CN108760859A - 一种血红蛋白和介孔碳-金纳米星复合材料修饰电极的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明了涉及一种血红蛋白(Hb)与介孔碳‑金纳米星(C‑AuNS)复合材料修饰电极的制备方法及其应用,所述制备方法包括以下步骤:(1)取适量C‑AuNS溶液滴涂在CILE表面,在室温条件下避光自然晾干得C‑AuNS/CILE电极;(2)取适量Hb溶液滴涂在C‑AuNS/CILE电极表面,在室温条件下避光自然晾干得Hb/C‑AuNS/CILE电极;(3)取适量Nafion乙醇溶液滴涂在Hb/C‑AuNS/CILE电极表面,室温下避光晾干后,即得Nafion/Hb/C‑AuNS/CILE电极。本发明制得的修饰电极对三氯乙酸电催化还原效果良好,线性范围宽,检测限低,灵敏度高,可很好应用于检测这种物质在目标物中含量。
Description
技术领域
本发明属于纳米复合材料和电化学分析技术领域,具体涉及一种用于检测三氯乙酸的修饰电极的制备方法和应用。
背景技术
生物传感器是将生物材料、生物衍生材料或生物模拟材料与各种物理化学传感器或传感微系统密切结合起来的一类分析器件。生物传感器是在研究化学传感器的基础上发展起来的,同时结合生物、化学、物理、医学和电子等多种技术的高新技术学科,已经成为目前研究非常活跃的一门交叉学科。传感器有两个特征功能化元件:识别元件是用来与目标分析物选择性或特异性结合,换能元件用来把结合反应信号化。高效的传感器对识别元件和换能元件的要求较高,其性能可以影响到识别过程的响应时间、信噪比(S/N)选择性、检测限(LOD)等参数,目前许多新材料都被用于改进和提高传感性能参数。
电化学生物传感器是生物传感器的一种,它是指以生物材料作为敏感元件,各种电极(固体电极、离子选择性电极等)作为转换元件,以电流、电导、电位、电阻或电容等为特征电化学检测信号的传感器,因此电化学生物传感器又叫做生物电极。自从Clark和Lyon等人首次提出将酶与生物电极结合的报道之后,Updike和Hicks等人报道了将葡萄糖氧化酶用聚丙烯酰胺凝胶膜固定在氧电极的表面制备出第一支酶电极。此后关于电化学生物传感器和酶电极方面的研究迅猛发展,相关报道一直占领生物传感器的主导地位。电化学生物传感器不仅具有电化学分析速度快、灵敏度高等优势,还结合了生物识别的特异性和选择性高等特点,是一种快速的可直接获取复杂体系相关信息的分析工具,在生物技术、医药工业、环境分析、临床检测和食品工业等众多领域均有广泛的研究与应用。
三氯乙酸(TCA)是有机卤素环境污染物之一,它也被广泛应用于农业和公共安全领域,如经常存在于用次氯酸消毒过的饮用水中。对三氯乙酸的毒理学研究表明,它能够导致生物体内的肺肿瘤,也可以造成癌症和影响人类生殖功能。因此世界卫生组织明确规定水环境中三氯乙酸的安全存在量为100 μg L-1。
综上,研发一种修饰电极,对三氯乙酸这种物质能快速且准确检测显得尤为重要。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种血红蛋白和介孔碳-金纳米星复合材料修饰电极的制备方法及其应用,所制得的修饰电极对三氯乙酸电催化还原效果良好,表现出线性范围宽,检测限低,灵敏度高等优点,可很好应用于检测物质在目标物中的含量。
本发明提供一种介孔碳-金纳米星复合材料和血红蛋白的修饰电极,其特征在于该电极内向外依次包括基底电极(CILE)、介孔碳-金纳米星(C-AuNS)涂层、血红蛋白(Hb)涂层、Nafion涂层,即Nafion/Hb/C-AuNS/CILE电极。
本发明提供一种电化学生物传感器件,其特征在于以本发明上述血红蛋白和介孔碳-金纳米星复合材料修饰电极作为工作电极,优选以Nafion/Hb/C-AuNS/CILE电极作为工作电极。
