CN114544720B - 一种用于超灵敏检测恩诺沙星的电化学传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于超灵敏检测恩诺沙星的电化学传感器，属于电化学传感检测技术领域，采用聚对氨基苯磺酸和多壁碳纳米管复合膜修饰玻碳电极，聚对氨基苯磺酸和多壁碳纳米管的协同作用使本发明的电化学传感器对恩诺沙星具有高的电化学响应，实现对恩诺沙星的高灵敏检测。本发明提供的恩诺沙星电化学传感器具有检出限低、线性范围宽、选择性高、重现性和稳定性好等特点，应用于实际样品中恩诺沙星残留的检测，结果满意，具有良好的应用前景。

Description

一种用于超灵敏检测恩诺沙星的电化学传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及电化学传感检测技术领域，具体涉及一种用于超灵敏检测恩诺沙星的电化学传感器及其制备方法。
背景技术
恩诺沙星属于第三代氟喹诺酮类抗生素，具有广谱高效的抗菌作用，被广泛应用于家禽家畜及水产养殖动物的细菌感染性疾病的预防和治疗。但过度使用或滥用会导致动物源食品中残留过多，对人体健康造成威胁。欧盟、日本和我国都对动物源性食品中恩诺沙星残留量做了严格规定。因此对动物源食品中恩诺沙星残留的准确、灵敏检测十分必要。
当前分析检测恩诺沙星的方法有高效液相色谱、液相色谱-质谱联用技术、化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附法和毛细管电泳法等。上述方法普遍存在仪器昂贵，检测成本高，且难以实现快速检测等局限性。与之相比，电化学方法因其仪器成本低且便携性好、操作简单、响应快、灵敏度高等特点，特别适合于常规分析。目前已有极少数修饰电极测定恩诺沙星的研究报道，但这些方法的检出限较高，而实际样品中恩诺沙星的残留量通常很低，难以满足实际应用要求。因此研究高灵敏的电化学分析技术检测痕量恩诺沙星有着重要的研究意义。
聚对氨基苯磺酸是近年来备受关注的导电聚合物，由于其具有导电性好、活性位点多、重复性好等优点，已被用于修饰电极，在阿昔洛韦、盐酸吡哆辛、尿酸和多巴胺等电化学检测中取得了良好效果。然而基于聚对氨基苯磺酸修饰电极用于检测恩诺沙星的方法尚未见有报道。
发明内容
针对现有技术中对恩诺沙星的检测方法操作复杂、检出限高、灵敏度低、难以实现快速检测等问题中等至少一种，本发明提供一种检出限低、选择性好、简单快速的恩诺沙星电化学传感器。本发明采用多壁碳纳米管为载体，通过电聚合对氨基苯磺酸在多壁碳纳米管修饰玻碳电极表面形成聚对氨基苯磺酸膜，制得一种聚对氨基苯磺酸/多壁碳纳米管修饰玻碳电极，可应用于鱼肉、牛奶和/或鸡蛋样品中恩诺沙星的检测。
本发明的目的采用以下技术方案来实现：
一种用于超灵敏检测恩诺沙星的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
S1、将玻碳电极进行打磨抛光，冲洗晾干待用；
S2、将多壁碳纳米管分散在壳聚糖溶液中，得到悬浮液，将所述悬浮液涂布在步骤S1待用的玻碳电极上，烘干后得到第一修饰电极；
S3、将所述第一修饰电极置于对氨基苯磺酸溶液中，采用循环伏安法在所述第一修饰电极表面形成对氨基苯磺酸聚合物，扫描速率为100mV/s，得到第二修饰电极；将所述第二修饰电极置于含有恩诺沙星的磷酸盐缓冲溶液中，采用差分脉冲伏安法对恩诺沙星检测；
S4、对步骤S3得到的电极进行打磨并依次重复步骤S1、步骤S2和步骤S3的处理，所述扫描速率为200mV/s；
S5、重复步骤S4的处理多次，每一次重复处理中所述扫描速率较前次增加100mV/s，至所述扫描速率达到700mV/s为止，制得所述电化学传感器。
在一些优选的实施方式中，所述对氨基苯磺酸溶液的浓度为0.05mol/L～0.3mol/L。
在一些优选的实施方式中，所述循环伏安法的扫描电位为-1.0V～1.0V，扫描圈数为5圈～40圈。
在一些优选的实施方式中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05mol/L～0.3mol/L，pH为5.0～8.0。
在一些优选的实施方式中，所述差分脉冲伏安法检测恩诺沙星的扫描电位为0.4V～1.1V，静置时间为0s，沉积时间为4min，沉积电位为-0.1V，速度搅拌为800转/min。
