CN110220959A - 一种基于聚合膜修饰电极的l-谷氨酸检测方法及传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于聚合膜修饰电极的L‑谷氨酸（L‑Glu）检测方法及传感器，所述方法包括制备MWCNTs、制备PTrp/MWCNTs/GCE电极和L‑谷氨酸检测等步骤。结果表明，在乙酸‑乙酸钠缓冲溶液中，修饰电极的示差脉冲伏安响应峰电流与L‑Glu的浓度在5.000×10‑8～1.500×10‑5 mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为2.580×10‑8 mol/L（S/N=3）。该电极具有高选择性，良好的重现性和稳定性。将该电极用于猪血清样品中L‑Glu的测定，与高效液相色谱方法的测定结果一致，且回收率达到94.8%～104.5%，表明该电极有望成为谷氨酸无酶检测的一个新手段，可应用于生命分析和动物营养领域。
Description
技术领域
本发明属于化学/生物传感技术领域，具体涉及一种基于聚合膜修饰电极的L-谷氨酸检测方法及传感器。
背景技术
L-谷氨酸(L-Glu)是生物体中20种常见的氨基酸之一，作为一种风味添加剂广泛存在于食品之中，在生命健康、临床医学、食品加工等领域具有非常重要的作用。L-谷氨酸是哺乳动物中重要的兴奋性神经递质，与某些行为模式如学习、记忆等有关，大脑中某个特定区域的L-谷氨酸浓度发生变化与阿尔茨海默氏症和帕金森症等疾病密切相关。而且，由于食物如蔬菜等中缺乏L-谷氨酸，L-谷氨酸通常被添加到饮食、食品和药物配方中，然而过量地食用L-谷氨酸会造成不良的反应如头痛和胃痛等。此外，作为化工原料，L-谷氨酸被用于生产3-氰基丙酸盐、琥珀腈等重要的生物试剂。因此，有必要建立一种简便、准确、快速、廉价的方法用于测定食品加工、药物、生物流体和临床分析中L-谷氨酸的含量。
常规不同的分析方法已经应用于L-谷氨酸的检测，例如高效液相色谱法、毛细管电泳法、荧光检测法、化学发光法。与这些方法相比，电化学方法具有准确性和灵敏度高、操作简单、可重复性强等优点，因而广泛应用于含氮小分子如L-谷氨酸的检测。
根据电子转移方式划分，L-谷氨酸电化学传感器可以分为两代。第一代传感器是应用范围最广泛的，通过测量消耗的O2或者产生的H2O2实现检测。第二代传感器使用氧化还原介质将电化学反应中产生的电子转移到电极的表面实现检测。两代L-谷氨酸传感器相比较，第二代传感器虽然制备过程复杂并且灵敏度较低，但是具有更低的检测电位和更好的选择性。然而无论是第一代还是第二代传感器都涉及酶的使用，这增加了传感器的成本并且限制了传感器的使用条件。因此很多研究者集中于使用廉价的材料研发新一代无酶的传感器。Jamal等利用Ni优秀的电催化能力制备了Ni纳米线电极实现L-谷氨酸的无酶检测，检测限为68.0μmol/L。
除了纳米材料外，导电聚合物由于具有良好的稳定性、选择性和重现性而广泛应用于电催化领域。色氨酸是20种常见氨基酸的一种，可以通过电聚合法轻易地固定在电极表面形成聚色氨酸(Polytryptophan)，聚色氨酸通过氨基和羧基的组合形成多个色氨酸的叠加和游离羧基的伸展，在电化学应用中展现出卓越的性能。碳纳米管也是一类具有广泛应用的材料，其具有大的表面积、良好的导电性以及很强的稳定性可以促进反应物和电极之间的电子转移，提升电极的灵敏度。但迄今为止，基于聚色氨酸(PTrp)负载碳纳米管的L-谷氨酸无酶修饰电极尚未见报道。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种基于聚合膜修饰电极的L-谷氨酸检测方法及传感器。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述基于聚合膜修饰电极的L-谷氨酸检测方法包括如下步骤：
(1)制备酸化的MWCNTs：将MWCNTs置于浓硫酸和浓硝酸的混合酸中，然后在120～180℃的油浴锅中搅拌回流加热10～60min，待混合液冷却后于10000～15000rpm的转速下离心3～30min，弃上清液，沉淀即为酸化的MWCNTs，洗涤并干燥后研磨粉碎，备用；其中，所述混合酸中浓硫酸和浓硝酸的体积比为(1～5)：1，所述MWCNTs与混合酸的比例为(150～250)g：(35～45)mL；