本发明提供上述血红蛋白和介孔碳-金纳米星复合材料修饰电极(优选Nafion/Hb/C-AuNS/CILE电极)的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
S1、取1.6 g石墨粉、0.8 g离子液体N-己基吡啶六氟磷酸盐(HPPF6)置于研钵中均匀研磨2h,得到碳糊,然后将碳糊填入玻璃电极管中压实,内插打磨好的铜丝作为导线,得到碳离子液体电极CILE;
S2、取6 μL介孔碳-金纳米星的混合溶液滴涂在CILE表面,室温条件下避光自然晾干,得到C-AuNS/CILE电极;
S3、再取8 μL 15 mg mL-1 Hb溶液滴涂在C-AuNS/CILE电极表面,在室温下避光自然晾干,得到Hb/C-AuNS/CILE电极;
S4、最后取6μL 0.5% Nafion乙醇溶液滴涂在Hb/C-AuNS/CILE电极表面,室温下避光晾干后,即得到Nafion/Hb/C-AuNS/CILE电极。
本发明任一项所述的血红蛋白和介孔碳-金纳米星复合材料修饰电极用于电催化还原三氯乙酸。
本发明任一项所述的血红蛋白和介孔碳-金纳米星复合材料修饰电极用于检测三氯乙酸。
本发明所述的血红蛋白和介孔碳-金纳米星复合材料修饰电极的检测环境为在pH4.0的磷酸盐缓冲溶液中。
本发明中,HPPF6为N-己基吡啶六氟磷酸盐,CILE为碳离子液体电极,C为介孔碳,AuNS为金纳米星,Hb为血红蛋白,Nafion为全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物,TCA为三氯乙酸,PBS缓冲液为磷酸盐缓冲溶液。
一、附图说明
图1为不同修饰电极在pH 4.0 的PBS缓冲溶液,扫描速度为100 mV s-1时的循环伏安图,其中曲线a为CILE的循环伏安曲线,曲线b为Nafion/CILE的循环伏安曲线,曲线c为Nafion/Hb/CILE的循环伏安曲线,曲线d为Nafion/Hb/AuNS/CILE的循环伏安曲线,曲线e为Nafion/Hb/C/CILE的循环伏安曲线,曲线f为Nafion/Hb/C-AuNS/CILE的循环伏安曲线;
图2为Nafion/Hb/C-AuNS/CILE在不同扫描速度下的循环伏安图(从 a到j扫速分别为100, 200, 300, 400, 500, 600, 700,800, 900,1000 mV·s-1);
图3为不同pH缓冲溶液中Nafion/Hb/C-AuNS/CILE的循环伏安图 (a到h分别为pH为2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0);
图4为Nafion/Hb/C-AuNS/CILE在不同浓度TCA存在下的循环伏安图,(a到l分别为3,20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 mmol L-1),其中插图为还原峰电流与TCA的浓度之间的关系曲线图;
图5为Hb和Hb-C-AuNS溶液的紫外可见吸收光谱图,曲线a为Hb在Hb-C-AuNS混合液中的紫外可见吸收光谱图,曲线b为Hb水溶液的紫外可见吸收光谱。
二、研究了Hb在pH=4.0的PBS缓冲溶液中的直接电化学行为
研究了Hb在pH=4.0的PBS缓冲溶液中、扫描速度100 mV•s-1的直接电化学行为,结果如图1所示,从图中可以看出:
在曲线(a) CILE和曲线(b) Nafion/CILE上,没有任何氧化还原峰出现,即表面没有电活性物质存在于电极表面;
在曲线(c) Nafion/Hb/CILE上,出现一对氧化还原峰,这说明Hb分子和CILE电极之间存在着电子转移;
在曲线(d) Nafion/Hb/AuNS/CILE上,出现一对氧化还原峰且氧化还原峰电流有所增加,这说明AuNS的存在有效的加快了Hb分子与电极之间的电子转移速度;
在曲线(e) Nafion/Hb/C/CILE上,出现一对氧化还原峰且氧化还原峰电流继续增加,这说明介孔碳的存在有效的加快了Hb分子之间的电子转移;
