＰ電極、参照電極をＡｇ/ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、対極をＰｔ棒とし、電気化学測定システムにおいて作用極に−０．５０Ｖを１５秒間加えてＯＰＰｙ／ＡＴＰ電極をクリーニングし、そして作用極に０．８０Ｖを１５秒間加えて濃縮過程を行い、さらに１．８０Ｖを１５秒間加えて作用極に流れる電流を測定した。
７）ここで、被検体としてその濃度を５．０ｍＭとするようにＡＴＰを加え、作用極をＯＰＰｙ／ＡＴＰ電極、参照電極をＡｇ/ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、対極をＰｔ棒とし、電気化学測定システムにおいて作用極に定電位−０．５０Ｖを１５秒間加えて作用極をクリーニングし、作用極に定電位０．８０Ｖを１５秒間加えて作用極上にＡＴＰを濃縮したのち、作用極に定電位１．８０Ｖを１５秒間加えて（図３のほぼＡで示される）電流値を測定した。
５）リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、作用極をＯＰＰｙ／ＡＴＰ電極、参照電極をＡｇ／ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、対極をＰｔ棒とし、電気化学測定システムにおいて作用極に電位幅０.００〜２．００Ｖ（３サイクル、掃引速度５ｍＶｓ−１）の電位走査を行うことによりポリピロール膜の過酸化処理が確実に行われたことの確認を行った。
６）次に図３の電位プロファイルに従い電極のクリーニング、ＡＴＰの濃縮及び酸化的検出を行った。−０．５０Ｖを３０秒間電極に印加し、膜内に残存する可能性のあるＡＴＰを排除する。次に０．８０Ｖを１５秒間印加して被検溶液内のＡＴＰを膜内に濃縮する。その後、１．８０Ｖを１５秒間印加してＡＴＰの電解酸化検出を行う。まず、空試験として、図３のＢの電位プロファイルで実験を行った。リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、作用極をＯＰＰｙ／ＡＴＰ電極、参照電極をＡｇ/ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、対極をＰｔ棒とし、電気化学測定システムにおいて作用極に−０．５０Ｖを１５秒間加えてＯＰＰｙ／ＡＴＰ電極をクリーニングし、そして作用極に０．８０Ｖを１５秒間加えて濃縮過程を行い、さらに１．８０Ｖを１５秒間加えて作用極に流れる電流を測定した。
７）ここで、被検体としてその濃度を５．０ｍＭとするようにＡＴＰを加え、作用極をＯＰＰｙ／ＡＴＰ電極、参照電極をＡｇ/ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、対極をＰｔ棒とし、電気化学測定システムにおいて作用極に定電位−０．５０Ｖを１５秒間加えて作用極をクリーニングし、作用極に定電位０．８０Ｖを１５秒間加えて作用極上にＡＴＰを濃縮したのち、作用極に定電位１．８０Ｖを１５秒間加えて（図３のほぼＡで示される）電流値を測定した。
図３に示される条件で測定した作用極電流値の変化を図４に示す。ここで、ＡＴＰ不在下の電位印加開始後４５秒における電流値をＩ１、ＡＴＰ存在下で測定された電位印加開始後１０５秒における電流値をＩ２とし、測定された電流値の差ΔＩ＝Ｉ２−Ｉ１としてＡＴＰの存在による電流値の変化を確認した。その結果、図４に示すように、５．０ｍＭ ＡＴＰでは７．２０×１０−６Ａ（＝ΔＩ）の電流値の変化が観察された。
（比較例１）カーボン平面電極のみでの酸化電流測定
以下の手順に従って、カーボン平面電極（グラッシーカーボン電極、電極面積７ｍｍ２、（株）ビー・エー・エス製（ＰＡＲＴＳ＃００２０１２））を用いて、ＡＴＰ（生化学用、キシダ化学（株）製）の電気化学的挙動を測定した。
１）カーボン平面電極をコンパウンド（粒子サイズ０．１μｍ、（株）ソフト９９コーポレーション製）で５分間研磨した後、超音波洗浄を１分間行った。
２）リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、作用極をカーボン平面電極、参照電極をＡｇ/ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、対極をＰｔ棒（直径１ｍｍ、（株）ニラコ製）とし、電気化学測定システムにおいて作用極に定電位１．８０Ｖ及び−１．００Ｖを各３分間加えて作用極に酸化還元処理を施した。