在一些优选的实施方式中，所述步骤S1的打磨抛光方法是在含有0.05μm氧化铝浆液的麂皮上打磨抛光，再依次用超纯水、乙醇、超纯水冲洗干净。
在一些优选的实施方式中，所述壳聚糖溶液的浓度为0.1wt％，所述多壁碳纳米管的分散比为1mg/mL。
在一些优选的实施方式中，所述磷酸盐缓冲溶液中所述恩诺沙星的浓度为2×10- 6mol/L。
本发明的另一目的在于提供一种电化学传感器，所述电化学传感器由前述制备方法制备得到。
本发明的再一目的在于提供一种所述电化学传感器在恩诺沙星检测中的应用。
本发明的有益效果为：
(1)与已有的常规检测方法相比，本发明无需昂贵的仪器，成本低、检测时间短，可用于测定实际样品中痕量恩诺沙星残留。
(2)本发明以多壁碳纳米管和聚对氨基苯磺酸作为电极增敏材料，其中，聚对氨基苯磺酸的氨基和磺酸基提供了丰富的活性位点，而多壁碳纳米管有高导电性和大比表面积，聚对氨基苯磺酸和多壁碳纳米管的协同作用使本发明所述电化学传感器对恩诺沙星具有高的电化学响应，实现对恩诺沙星的高灵敏检测，具体的，多壁碳纳米管的高导电性和大比表面积促进了恩诺沙星与电极之间的电极传递，另一方面聚对氨基苯磺酸上高度共轭的二聚体与恩诺沙星分子结构上的苯环产生π-π共轭作用，使恩诺沙星在电极表面产生富集，同时这种高度共轭体系又促进了电子的转移。因此多壁碳纳米管与聚对氨基苯磺酸的协同作用，大大增强了恩诺沙星在修饰电极上的电化学信号，显著提高了检测的灵敏度。
(3)本发明通过多次重复打磨-修饰、再打磨-修饰制备聚对氨基苯磺酸/多壁碳纳米管修饰电极，显著地提高传感器的灵敏度。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1是多壁碳纳米管修饰玻碳电极的扫描电镜图；
图2是实施例1制备的聚对氨基苯磺酸/多壁碳纳米管修饰电极的扫描电镜图；
图3是不同修饰电极在恩诺沙星的磷酸盐缓冲溶液中的差分脉冲溶出伏安曲线；其中，a是裸玻碳电极；b是多壁碳纳米管修饰玻碳电极；是c聚对氨基苯磺酸修饰玻碳电极；d是实施例1所述检测电极；
图4是不同浓度恩诺沙星在检测电极上的差分脉冲溶出伏安曲线；
图5是实施例1所述检测电极对恩诺沙星及不同干扰物的响应结果。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
一种用于超灵敏检测恩诺沙星的电化学传感器，其制备方法包括以下步骤：
(1)将玻碳电极在含有0.05μm氧化铝浆液的麂皮上进行表面打磨抛光，然后依次用超纯水、乙醇、超纯水冲洗干净，晾干待用；
(2)称取2mg多壁碳纳米管分散于2mL0.1wt％壳聚糖溶液中，超声分散15min，然后取6μL多壁碳纳米管悬浮液滴涂到步骤(1)所得玻碳电极表面，于红外灯下烘干，得到多壁碳纳米管修饰的玻碳电极；
(3)将1.732g对氨基苯磺酸溶解于60℃纯水后，定容至100mL；把步骤(2)所得多壁碳纳米管修饰玻碳电极置于对氨基苯磺酸溶液中，采用循环伏安法以100mV/s的扫描速率在修饰电极表面电聚合20圈，形成对氨基苯磺酸聚合物，将所得聚对氨基苯磺酸/多壁碳纳米管修饰玻碳电极置于含有2×10-6mol/L恩诺沙星的磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/L，pH6.5)中，采用差分脉冲伏安法对恩诺沙星检测，检查所得聚对氨基苯磺酸/多壁碳纳米管修饰玻碳电极对恩诺沙星是否有响应，响应信号是否比第一修饰电极高；差分脉冲伏安法参数是：扫描电位为0.4V～1.1V、静置时间为0s、沉积时间为4min、沉积电位为-0.1V、速度搅拌为800转/min；
(4)将步骤(3)所得电极上的修饰材料打磨掉，打磨至电极在含0.1mol·L-1KCl、5mmol·L-1铁氰化钾对溶液中进行循环伏安扫描后两峰峰电位小于80mV；循环伏安扫描的电位范围是：0～0.7V；脉冲幅度：50mV/s；扫描速度：0.1V/s；再重复步骤(1)和(2)对玻碳电极进行处理修饰，然后将修饰后的玻碳电极置于对氨基苯磺酸溶液中，采用循环伏法以200mV/s的扫描速率电聚合对氨基苯磺酸，将聚对氨基苯磺酸/多壁碳纳米管修饰玻碳电极置于含有恩诺沙星的磷酸盐缓冲溶液中，采用差分脉冲伏安法检测恩诺沙星；
