JPH0287056A

JPH0287056A - 酵素センサ

Info

Publication number: JPH0287056A
Application number: JP63238060A
Authority: JP
Inventors: Teruaki Katsube; 勝部　昭明; Hideichiro Yamaguchi; 秀一郎山口; Takeshi Shimomura; 猛下村
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1988-09-23
Filing date: 1988-09-23
Publication date: 1990-03-27

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はグルコース、尿素等の基質濃度の測定に用いら
れる酵素センサに関する。

［従来の技術］従来、グルコース、尿素、尿酸、アミノ酸などの基質濃
度の測定に用いるセンサとして酵素センサが知られてい
る。この酵素センサでは、酵素を固定化した膜を白金電
極やイオン選択性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）
のゲート電極の表面に被着させ、酵素反応の進行に伴っ
て生成あるいは消費される化学種（例えば、Ｈ２Ｏ２゜
［Ｈｊ］、０２等）を該電極等で検出し、電気信号とし
て取り出して基質濃度を測定するものである。

上記酵素の固定化法としては、物理的方法及び化学的方
法がある。物理的方法としては、例えばアクリルアミド
等の高分子ゲル中に酵素を包括させる包括法、また化学
的方法としては、酵素間を官能基を複数もつ試薬、例え
ばグルタルアルデヒドで架橋する架橋法がそれぞれよく
用いられている。

し発明が解決しようとする課題］しかしながら、このような従来の酵素センサにあっては
、固定化酵素に好冷菌や常温菌などの室温付近で育成す
る生物から抽出した酵素を用いているため、酵素固定化
膜の作製、被着などの作業や電極の保存を室温以下の低
温で行う必要があり、大量生産のプロセスに取り入れる
ことが困難であった。また、従来の酵素固定化膜では膜
の担体そのものの耐熱性がなく、４０℃以上の高温に達
するプロセス、また保存や使用には耐えないという問題
があった。

本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、
耐熱性及び耐溶媒性に優れ、４０℃以上の高温の状態に
おいても利用可能な酵素センサを提供することを目的と
する。

［課題を解決するための手段］上記課題を解決するために、本発明においてはけ導電性
基体と、該導電性基体上に設けられるとともに酵素が電
解重合法により固定化されてなる酵素固定化膜とを備え
た酵素センサであって、前記酵素が好熱性生物に由来す
ることを特徴とする。ここで、前記好熱性生物は４０’
Ｃ以上の温度で失活せず、かつ生育可能な生物であるこ
とが好ましく、また前記酵素を固定化する膜は、ポリピ
ロール、ポリアニリン、ポリ　（ジアミノベンゼン）及
びポリ（トリアミン）の中のいずれかにより成膜されて
なることが好ましい。さらに、前記導電性基体は、酸化
イリジウム、酸化ルテニウム、酸化パラジウム、白金及
び金の中のいずれかにより形成されてなることが好まし
い。また、前記導電性基体が電界効果トランジスタのゲ
ート部上又は該ゲート部の延長部上に薄膜状に形成され
てなることが好ましい。

［作　用］上記のように構成された酵素センサにおいては、酵素固
定化膜に固定化させる膜として好熱性生物に由来する酵
素を用いるようにしたので、耐熱性及び耐溶媒性に優れ
、さらに固定化する膜としてポリピロール等の高温で安
定な重合膜を用いるようにすれば、実用的な立場から、
より安定したセンサとなる。

［実施例コ以下、本発明の実施例を図面を参照して具体的に説明す
る。

第１図は本発明の一実施例に係る酵素センサを示す平面
図である。図中、１０はサファイア基板であり、このサ
ファイア基板１０上に酸化イリジウム（Ｉ　ｒｏ　２）
からなる導電性膜１１が形成されている。この導電性膜
１１の一端側は導電性接着膜１３を介してリード線１２
に電気的に接続されるとともに絶縁性接着膜１４により
被覆されている。また、導電性膜１１の他端側には酵素
固定化膜１５が積層されている。この酵素固定化膜１５
は例えばビロールの電解重合層に４０℃以上の温度でも
失活せず、かつ生育可能な好熱性生物由来の酵素、例え
ばグルコキナーゼを固定化したものである。