在曲线(f) Nafion/Hb/C-AuNS/CILE上,出现一对峰形良好且稳定的氧化还原峰,氧化还原峰电流最大。说明C-AuNS混合材料具有优良的导电性和生物相容性,可以提供大的比表面积并吸附大量的Hb分子进而可以加快电子转移,表现出最大的峰电流响应。从曲线f中可以得到峰电位分别为Epa = -0.238V和Epc = -0.323 V (vs. SCE),峰电位差(△Ep)为0.085 V,式电位 E0'= -0.280 V (vs. SCE),峰电流分别为Ipa = 27.86 μA和Ipc =31.19μA 氧化还原峰电流之比接近于1,表现出蛋白质内血红素辅基Fe(III)/Fe(II)电对的特征电化学行为。
三、研究扫描速度对Hb电化学信号响应的影响
研究了扫描速度对本发明的Nafion/Hb/C-AuNS/CILE 电化学信号响应的影响,结果如图2所示。在100~1000 mV s-1的扫描速度范围内均得到了Hb的一对对称的氧化还原峰,且氧化还原峰电流Ipa与Ipc随扫描速度的升高而增大,表明Hb的直接电化学是一个准可逆的电极过程。进一步求解出峰电流与扫速的线性关系其线性回归方程分别为Ipa(µA)= - 69.48ʋ(V/s)- 1.183(n = 7,γ = 0.998)和Ipc(µA)= 60.67 ʋ(V/s)+ 6.265(n = 8,γ =0.997)。表明Nafion/Hb/C-AuNS/CILE上的反应属于薄层电化学行为,即电极反应由吸附过程控制。随着扫描速度的增大,峰电位差△Ep逐渐增大,Ep与lnυ之间的线性回归方程为Epa(V)= 0.039 lnʋ(V/s)- 0.109(n = 8,γ = 0.999),Epc(V)= -0.060 lnʋ(V/s)+0.394(n= 7,γ = 0.992)。根据Laviron理论及相应的公式,计算出电子转移数 n=1.076,电子传递系数α = 0.397。反应速率常数ks= 1.125 s-1,说明C-AuNS修饰电极中Hb的直接电子转移具有较快速率。
四、研究pH对Hb电化学信号响应的影响
研究了磷酸盐缓冲溶液的pH对Nafion/Hb/C-AuNS/CILE直接电化学行为的影响,循环
伏安扫描曲线结果如图3所示。随着缓冲溶液的pH增大,Hb的氧化还原电位均向负方向移
动。当pH在2.0~9.0范围内Hb的电化学行为是一个准可逆过程,式电位(E0′)与pH值的大小呈
良好的线性关系,线性回归方程为E0'=-0.05448 pH+0.04901 (n=8, γ=0.999)。。由方程斜
率可知式电位随着一个单位的pH的增加而增加-54.48 mV,稍小于理论值(-59 mV pH-1),表明
Hb在Nafion/Hb/C-AuNS/CILE上发生一个电子和一个质子的转移,Hb Fe(III) + H + e
Hb Fe(II)。当pH=4.0时的氧化还原峰电流最大,表明最佳氧化还原反应pH为4.0。
五、对TCA电催化行为
研究了本发明的Nafion/Hb/C-AuNS/CILE电极在pH 4.0的PBS缓冲溶液中电催化还原TCA的催化效果,结果如图4所示。逐渐滴加不同浓度的TCA至10 mL PBS溶液后,可观察到在-0.239 V左右出现一个还原峰,随着TCA浓度增加还原峰电流也随之增大,且在-0.468处出现新的还原峰,并且其相应的氧化峰随着TCA浓度增加逐渐减小甚至消失,这是一个典型的TCA电催化还原过程。当TCA的浓度在3.0~220.0mmol L-1的范围内时,还原峰电流和TCA的浓度大小成良好的线性关系,得出线性回归方程为:Ipc(µA)=2.54C(mmol/L)+3.46(n=11,γ=0.998),检测限为1.0 mmol L-1 (3σ),KMapp为79.78 mmol L-1,表明Nafion/Hb/C-AuNS/CILE对TCA的电催化效果良好。