(2)制备PTrp/MWCNTs/GCE聚合膜修饰电极：对玻碳电极表面进行抛光，超声洗净后晾干；将酸化后的MWCNTs置于无水乙醇溶液中超声分散，得到MWCNTs浓度为0.5～2.0mg/mL的MWCNTs分散液；将MWCNTs分散液滴涂在玻碳电极表面，晾干后得到MWCNTs/GCE，再将MWCNTs/GCE聚合膜修饰电极置于含有0.03～0.09mol/L L-Trp的磷酸盐缓冲溶液中，采用循环伏安法在-0.2～2.0V范围内扫描20～25圈后得到PTrp/MWCNTs/GCE聚合膜修饰电极；
(3)以PTrp/MWCNTs/GCE聚合膜修饰电极为工作电极，以银/氯化银电极作为参比电极，以铂丝电极作为对电极，构成三电极体系；然后采用循环伏安法(CV)和交流阻抗法(EIS)考察L-谷氨酸在不同修饰电极上的电化学行为，并采用示差脉冲伏安法(DPV)对不同浓度的L-谷氨酸进行测试，绘制工作标准曲线，再采用标准加入法对待测样品中的L-谷氨酸进行检测。
优选地，步骤(2)中对玻碳电极表面进行抛光是分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对玻碳电极表面进行抛光。
优选地，步骤(2)中所述玻碳电极直径为3mm，将3.0～7.0μL，优选为5μLMWCNTs分散液滴涂至玻碳电极表面，晾干后得到MWCNTs/GCE，将MWCNTs/GCE电极置于10.0mL含有0.03～0.09mol/L L-Trp的磷酸盐缓冲溶液中；磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.0，0.01～0.10mol/L)优选为磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.0，0.02mol/L)。
优选地，步骤(3)中是在2.0mmol/L[Fe(CN)]4-/3--0.20mol/L Na2SO4溶液中采用循环伏安法和交流阻抗法考察L-谷氨酸在不同修饰电极上的电化学行为；在乙酸-乙酸钠缓冲溶液(SAB)中采用示差脉冲伏安法对不同浓度的L-谷氨酸进行测试，绘制工作标准曲线，再采用标准加入法对待测样品中的L-谷氨酸进行检测。所述乙酸-乙酸钠缓冲溶液的浓度为0.01～0.20mol/L，优选为0.10mol/L；乙酸-乙酸钠缓冲溶液的pH为pH3.60～4.20，优选为pH3.90。
所述基于聚合膜修饰电极的L-谷氨酸检测传感器包括作为工作电极的聚合膜修饰电极；所述聚合膜修饰电极包括玻碳基质(5)，所述玻碳基质(5)表面修饰有酸化MWCNTs层(6)，所述酸化MWCNTs层(6)上负载有PTrp膜层(7)，所述PTrp膜层(7)中存在L-Trp单元(9)。
优选地，所述传感器包括玻碳基质(5)的厚度为1.0～5.0mm，所述酸化MWCNTs层(6)的厚度为20～200nm，所述PTrp膜层(7)的厚度为5～50nm。
优选地，所述传感器对L-谷氨酸的浓度存在良好的线性关系，检测的线性范围为5.000×10-8～1.500×10-5mol/L，检出限为2.580×10-8mol/L。
本发明采用电聚合方法在酸化的多壁碳纳米管(MWCNTs)修饰的玻碳电极(GCE)上沉积聚色氨酸(PTrp)膜，形成可用于L-谷氨酸(L-Glu)灵敏检测的聚色氨酸负载碳纳米管修饰的玻碳电极(PTrp/MWCNTs/GCE)。利用透射电子显微镜(TEM)对材料形貌进行表征，采用循环伏安法(CV)和交流阻抗法(EIS)考查了L-Glu分子在不同修饰电极上的电化学行为以及反应机制，发现PTrp/MWCNTs/GCE对L-Glu表现出良好的电催化氧化特性。在乙酸-乙酸钠缓冲溶液(SAB)中，修饰电极的示差脉冲伏安(DPV)响应峰电流与L-Glu的浓度在5.000×10-8～1.500×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为2.580×10-8mol/L(S/N＝3)。该电极具有高选择性，良好的重现性和稳定性。将该电极用于猪血清样品中L-Glu的测定，与高效液相色谱方法的测定结果一致，且回收率达到94.8％～104.5％，表明该电极有望成为谷氨酸无酶检测的一个新手段，可应用于生命分析和动物营养领域。