すなわち、本実施例によるセンサは、酸化イリジウムか
らなる導電性膜１１とグルコキナーゼが固定化された酵
素固定化膜１５との積層構造を形成して酵素センサとし
たものである。この酵素センサを基準電極及び対極とと
もに溶液中に浸漬して電流変化を測定すると、酸化イリ
ジウムを導電性基体としているので、酵素反応の進行に
よって変化する水素イオン濃度を起電力の変化として検
出することにより基質濃度を測定できる。より具体的に
説明すると、グルコキナーゼをポリピロール膜に固定化
した上記センサは、グルコースセンサ又はＡＴＰセンサ
として利用することができる。すなわち、グルコキナー
ゼは、次式の反応を触媒するので、試料溶液のＡＴＰ濃
度を一定に保てば、水素イオン濃度の変化によりグルコ
ース濃度を測定することができる。また、逆にグルコス
濃度を一定にすれば、ＡＴＰ濃度を測定することができ
る。

・６−リン酸＋ＡＤＰ＋　［Ｈ“］（ＡＴＰ：アデノシン３リン酸塩、ＡＤＰ：アデノシン
２リン酸塩）なお、上記の反応においては、グルコキナーゼの活性を
高めるため、Ｍｇ２＋を含むことが望ましい。

上記センサにおいて、好熱性生物由来の酵素としてのグ
ルコキナーゼは、４０℃以上の温度でも失活せず、かつ
生育可能であるため、耐熱性があり、また、ｐＨや化学
的変性剤に対して高い耐性を有している。また、ポリピ
ロール膜は高温でも安定であり、したがって、このポリ
ピロール膜にグルコキナーゼを固定化させることにより
、実用的な立場から安定性に優れた酵素センサを製作す
ることができる。

また、上記ポリピロール膜を電解重合法により形成する
ようにずれば、マルチセンサの製造が容易であるととも
に製造工程を簡略化することができる。

なお、上記実施例においては、酵素を固定化する膜とし
てポリピロールを用いたが、含窒素あるいは含硫黄複素
環化合物の高分子化合物、ポリアニリン、ポリ　（ジア
ミノベンゼン）、ポリ（トリアミン）等の芳香族アミン
化合物の高分子化合物を用いてもよく、また、導電性膜
１１として酸化イリジウムを用いたが、その他酸化ルテ
ニウム、酸化パラジウム、白金、金等を用いても上記と
同様の効果が得られるものである。さらに、好熱性生物
に由来する酵素としては、その他にアデニレトキナーゼ
、酢酸キナーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ
、ピリビン酸キナーゼなどを用いても同様の効果が得ら
れる。

次に、本発明者等は本発明の効果を確認するために以下
のような実験を行った。

（実験例１）第１図に示したサファイア基板１０（面方位１１０２）
の表面上に２極式ＲＦスパッタリング装置（アネルバ社
、５ＰＦ−２１ＤＨ）を用い酸素プラズマで酸素圧力５
　Ｘ　１０−２Ｔｏｒｒ、流量１０〜１５　ｍ　１２　
／ｍｉｎ　、電力量２０Ｗの条件で、導電性膜として膜
厚約１０００人の酸化イリジウム（ＩｒＯ２）膜を形成
した。なお、電極パターンの形成には、金属マスクを用
いた。次に、直径１２０μｍのウレタン被覆銅線からな
るリード線１２を導電性接着膜１３を用いて接着した後
、絶縁性樹脂膜１４で絶縁した。続いて、上記酸化イリ
ジウム膜の基板側を作用電極として、下記の条件で電解
を行い、酵素固定化膜１５を形成した。酵素には、好熱
菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ由来のグルコキナーゼを用いた。電解には、電解
液をビロール０．１Ｍ、グルコキナーゼ１０００〜２０
００ｕｎｉｔｓ　／　ｍ　Ｉ！、及び過塩素酸ナトリウ
ム０．１Ｍの混合溶液とし、基準電極を飽和塩化ナトリ
ウムせコウ電極（以下、５ＳＣＥという）、また対向電
極を白金線とした。

そして、上記３電極の微小セルを用い、３０〜６０μβ
の電解液を用いて、０〜＋１．１■（ｖｓ、５ＳＣＥ）
の範囲で、掃引速度５０ｍＶ／ｓｅｃで１０分間電解さ
せた。その結果、グルコキナーゼが固定されたポリピロ
ール膜（膜厚０．１〜５．０μｍ）を得た。

第４図に上記電解重合時のサイクリックポルタモグラム
を示す。電位掃引の回数毎に電流値が減少して成膜が進
行しており、生成膜は濃茶色であった。また、比較のた
めに電解液の支持電解質塩としてトリス緩衝溶液を用い
たが、この場合、全く重合反応が生起しなかった。

（実験例２）実験例１のサファイヤ基鈑１０上に、第２図に示すよう
に電界効果トランジスタ１６を形成するとともに、この
トランジスタ１６のゲート部に電気的に接続させて導電
性膜１１として酸化イリジウム膜を形成し、さらにこの
酸化イリジウム膜上にグルコキナーゼを固定した酵素固
定膜１５を積層させ、その後酵素固定膜１５を除く領域
全面を絶縁性樹脂膜１７により被覆し、ＦＥＴ酵素セン
サとした。