六、研究Hb-C-AuNS和Hb在pH=4.0缓冲溶液中的紫外可见吸收光谱
紫外-可见吸收光谱(UV-Vis spectroscopy)是根据血红素中三价铁的Soret吸收带的位置和形状来判断血红素蛋白质是否变性的有效手段,当蛋白质的结构出现变化或者发生变性时,对应的吸收带就会迁移或者消失。利用UV-Vis法考察了Hb及其与C-AuNS混合溶液的光谱曲线,结果如图5所示。在Hb-C-AuNS混合液中Hb的Soret的吸收带位于405nm处(曲线a),其位置与Hb自身的Soret吸收带位置一致(曲线b)。这表明在溶液中Hb与C-AuNS混合后仍保持其固有结构,没有发生变性。
七、Nafion/Hb/C-AuNS/CILE对生物样品的检测
探究了修饰电极Nafion/Hb/C-AuNS/CILE对含有TCA的医用换肤液进行实际样品测定实验(如表),检测结果令人非常满意,得到的回收率在105.13%到108.88%之间。实验数据与理论值对比表明,修饰电极Nafion/Hb/C-AuNS/CILE可以应用于实际药物样品的检测中。
Claims (8)
1.一种基于介孔碳—金纳米星(C-AuNS)复合材料的血红蛋白修饰电极的制备,其特征在于:所述修饰电极包括基底电极,以及依次固定在基底电极上的介孔碳与金纳米星复合材料Hb分子和Nafion膜;作为优选,所述基底电极为碳离子液体修饰电极(CILE)。
2.根据权利要求1所述的修饰电极,其特征在于:所述介孔碳用蒸馏水分散超声震荡;所述介孔碳的浓度为0.3~2.0 mg mL-1 ,优选0.5 mg mL-1。
3.根据权利要求1所述的修饰电极,其特征在于:所述介孔碳与金纳米星的混合方法为:取0.5 mg mL-1的介孔碳与金纳米星以1:2的比例混合超声震荡。
4.根据权利要求1所述的修饰电极,其特征在于:所述血红蛋白的浓度为10~20 mg mL-1,优选15 mg mL-1。
5.权利要求1-4任一所述的修饰电极的制备方法,其特征在于:步骤如下:
(1)取适量C-AuNS溶液滴涂在CILE基底电极表面,室温条件下避光自然晾干,得到C-AuNS/CILE电极;
(2)取适量Hb溶液滴涂在C-AuNS/CILE电极表面,在室温下避光自然晾干,得到Hb/C-AuNS/CILE电极;
(3)取适量Nafion乙醇溶液滴涂在Hb/C-AuNS/CILE电极表面,在室温下避光晾干后,即得到Nafion/Hb/C-AuNS/CILE电极;
步骤(1)所述CILE基底电极的制备方法包括如下步骤:将适量的石墨粉与离子液体HPPF6置于研钵中研磨均匀,得到碳糊,然后将碳糊填入玻璃管中压实,内插铜丝作为导线,得到离子液体修饰碳糊电极,即CILE基底电极;其中,石墨粉与离子液体HPPF6的质量比为1.5~2.5:1,优选2:1;研磨的时间为2.0~3.0 h;玻璃电极管内径为 4 mm;
步骤(1)中所述C-AuNS溶液的浓度为0.5 mg mL-1,其用量以能均匀涂布CILE电极表面为宜;
步骤(2)所述Hb溶液的浓度为10~20 mg mL-1,优选15 mg mL-1,其用量以能均匀涂布C-AuNS/CILE电极表面为宜;
步骤(3)所述Nafion乙醇溶液的体积浓度为0.3~0.7%,优选0.5%,其用量以能均匀涂布Hb/C-AuNS/CILE电极表面为宜。
6.本发明提供上述血红蛋白和介孔碳-金纳米星复合材料修饰电极(优选Nafion/Hb/C-AuNS/CILE电极)在制备电化学生物传感器件中的应用。
7.本发明提供上述血红蛋白和介孔碳-金纳米星复合材料修饰电极(优选Nafion/Hb/C-AuNS/CILE电极)在电催化还原三氯乙酸中的应用。
8.本发明提供上述血红蛋白和介孔碳-金纳米星复合材料修饰电极(优选Nafion/Hb/C-AuNS/CILE电极)在检测三氯乙酸中的应用。
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