３）リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、作用極をカーボン平面電極、参照電極をＡｇ/ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、対極をＰｔ棒とし、電気化学測定システムにおいて作用極に０．００〜２．００Ｖ（掃引速度５ｍＶｓ−１）の電位を印加し、ベースライン電流を測定した。
４）カーボン平面電極を用いたＡＴＰの酸化電流測定：リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍＬにＡＴＰ ０．１０ｇを加え、１０ｍＭのＡＴＰ溶液を調製した。また、同様に０．０１０〜１０ｍＭまでの様々な濃度のＡＴＰ溶液を調製した。
５）ＡＴＰ溶液中で、作用極をカーボン平面電極、参照電極をＡｇ/ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、対極をＰｔ棒とし、電気化学測定システムにおいて作用極に０．００〜２．００Ｖ（掃引速度５ｍＶｓ−１）の電位を印加して掃引を行い、作用極に流れるＡＴＰによる酸化電流を測定した。
以下の手順に従って、カーボン平面電極（グラッシーカーボン電極、電極面積７ｍｍ２、（株）ビー・エー・エス製（ＰＡＲＴＳ＃００２０１２））を用いて、ＡＴＰ（生化学用、キシダ化学（株）製）の電気化学的挙動を測定した。
１）カーボン平面電極をコンパウンド（粒子サイズ０．１μｍ、（株）ソフト９９コーポレーション製）で５分間研磨した後、超音波洗浄を１分間行った。
２）リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、作用極をカーボン平面電極、参照電極をＡｇ/ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、対極をＰｔ棒（直径１ｍｍ、（株）ニラコ製）とし、電気化学測定システムにおいて作用極に定電位１．８０Ｖ及び−１．００Ｖを各３分間加えて作用極に酸化還元処理を施した。
３）リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、作用極をカーボン平面電極、参照電極をＡｇ/ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、対極をＰｔ棒とし、電気化学測定システムにおいて作用極に０．００〜２．００Ｖ（掃引速度５ｍＶｓ−１）の電位を印加し、ベースライン電流を測定した。
４）カーボン平面電極を用いたＡＴＰの酸化電流測定：リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍＬにＡＴＰ ０．１０ｇを加え、１０ｍＭのＡＴＰ溶液を調製した。また、同様に０．０１０〜１０ｍＭまでの様々な濃度のＡＴＰ溶液を調製した。
５）ＡＴＰ溶液中で、作用極をカーボン平面電極、参照電極をＡｇ/ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、対極をＰｔ棒とし、電気化学測定システムにおいて作用極に０．００〜２．００Ｖ（掃引速度５ｍＶｓ−１）の電位を印加して掃引を行い、作用極に流れるＡＴＰによる酸化電流を測定した。
この結果、０．１ｍＭ以上の濃度ではＡＴＰの酸化電流が観察できたが、０．１ｍＭ以下ではベースラインと比較して有意な酸化電流が観察できなかった
（実施例３）過酸化ポリピロール膜／カーボン平面電極を用いたＡＴＰの定量
実施例１に記載の方法で得られたカーボン平面電極上に作製したＯＰＰｙ／ＡＴＰ膜を用いて、実施例２と同様に、０．１０〜１０ｍＭの様々なＡＴＰ濃度における作用極と対極との間の酸化電流を測定し、ＡＴＰの定量を行った。各濃度における作用極電流差ΔＩ（ＡＴＰ存在下での酸化電流値−ベース電流値）を濃度に対してプロットした結果を図５に示す。図５に示されるように、ＡＴＰの濃度に依存して電流差が比例的に増大した。
（実施例３）過酸化ポリピロール膜／カーボン平面電極を用いたＡＴＰの定量
実施例１に記載の方法で得られたカーボン平面電極上に作製したＯＰＰｙ／ＡＴＰ膜を用いて、実施例２と同様に、０．１０〜１０ｍＭの様々なＡＴＰ濃度における作用極と対極との間の酸化電流を測定し、ＡＴＰの定量を行った。各濃度における作用極電流差ΔＩ（ＡＴＰ存在下での酸化電流値−ベース電流値）を濃度に対してプロットした結果を図５に示す。図５に示されるように、ＡＴＰの濃度に依存して電流差が比例的に増大した。