附图说明
图1为基于聚合膜修饰电极的L-谷氨酸检测传感器的工作结构示意图；
图2为聚合膜电极PTrp/MWCNTs/GCE制备示意图；
图3为不同修饰材料如MWCNTs(A)，PTrp/MWCNTs(B)的透射电镜表征图；
图4：GCE(a)，MWCNTs/GCE(b)，PTrp/MWCNTs/GCE(c)在2.0mmol/L[Fe(CN)]3-/4--0.20mol/L Na2SO4溶液中的循环伏安图(A)和交流阻抗图(B)；
图5：GCE(a)，MWCNTs/GCE(b)，PTrp/GCE(c)，PTrp/MWCNTs/GCE(d)在含有1.000×10-5mol/L L-Glu的0.10mol/L乙酸-乙酸钠(pH＝3.90)溶液中的循环伏安图；
图6为不同实验条件参数对于DPV响应电流I的影响：碳纳米管用量(A)，色氨酸浓度(B)，聚合圈数(C)；
图7为不同pH下L-Glu的氧化峰电流(A)和峰电位(B)与pH的关系图；
图8为PTrp/MWCNTs/GCE在不同扫描速率下对L-Glu的CV响应曲线(A)，氧化峰电流与扫描速率关系曲线(B)，氧化峰电位与扫描速率自然对数关系曲线(C)；
图9为L-Glu在PTrp/MWCNTs/GCE电极上的氧化机理图；
图10为PTrp/MWCNTs/GCE对不同浓度L-Glu的DPV响应曲线(A)和响应峰电流与浓度线性关系曲线(B)；
图11为干扰物质对PTrp/MWCNTs/GCE电极的影响图。
图1中：1、银/氯化银电极；2、铂丝电极；3、玻碳电极；4、待测溶液；5、玻碳基质；6、酸化MWCNTs层；7、PTrp膜层；8、L-Glu；9、L-Trp单元。
具体实施方式
实施例中所用试剂均为分析纯(AR)，实验用水均为超纯水(电阻率≥18.3MΩ·cm)。以下描述中，氨基酸的描述均采用英文缩写。
一、实验过程
1、制备MWCNTs
将200g MWCNTs置于体积比为3:1的浓硫酸和浓硝酸的混合酸中(40mL)混合,然后在150℃的油浴锅中搅拌回流加热15min，待混合液冷却后在12000rpm的转速下离心处理5min，弃去上清液，下层沉淀即为酸化的MWCNTs，将产物用超纯水洗涤3次，以除去过量的酸，然后置于真空干燥箱中于75℃下干燥过夜，最后将产物研磨粉碎备用。
2、制备PTrp/MWCNTs/GCE聚合膜修饰电极
玻碳电极(GCE，直径3mm)表面分别使用0.3和0.05μm的氧化铝粉抛光成镜面，再依次使用无水乙醇和超纯水超声洗涤5min，晾干后备用。
取5.0mg酸化后的MWCNTs置于5.0mL的无水乙醇溶液中超声震荡30min得到黑色的MWCNTs分散液(1.0mg/mL)。量取5.0μL的MWCNTs分散液滴涂在玻碳电极表面。晾干后得到MWCNTs/GCE。将MWCNTs/GCE电极置于10.0mL含有0.06mol/L L-Trp的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.0，0.02mol/L)中，采用循环伏安法在-0.2～2.0V范围内扫描22圈后得到PTrp/MWCNTs/GCE电极。制备过程如图2所示。
3、L-Glu电化学检测
参见图1，以制备的玻碳电极3为工作电极，银/氯化银电极1为参比电极，铂丝电极2为辅助电极构建三电极体系进行测量，在2.0mmol/L[Fe(CN)]4-/3--0.20mol/L Na2SO4溶液中进行循环伏安(CV)和交流阻抗(EIS)测试电化学行为；在0.10mol/LCH3COOH-CH3COONa(pH＝3.90)缓冲溶液中进行L-Glu 8的DPV测试，完成对L-Glu浓度梯度(0.050，0.100，0.300，0.500,0.800，1.000，3.000，5.000，8.000，10.00，15.00μM)的响应曲线与线性关系的检测。