（実験例３）実験例１のサファイア基板ｌＯの代りに第３図に示す電
界効果型トランジスタ１８を用いた以外は実験例１と同
様にして、導電性膜１１として酸化イリジウム膜を形成
し、この酸化イリジウム膜上にグルコキナーゼを固定し
た酵素固定化膜１５を積層し、さらにこの酵素固定膜１
５を除く領域全面を絶縁性樹脂膜１７により被覆してＦ
ＥＴ酵素センサとした。

次に、上記実験例１〜３で作製した酵素センサの特性を
測定液で基質（グルコース）濃度を変えて検討した。測
定液の組成は、トリス−ＨＣ１２緩衝溶液２０　ｍ　Ｍ
　（ｐ　Ｈ８、０）　、　Ａ　Ｔ　Ｐ　４　ｍ　Ｍ、Ｍ
ｇＣ，９２２０ｍＭ、グルコース０〜５００ｍｇ／ｄｌ
とした。測定には０．６ｍｌ容量のテフロン製セルを用
い、撹拌子で撹拌させながら、温度を一定に保った。グ
ルコース濃度を５〜１０００ｍｇ／ｄｉに変化させた時
の出力応答（電圧）を第６図に示す（測定温度３０±０
．５’ｃ）、グルコース濃度１０〜ｌ　Ｏ００ｍｇ／ｄ
　１の範囲で、出力応答は直線性を示すことが判明した
。また、このグルコースセンサの温度による影響を調べ
た。第７図にその結果を示す。１０〜９０℃の範囲で温
度上昇とともに出力応答が０゜２５ｍＶから約０．９ｍ
Ｖまで上昇しており、感度が向上していることが観測で
き、６０〜８０℃の温度のときに出力感度のピーク（約
０．９ｍＶ）があることが判明した。また、グルコース
濃度の変化に対する応答は、第５図に時間と出力電圧と
の関係を示すように約１分間と速いことが判明した。

なお、電界効果トランジスタとしては、ＭＯＳ　（Ｍｅ
ｔａｌ　０ｘｉｄｅ　Ｓｅｍ１ｃｏｎｄｕｃｔｏｒｌ型
、接合型、ショットキー型のものを用いても、同様の効
果が得られる。

［発明の効果〕以上詳述したように本発明に係る酵素センサにおいては
、酵素固定化膜に固定化させる酵素として、グルコキナ
ーゼ等の好熱性生物に由来する酵素、特に４０℃以上で
失活せず、かつ生育可能な酵素を用いるようにしたので
、従来のセンサに比べて耐熱性及び耐溶媒性が向上し、
したがって寿命が長くなるとともに、半導体製造プロセ
ス等の大量生産のプロセスに利用することが容易であり
、またその保存を冷蔵あるいは冷凍下で行う必要がなく
なり、保存が容易になるという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例に係る酵素センサの構造を示
す概略平面図、第２図及び第３図はそれぞれ本発明の他
の実施例に係る酵素センサの縦断面図、第４図は上記セ
ンサの電解重合膜形成時のサイクリックポルタモグラム
、第５図は上記センサのグルコースに対する応答速度を
示す特性図、第６図は同じくグルコース濃度に対する応
答（検量線）を示す特性図、第７図は同じく出力電圧の
温度依存性を示す特性図である。１０・・・サファイア基板１・・・導電性膜２・・・リード線４．１７・・・絶縁性樹脂膜５・・・酵素固定化膜

Claims

【特許請求の範囲】

（１）導電性基体と、該導電性基体上に設けられるとと
もに酵素が電解重合法により固定化されてなる酵素固定
化膜とを備えた酵素センサであって、前記酵素が好熱性
生物に由来することを特徴とする酵素センサ。
（２）前記好熱性生物は４０℃以上の温度で失活せず、
かつ生育可能な生物である請求項１記載の酵素センサ。
（３）前記酵素を固定化する膜は、ポリピロール、ポリ
アニリン、ポリ（ジアミノベンゼン）及びポリ（トリア
ミン）の中のいずれかにより成膜されてなる請求項１又
は２記載の酵素センサ。
（４）前記導電性基体は、酸化イリジウム、酸化ルテニ
ウム、酸化パラジウム、白金及び金の中のいずれかによ
り形成されてなる請求項１乃至３のいずれか１つに記載
の酵素センサ。
（５）前記導電性基体が電界効果トランジスタのゲート
部上又は該ゲート部の延長部上に薄膜状に形成されてな
る請求項１乃至４のいずれか１つに記載の酵素センサ。