（実施例４）過酸化ポリピロール膜／チップ電極を用いたＡＴＰの定量
実施例１に記載の方法と同様の方法を用い、チップ電極（ＡＣ１．Ｗ４．Ｒ１、プリントカーボン電極、作用電極面積２ｍｍ２、オンチップＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極、オンチップＰｔ／Ａｕ（１５％／８５％）合金対極、ＢＶＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）上にＯＰＰｙ／ＡＴＰ膜を作製した。得られた分子鋳型を有するチップ電極を、デュアル電気化学アナライザー（ＡＬＳモデル８４２Ｂ、（株）ビー・エー・エス製）において、実施例２と同様に５．０ｍＭのＡＴＰ溶液を測定試料として、このチップ電極の酸化電流を測定した。電流値差ΔＩは実施例３での結果と同等の結果が得られた（実施例３：７．２×１０−６Ａ、実施例４：５．１×１０−６Ａ）。このことから、カーボン平面電極の代わりにチップ電極用いた場合においても同等の検出が可能であることが示された。チップ電極を用いることで、作用極・対極・参照電極の各電極を平面上に配置することが可能になるため一体型電気化学セルを形成でき、センサプローブ（検出部）の小型化が達成することができる。
実施例１に記載の方法と同様の方法を用い、チップ電極（ＡＣ１．Ｗ４．Ｒ１、プリントカーボン電極、作用電極面積２ｍｍ２、オンチップＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極、オンチップＰｔ／Ａｕ（１５％／８５％）合金対極、ＢＶＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）上にＯＰＰｙ／ＡＴＰ膜を作製した。得られた分子鋳型を有するチップ電極を、デュアル電気化学アナライザー（ＡＬＳモデル８４２Ｂ、（株）ビー・エー・エス製）において、実施例２と同様に５．０ｍＭのＡＴＰ溶液を測定試料として、このチップ電極の酸化電流を測定した。電流値差ΔＩは実施例３での結果と同等の結果が得られた（実施例３：７．２×１０−６Ａ、実施例４：５．１×１０−６Ａ）。このことから、カーボン平面電極の代わりにチップ電極用いた場合においても同等の検出が可能であることが示された。チップ電極を用いることで、作用極・対極・参照電極の各電極を平面上に配置することが可能になるため一体型電気化学セルを形成でき、センサプローブ（検出部）の小型化が達成することができる。
図９は、実施例４および５で測定に用いたチップ電極と、実施例１〜３の電気化学的測定を行ったセルの写真である。図中Ｃは、対極（Ｐｔ棒）を、Ｗは作用極（カーボン平面電極）を、そしてＲは参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）を示す。
（実施例５）トリプルパルスアンペロメトリー測定法を用いたＡＴＰの定量
実施例１に記載の方法と同様の方法により、実施例４に記載のチップ電極上に作製したＯＰＰｙ／ＡＴＰ膜を用いて、以下の手順に従って、トリプルパルスアンペロメトリー測定によりＡＴＰの定量を行った。
１）リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍＬにＡＴＰ（生化学用、キシダ化学（株）製）０．１０ｇを加え、１０ｍＭのＡＴＰ溶液を調製した。また、同様に１．０×１０−４ｍＭ〜１０ｍＭまで様々な濃度のＡＴＰ溶液を調製した。
２）デュアル電気化学アナライザー（ＡＬＳモデル８４２Ｂ、（株）ビー・エー・エス製）においてＥ１＝−０．５０Ｖ、Ｔ１＝０．５０秒、Ｅ２＝０．５０Ｖ、Ｔ２＝０．２０秒、Ｅ３＝１．８０Ｖ、Ｔ３＝０．０１０秒、サイクル数＝１０００の条件で、トリプルパルスアンペロメトリー測定を行った。用いたパルスプロファイルを図６に示す。なお、電流は各パルス後半半分の時間観測し、平均化している。下の実施例に示される電流は、この各電流の内、Ｅ３のパルスにおいて観測された電流からＥ２のパルスにおいて観測された電流の差をとったものとして示される。チップ電極にリン酸溶液を２０μＬ滴下し、ベース電流が安定していることを確認した後、さらにＡＴＰ溶液２０μＬを滴下した。このとき、
トリプルアンペロメトリー電流値が変化する様子を図７に示した。また、各ＡＴＰ濃度における電流値とＡＴＰ溶液濃度との関係を検量線として図８に示す。
実施例１に記載の方法と同様の方法により、実施例４に記載のチップ電極上に作製したＯＰＰｙ／ＡＴＰ膜を用いて、以下の手順に従って、トリプルパルスアンペロメトリー測定によりＡＴＰの定量を行った。