其中，所述表面修饰的玻碳电极3即为本发明所述基于上述基于聚合膜修饰电极的L-谷氨酸检测传感器中的聚合膜修饰电极；所述聚合膜修饰电极包括玻碳基质5，所述玻碳基质5表面修饰有酸化MWCNTs层6，所述酸化MWCNTs层6上负载有PTrp膜层7，所述PTrp膜层7中存在L-Trp单元9。所述传感器包括玻碳基质5的厚度为1.0～5.0mm，所述酸化MWCNTs层6的厚度为20～200nm，所述PTrp膜层7的厚度为5～50nm。
4、样品处理与测定
猪血样品来自于中科院亚热带农业生态研究所(长沙)培育的三元杂小猪(体重为10～15Kg)，每头猪取猪血液5.0mL，于4500r/min条件下离心处理15min，取上清液置于5mL玻璃离心管中，重复三次，将上清液置于玻璃管中于4℃下保存备用。采用标准加入法对猪血清样品(待测溶液4)中L-Glu进行检测。分别将6个不同的猪血清样品(10.00μL)加入pH＝3.90的乙酸-乙酸钠缓冲溶液(9.990mL)中，再向猪血清样品溶液中加入不同浓度的L-Glu(0.200，0.400，0.600，0.800，1.000,1.200μM)，采用DPV法进行测定。
二、实验结果与分析
1、材料的表征
1.1、形貌表征
使用TEM分别对酸化的MWCNTs，PTrp/MWCNTs/GCE形貌进行表征，结果如图3所示。未经修饰的MWCNTs是一种疏溶管材料，MWCNTs之间存在着强烈的范德华力，所以MWCNTs会高度缠绕在一起(图3A)。图3B可见MWCNTs表面附着了一层紧密的薄膜表明色氨酸已经成功聚合到电极表面，同时MWCNTs分散度较图3A提高是因为电聚合的色氨酸带有负电性，当附着在碳纳米管表面后通过静电排斥作用使得MWCNTs分散度更高。
1.2、电化学表征
采用循环伏安法(CV)和交流阻抗法(EIS)对修饰电极制备过程进行了电化学表征，图4(A)和(B)为裸电极和不同材料修饰电极在2.0mM[Fe(CN)]3-/4--0.20M Na2SO4溶液中的CV和EIS图。
图4(A)中GCE(曲线a)在0.129V和0.194V处分别出现一个氧化峰和还原峰，修饰了MWCNTs后的MWCNTs/GCE电极(曲线b)氧化还原峰电流同时增加，对应图4(B)中曲线b的阻值减小，是因为酸化的MWCNTs的网状结构增大了电极的表面积使得灵敏度增加，表明MWCNTs成功修饰到电极表面。电聚合色氨酸后的PTrp/MWCNTs/GCE电极(曲线c)氧化还原电流进一步提升，对应图4(B)中曲线c的阻值降低，是因为电极表面聚合了一层带电薄膜，同时通过静电排斥作用使得MWCNTs分散度更高，增大了电极的的表面，极大地促进了电子的传递，这与TEM表征结果一致，表明PTrp/MWCNTs/GCE电极制备成功。
2、L-Glu电化学行为
采用循环伏安法(CV)研究了不同电极在含有1.000×10-5mol/L L-Glu的乙酸-乙酸钠溶液(pH＝3.90)的电化学行为。如图5所示，L-Glu在GCE(曲线a)和MWCNTs/GCE(曲线b)电极上没有氧化峰产生，说明GCE和MWCNTs/GCE对L-Glu没有响应。而PTrp/GCE(曲线c)在0.235V处产生一个氧化峰，说明聚合色氨酸对L-Glu有较好的氧化作用。与PTrp/GCE相比，PTrp/MWCNTs/GCE对L-Glu的氧化峰电位正移至0.272V，响应电流扩大了1.6倍，表明MWCNTs与PTrp复合增强了导电性和电催化氧化性，从而促进了L-Glu在电极表面的电催化氧化反应。
3、条件优化
3.1、MWCNTs用量优化
为了探究酸化多壁碳纳米管(MWCNTs)分散液(优化浓度1.0mg/mL)的最佳用量，采用不同量酸化MWCNTs加入的修饰电极检测1.000×10-5mol/L L-Glu,响应峰电流与酸化MWCNTs分散液用量曲线见图6A。如图所示，响应峰电流随着酸化MWCNTs分散液体积用量的增多而不断增大，这是因为酸化MWCNTs的独特结构增大了电极表面积，提升了电子的传递速率，然而当酸化MWCNTs用量超过5.0μL时，响应峰电流降低是因为滴涂的酸化MWCNTs过量时会形成一层较厚的膜，阻碍了电子在电极表面的传递，因此最优的酸化MWCNTs分散液(1.0mg/mL)用量为5.0μL。
3.2、L-Trp浓度优化