(5)重复步骤(4)多次，每次电聚合扫描速率的增加幅度为100mV/s，直至电聚合扫描速率达到700mV/s为止，所制备的聚对氨基苯磺酸/多壁碳纳米管修饰玻碳电极作为最终检测电极；
本实施例的初始扫描速率和增幅均为100mV/s，是获得超高灵敏度的恩诺沙星检测电极传感器的最优选参数，其它初始扫描速率和增幅无法达到本实施例所述的灵敏度效果。
实验例
对实施例1制备的检测电极进行表征：
1、SEM表征
采用扫描电镜对实施例1制备的电极进行表征，表征结果见附图1、2，参见附图1，多壁碳纳米管修饰玻碳电极表面呈现多壁碳纳米管交错形成的网状多孔结构，这种结构显著地增加了电极表面积，有利于电解质离子渗透和电子传递；参见附图2，电聚合对氨基苯磺酸后，玻碳电极表面的多壁碳纳米管覆盖了一层均匀的聚合物膜，说明对氨基苯磺酸已通过电聚合方法沉积到碳纳米管修饰玻碳电极表面。
2、电化学表征
采用差分脉冲溶出伏安法考察了不同电极在含有2×10-6mol/L恩诺沙星的磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/L，pH6.5)中的电化学行为，如图3所示，裸玻碳电极的曲线上呈现一个非常弱的恩诺沙星的氧化峰(曲线a)。当玻碳电极修饰多壁碳纳米管后，恩诺沙星的峰电流增加(曲线b)，归因于多壁碳纳米管提高了电极的导电性及表面积，促进了电子传递。而修饰了聚对氨基苯磺酸的玻碳电极用于检测恩诺沙星，峰电流也显著增加(曲线c)，这是因为聚对氨基苯磺酸上高度共轭的二聚体与恩诺沙星分子结构上的苯环产生π-π共轭作用而使恩诺沙星在电极表面产生富集，同时这种高度共轭体系又促进了电子的转移，提高了电极的催化活性。当玻碳电极依次修饰了多壁碳纳米管、聚对氨基苯磺酸后，恩诺沙星在该电极上的氧化峰电流最高(曲线d)，比裸玻碳电极提高了约80倍，表明多壁碳纳米管和聚氨基苯磺酸产生协同效应，对恩诺沙星有更好的电催化效果。
3、线性范围和检出限
在最佳条件下，将实施例1制备的检测电极分别对5×10-9mol/L，1×10-8mol/L，5×10-8mol/L，1×10-7mol/L，5×10-7mol/L，1×10-6mol/L，1.5×10-6mol/L，2×10-6mol/L，3×10-6mol/L的恩诺沙星溶液进行测试，记录差分脉冲伏安曲线。如图4所示，在5×10-9mol/L～3×10-6mol/L浓度范围内，峰电流与恩诺沙星的浓度呈良好的线性关系，得到线性方程为i＝5.65×106c+4.10(R＝0.999)。本发明的电化学传感器检测恩诺沙星的线性范围为在5×10-9mol/L～3×10-6mol/L，检出限为5×10-10mol/L(S/N＝3)。
4、重现性和稳定性
采用实施例1制备的检测电极对5×10-7mol/L的恩诺沙星溶液连续进行11次测试，得到峰电流的相对标准偏差(RSD)为0.98％。取6支相同条件下制备的修饰电极对5×10- 7mol/L的恩诺沙星溶液测试，测得峰电流的RSD为6.6％，表明本发明的电化学传感器具有良好的重现性。将修饰电极置于4℃冰箱中储存30天后，再对相同浓度2×10-6mol/L恩诺沙星溶液进行测定，峰电流响应值仍达到初始值的95.0％，说明本发明的电化学传感器的稳定性良好。
5、选择性
实施例1制备的检测电极通过差分脉冲伏安法考察了1倍浓度的恩诺沙星结构类似物环丙沙星、诺氟沙星和500倍浓度的常见生物质葡萄糖、抗坏血酸、核黄素、L-脯氨酸、L-组氨酸、尿素、维生素B1、维生素B6对检测2×10-6mol/L恩诺沙星的影响。如图5所示，上述恩诺沙星结构类似物和生物质对恩诺沙星的峰电流影响都在10％以内，说明本发明的电化学传感器具有良好的选择性。
应用例
实施例1制备的检测电极在检测鱼肉、牛奶和鸡蛋样品中恩诺沙星含量的应用：
鱼肉及鸡蛋样品中恩诺沙星提取：
罗非鱼和鸡蛋从肇庆当地市场购买，鱼去皮和内脏，取鱼肉组织切片，匀浆，取5.000g鱼浆或去壳后匀浆好的鸡蛋，加入12.5mL乙腈-甲酸混合液(V:V＝8:2)，涡旋2min后以4000r/min离心5min，收集上层清液，残渣再重复提取一次，合并上清液，所得上清液中加入10mL的饱和的乙腈的正己烷，涡旋2min，在3500r/min离心5min，收集下层清液用于固相萃取。
牛奶样品中恩诺沙星提取：盒装蒙牛牛奶和伊利牛奶从肇庆当地超市购买，称取5.000g牛奶样品，加入20mL0.1mol/L的EDTA-Mcllvaine缓冲液，涡旋2min，超声10min，2000r/min下离心10min，收集上层清液，用于固相萃取。