１）リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍＬにＡＴＰ（生化学用、キシダ化学（株）製）０．１０ｇを加え、１０ｍＭのＡＴＰ溶液を調製した。また、同様に１．０×１０−４ｍＭ〜１０ｍＭまで様々な濃度のＡＴＰ溶液を調製した。
２）デュアル電気化学アナライザー（ＡＬＳモデル８４２Ｂ、（株）ビー・エー・エス製）においてＥ１＝−０．５０Ｖ、Ｔ１＝０．５０秒、Ｅ２＝０．５０Ｖ、Ｔ２＝０．２０秒、Ｅ３＝１．８０Ｖ、Ｔ３＝０．０１０秒、サイクル数＝１０００の条件で、トリプルパルスアンペロメトリー測定を行った。用いたパルスプロファイルを図６に示す。なお、電流は各パルス後半半分の時間観測し、平均化している。下の実施例に示される電流は、この各電流の内、Ｅ３のパルスにおいて観測された電流からＥ２のパルスにおいて観測された電流の差をとったものとして示される。チップ電極にリン酸溶液を２０μＬ滴下し、ベース電流が安定していることを確認した後、さらにＡＴＰ溶液２０μＬを滴下した。このとき、
トリプルアンペロメトリー電流値が変化する様子を図７に示した。また、各ＡＴＰ濃度における電流値とＡＴＰ溶液濃度との関係を検量線として図８に示す。
図８に示されるように、ＯＰＰｙ／ＡＴＰ膜を用いたトリプルパルスアンペロメトリー測定では、５００ｎＭ濃度程度までのＡＴＰを測定することが可能であることが示された。これは、上記比較例における０．１ｍＭ濃度以下のＡＴＰを測定できなかった結果と比較すると、１／１０００程度の薄い濃度のＡＴＰをも測定することを示している。
なお、チップ電極（ＡＣ１．Ｗ４．Ｒ１、プリントカーボン電極、電極面積２ｍｍ２、ＢＶＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、トリプルパルスアンペロメトリー測定法でＯＰＰｙ／ＡＴＰ膜を用いずにＡＴＰの検出を行ったところ、検出限界はカーボン平面電極の場合と同じく０．１ｍＭであった。これは、特定の理論に拘束されるのではなく、ＡＴＰが分子鋳型に入り込むのみならず、分子鋳型の近傍で複数のＡＴＰ分子がＯＰＰｙ／ＡＴＰ膜上に高度に濃縮されているためであると考えられた。
微量物質を分離、濃縮そして検出するための吸着剤、センサーおよびそれらを備える微量物質を分離、濃縮そして検出するためシステムが提供される。環境中に存在する微量の化学物質、農薬、および食品、医薬品中に存在する微量の微生物または微生物由来の物質を含む広範囲な分野で使用され得る。上記吸着剤、およびセンサーは、酵素などの生体由来物質を用いないので、取り扱いが簡便で、安定性に優れ、かつ広範囲な分野で使用され得るコストパーフォーマンスに優れた測定方法が提供される。
１ 電極
２ 未成長ポリピロール膜
３ ポリピロール膜
４ ケーブル
５ 感応部
６ 検知部
７ 容器
Ｓ 被検試料
Ｓ’ 綿棒
２ 未成長ポリピロール膜
３ ポリピロール膜
４ ケーブル
５ 感応部
６ 検知部
７ 容器
Ｓ 被検試料
Ｓ’ 綿棒
Claims (6)
- ＡＴＰを検出するセンサーであって、
電極、
該電極上に配置されたポリマー層であって、該ＡＴＰの立体構造に相補的な三次元構造を有する分子鋳型を備えたポリマー層、
該ポリマー層の導電性の変化を導出する導出部を備え、
該三次元構造が、該ポリマー層を形成する際に該ポリマーのモノマーを該ＡＴＰの存在下で重合する工程、および得られた重合体を過酸化する工程によって形成される、センサー。 - 前記電極が第１の電位にあるとき、前記ＡＴＰを前記分子鋳型に捕捉し、前記電極が該第１の電位とは異なる第２の電位にあるとき、捕捉されたＡＴＰから酸化あるいは還元電流を生じる、請求項１に記載のセンサー。
- 前記電極に接続される電源をさらに備え、該電源が該電極に前記第１の電位を印加することによって前記ＡＴＰを前記分子鋳型に濃縮する、請求項１に記載のセンサー。
- 前記導出部に接続され、前記導電性の変化を計測する検知部をさらに備える、請求項１に記載のセンサー。
- 前記電極、前記ポリマー層、および前記導出部が感応部を構成し、該感応部と、前記電源および前記検知部とが脱着可能に連結されている、請求項４に記載のセンサー。
- 前記モノマーが、ピロール、アニリン、チオフェンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載のセンサー。
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