L-Trp浓度是一个影响谷氨酸响应峰电流的重要因素，因此对L-Trp浓度的优化是必要的。将在不同L-Trp浓度下聚合制备的修饰电极用于检测1.000×10-5mol/L L-Glu，结果如图6B所示，随着L-Trp浓度的增加，L-Glu的响应峰电流不断增加，一直到L-Trp浓度为0.06mol/L，这是由于电聚合的L-Trp膜对于L-Glu有一定的催化活性，然而当L-Trp浓度超过0.06mol/L时，峰电流不断降低，这是因为PTrp膜过厚降低了电极的导电性，因此电聚合时最佳的色氨酸浓度为0.06mol/L。
3.3、聚合圈数优化
聚合圈数影响着PTrp的结构，也是影响L-Glu响应峰电流的重要因素。图6C为不同扫描圈数下制备的修饰电极检测1.000×10-5mol/L L-Glu的响应峰电流曲线，扫描圈数不断增加，峰电流也不断增大，是因为扫描圈数越多，电极表面膜的厚度就越大，更加有利于L-Glu的电催化，然而扫描圈数大于22时，峰电流开始慢慢减小，是因为表面膜过厚时，会产生传质阻力不利于对L-Glu的识别，因此最佳的聚合圈数为22。
3.4、pH值对L-Glu电化学行为的影响
采用DPV法探究当缓冲液(0.10mol/L CH3COOH-CH3COONa)pH为3.0～5.0时，L-Glu在修饰电极PTrp/MWCNTs/GCE的氧化峰电流和峰电位随pH变化的关系，结果如图7所示。由图7A可以看出，在pH为3.0～3.9时，L-Glu的氧化峰电流随pH值的增加而逐渐增大；当pH超过3.9时，L-Glu峰电流随pH的增加而逐步减小。这是由于溶液的pH会影响L-Glu和PTrp/MWCNTs复合膜的电荷性质，进而对溶液和电极间的电子传递和质子转移产生影响。当pH过低时会使膜发生溶解，不利于电子的传递；当pH过高时，由于L-Glu为酸性氨基酸会带电负性，与电极之间产生静电排斥作用，同样不利于电子的传递。只有当pH＝3.9(即CH+＝10-3.9)时，电子传递效率达到最高，氧化峰电流也达到最大，因此选择pH＝3.9的乙酸-乙酸钠缓冲溶液(SAB)作为检测L-Glu的最佳底液。
由图7B可以看出L-Glu的峰电位与溶液pH值存在线性关系，线性方程为Epa＝–0.0547pH+0.4021(R2＝0.9947)，表明L-Glu在电极表面反应过程中存在电子及质子转移的过程；由能斯特方程：Ep＝0.05916(m/n)pH+E0，其中m为反应转移的质子数，n为转移的电子数，可得出出m＝0.925n,即m≈n，表明L-Glu在修饰电极界面上反应过程中电子和质子转移数相等。
4、L-Glu在修饰电极上氧化机理的探讨
采用CV法研究了L-Glu的峰电流、峰电位随扫速变化的关系，结果如图8所示。从图8A可见，当扫速由20mV/s增长到160mV/s时，L-Glu的氧化峰电流随之增大，并且可以看出L-Glu在电极上的反应是一个不可逆的氧化过程。从图8B可见，L-Glu的氧化峰电流与扫速呈线性关系，线性方程为Ip＝–12.19v–0.8485(R2＝0.9962)，这说明L-Glu在修饰电极上的反应为一个吸附控制过程。由图8C可以看出，L-Glu的氧化峰电位与扫速的自然对数呈线性关系，线性方程为Epa＝0.019lnv+0.319(R2＝0.9961)。根据Laviron公式:
其中，Ep是氧化峰电位，E0'是式量电位，α是电子传递系数，n为传递电子数，T是温度，R是摩尔气体常数，F是法拉第常数，k0为标准异相电子传递速率常数，D为扩散系数，v是扫描速率。对比上式，可得到α·n＝0.6760，由于在常温不可逆电极反应中，0.3<α<0.6，可得出α＝0.338时，n＝2，即L-Glu氧化过程中电子转移数为2，由前文可得质子转移数m＝2。由此推出L-Glu在电极表面的反应过程如图9所示。
5、线性范围和检测限
在最优条件下，使用PTrp/MWCNTs/GCE电极通过DPV法在乙酸-乙酸钠缓冲液(0.10mol/L，pH＝3.90)中对不同浓度的L-Glu进行检测，结果如图10所示。图10A是PTrp/MWCNTs/GCE电极对不同浓度L-Glu的示差脉冲伏安曲线，由图可见，DPV响应峰电流随着L-Glu浓度的增加而不断升高，由图10(B)可得，响应峰电流与L-Glu浓度在5.000×10-8～1.500×10-5mol/L呈良好线性关系，线性方程为Ip＝–0.2853C–3.1760(R2＝0.9956)，检测下限为2.580×10-8mol/L(S/N＝3)。将本发明制备的电极其它文献方法进行比较(见表1)，可以看出本发明所制备电极具有更加优异的性能，尤其是与无酶电极相比。