恩诺沙星分子印迹聚合物的制备：将0.2699g恩诺沙星溶于20mL三氯甲烷和二甲苯(V:V＝2:1)，加入0.3mL甲基丙烯酸，超声10min，于4℃下放置11h后加入3mL乙二醇二甲基丙烯酸酯作为交联剂和40mg偶氮二异丁腈作为引发剂，超声15min，通入氮气5min，放入恒温加热搅拌器中60℃反应24h。收集产物于60℃干燥12h后，于索氏提取器中用甲酸-冰醋酸混合液(V:V＝8:2)洗脱至用紫外-可见分光光度法测得在λ＝278nm处没有吸收峰为止。再用无水甲醇淋洗至中性，于60℃烘箱干燥24h，研磨成粉末后待用。
样品固相萃取：取500mg恩诺沙星分子印迹聚合物填装入固相萃取小柱，压实。加入2mL蒸馏水、2mL甲醇活化柱子后，加入2mL样品提取液，分别用2mL5％的甲醇水和2mL水淋洗去除杂质。再用8mL甲醇-甲酸(V:V＝8:2)混合液洗脱恩诺沙星，用磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/L，pH6.5)定容为20mL，进行电化学分析。同时对上述样品进行加标回收试验。
将本发明的电化学传感器对上述样品及加标样品进行电化学检测，测定结果见表1。由表1可知，鱼肉、鸡蛋和牛奶样品中的恩诺沙星平均回收率为85.4％～105％，RSD小于10％，说明该方法准确、可靠，能够满足检测痕量恩诺沙星残留的要求。
表1样品中恩诺沙星测定结果(n＝3)
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种电化学传感器在恩诺沙星检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将玻碳电极进行打磨抛光，冲洗晾干待用；
S2、将多壁碳纳米管分散在壳聚糖溶液中，得到悬浮液，将所述悬浮液涂布在步骤S1待用的玻碳电极上，烘干后得到第一修饰电极；
S3、将所述第一修饰电极置于对氨基苯磺酸溶液中，采用循环伏安法在所述第一修饰电极表面形成对氨基苯磺酸聚合物，扫描速率为100mV/s，得到第二修饰电极；将所述第二修饰电极置于含有恩诺沙星的磷酸盐缓冲溶液中，采用差分脉冲伏安法对恩诺沙星检测；
S4、对步骤S3得到的电极进行打磨并依次重复步骤S1、步骤S2和步骤S3的处理，所述扫描速率为200mV/s；
S5、重复步骤S4的处理多次，每一次重复处理中所述扫描速率较前次增加100mV/s，至所述扫描速率达到700mV/s为止，制得所述电化学传感器。
2.根据权利要求1所述的一种电化学传感器在恩诺沙星检测中的应用，其特征在于，所述对氨基苯磺酸溶液的浓度为0.05mol/L～0.3mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种电化学传感器在恩诺沙星检测中的应用，其特征在于，所述循环伏安法的扫描电位为-1.0V～1.0V，扫描圈数为5圈～40圈。
4.根据权利要求1所述的一种电化学传感器在恩诺沙星检测中的应用，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05mol/L～0.3mol/L，pH为5.0～8.0。
5.根据权利要求1所述的一种电化学传感器在恩诺沙星检测中的应用，其特征在于，所述差分脉冲伏安法检测恩诺沙星的扫描电位为0.4V～1.1V，静置时间为0s，沉积时间为4min，沉积电位为-0.1V，速度搅拌为800转/min。
6.根据权利要求1所述的一种电化学传感器在恩诺沙星检测中的应用，其特征在于，所述步骤S1的打磨抛光方法是在含有0.05μm氧化铝浆液的麂皮上打磨抛光，再依次用超纯水、乙醇、超纯水冲洗干净。
7.根据权利要求1所述的一种电化学传感器在恩诺沙星检测中的应用，其特征在于，所述壳聚糖溶液的浓度为0.1wt％，所述多壁碳纳米管的分散比为1mg/mL。
8.根据权利要求1所述的一种电化学传感器在恩诺沙星检测中的应用，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液中所述恩诺沙星的浓度为2×10-6mol/L。
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