表1不同电极检测性能比较
Table 1 Comparison of performance with different modified electrodes
Note:GluOx:Glutamate Oxide；PtNP:Pt nanoparticles；AuNA:Au nanowirearray；NiNAE:Ni nano array；MIP:molecular imprinted polymer；GCE:glass carbonelectrode；Gldh:Glutamated ehydrogenase；SWNTS:single walled carbon nanotubes；PVA:photo-crosslinkable polymer；SPE:screen printed electrode；PTrp:Polytryptophan；MWCNTs:multi-walled carbon nanotubes.
表1中提到的有关文献(Reference)如下：
[6]Jamal M.,Xu J.,Razeeb K.M.,Biosens.Bioelectron.,2010,26(4),1420-1424.
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6、电极的重现性、重复性与稳定性
使用同一批次相同条件下制备的5支修饰电极检测1.000×10-5mol/L的L-Glu，得到的相对标准偏差为4.7％，表明该电极制备方法具有良好的重现性。同时，使用同一支电极分别对1.000×10-5和1.000×10-6mol/L的L-Glu连续检测8次，得到的相对标准偏差分别为2.3％和3.4％，表明本方法制备的电极具有良好的重复性。此外，为了探究电极的稳定性，将制备的电极在室温下存放，每天采用DPV法对浓度为1.000×10-5mol/L L-Glu检测一次，连续测定30d后，电极的响应电流与初始值相比下降了13.24％，表明该电极具有良好的稳定性和长的使用寿命。
7、抗干扰性测试
采用DPV法考察一些常见氨基酸对于L-Glu测定的干扰，分别测定了50倍浓度干扰物质(5.000×10-4mol/L)单独存在以及与L-Glu(1.000×10-5mol/L)混合时的响应峰电流，结果如图11所示。由图11可见，L-天冬氨酸(L-Asp)、L-色氨酸(L-Trp)、L-酪氨酸(L-Tyr)、L-赖氨酸(L-Lys)、L-精氨酸(L-Arg)、L-组氨酸(L-His)、L-甘氨酸(L-Gly)、L-半胱氨酸(L-Cys)、L-苏氨酸(L-Thr)不会对L-Glu的检测产生干扰，表明该电极具有良好的选择性。
8、实际样品检测
取预处理好的猪血清样品，将所制备的聚合膜电极PTrp/MWCNTs/GCE与高效液相色谱仪所测结果进行比较，结果见表2，由表2可见本方法与高效液相色谱法所测结果基本一致，相对误差在5.0％左右，表明本方法具有很好的准确性。采用加标回收法对猪血清样品进行测定，取猪血清样品10.0μL于9.990mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH3.90)中，然后加入不同浓度的标准L-Glu进行检测并计算回收率，结果如表3所示，回收率为94.8％～104.5％，说明该电极可以应用于实际样品的检测。
表2不同方法对猪血清样品中L-Glu的检测比较
Table2 Comparison of different methods for detection of L-Glu inpiglet serum samples(n＝6)
表3 PTrp/MWCNTs/GCE对猪血清样品中L-Glu的检测应用
Table3 Application of PTrp/MWCNTs/GCE to determination of L-glu inpiglet serum samples(n＝6)
本发明采用电聚合方法制备了一种基于聚合膜修饰电极的L-谷氨酸检测传感器(PTrp/MWCNTs/GCE)，该传感器对L-Glu具有电催化氧化活性并具有良好的线性响应关系，检测限为2.580×10-8mol/L，同时该传感器选择性好、重复性强、稳定性高，检测结果与HPLC相一致，可应用于猪血清样品中L-Glu的检测，有望发展成为L-谷氨酸无酶检测的一个新手段，可应用于生命分析和动物养殖领域。
Claims (7)
1.一种基于聚合膜修饰电极的L-谷氨酸检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备酸化的MWCNTs：将MWCNTs置于浓硫酸和浓硝酸的混合酸中，然后在120～180℃的油浴锅中搅拌回流加热10～60min，待混合液冷却后于10000～15000rpm的转速下离心3～30min，弃上清液，沉淀即为酸化的MWCNTs，洗涤并干燥后研磨粉碎，备用；其中，所述混合酸中浓硫酸和浓硝酸的体积比为(1～5)：1，所述MWCNTs与混合酸的比例为(150～250)g：(35～45)mL；
(2)制备PTrp/MWCNTs/GCE聚合膜修饰电极：对玻碳电极表面进行抛光，超声洗净后晾干；将酸化后的MWCNTs置于无水乙醇溶液中超声分散，得到MWCNTs浓度为0.5～2.0mg/mL的MWCNTs分散液；将MWCNTs分散液滴涂在玻碳电极表面，晾干后得到MWCNTs/GCE，再将MWCNTs/GCE电极置于含有0.03～0.09mol/L L-Trp的磷酸盐缓冲溶液中，采用循环伏安法在-0.2～2.0V范围内扫描20～25圈后得到PTrp/MWCNTs/GCE聚合膜修饰电极；
(3)以PTrp/MWCNTs/GCE聚合膜修饰电极为工作电极，以银/氯化银电极作为参比电极，以铂丝电极作为对电极，构成三电极体系；然后采用循环伏安法和交流阻抗法考察L-谷氨酸在不同修饰电极上的电化学行为，并采用示差脉冲伏安法对不同浓度的L-谷氨酸进行测试，绘制工作标准曲线，再采用标准加入法对待测样品中的L-谷氨酸进行检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中对玻碳电极表面进行抛光是分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对玻碳电极表面进行抛光。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述玻碳电极直径为3mm，将3.0～7.0μL MWCNTs分散液滴涂至玻碳电极表面，晾干后得到MWCNTs/GCE，将MWCNTs/GCE电极置于10.0mL含有0.03～0.09mol/L L-Trp的磷酸盐缓冲溶液中。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中是在2.0mmol/L[Fe(CN)]4-/3--0.20mol/L Na2SO4溶液中采用循环伏安和交流阻抗法考察L-谷氨酸在不同修饰电极上的电化学行为；在乙酸-乙酸钠缓冲溶液中采用示差脉冲伏安法对不同浓度的L-谷氨酸进行测试，绘制工作标准曲线，再采用标准加入法对待测样品中的L-谷氨酸进行检测。所述乙酸-乙酸钠缓冲溶液的浓度为0.01～0.20mol/L，乙酸-乙酸钠缓冲溶液的pH为pH3.60～4.20。
5.一种基于聚合膜修饰电极的L-谷氨酸检测传感器，其特征在于，所述传感器包括作为工作电极的聚合膜修饰电极；所述聚合膜修饰电极包括玻碳基质(5)，所述玻碳基质(5)表面修饰有酸化MWCNTs层(6)，所述酸化MWCNTs层(6)上负载有PTrp膜层(7)，所述PTrp膜层(7)中存在L-Trp单元(9)。
6.如权利要求5所述的传感器，其特征在于，所述传感器包括玻碳基质(5)的厚度为1.0～5.0mm，所述酸化MWCNTs层(6)的厚度为20～200nm，所述PTrp膜层(7)的厚度为5～50nm。
7.如权利要求5或6所述的传感器，其特征在于，所述传感器对L-谷氨酸的浓度存在良好的线性关系，检测的线性范围为5.000×10-8～1.500×10-5mol/L，检出限为2.580×10- 8mol/L。
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