CN109781815B - 一种喹乙醇分子印迹膜电化学传感器的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种喹乙醇分子印迹膜电化学传感器的制备方法，在玻碳电极表面包裹复合薄膜，所述复合薄膜由聚多巴胺@石墨烯复合物、聚吡咯和分子印迹聚合物组成。本发明优点是巧妙的利用了多巴胺的两种性质：1)粘附性和分散性：聚多巴胺@石墨烯复合膜具有多巴胺的粘附性，克服了传统滴涂法易脱落的缺点，又具有石墨烯大的比表面积；2)功能单体：多巴胺聚合形成分子印迹薄膜，提供与喹乙醇分子相对应的分子印迹空穴。聚合吡咯既可以增加导电性，又可以进一步增强聚多巴胺@石墨烯层的稳定性。本发明克服了传统检测喹乙醇方法中所用的大型仪器前处理复杂、仪器昂贵和传统的合成分子印迹方法耗时等缺点。

Description

一种喹乙醇分子印迹膜电化学传感器的制备方法

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种喹乙醇分子印迹膜电化学传感器的制备方法。

背景技术

喹乙醇属于喹噁啉类药物，具有良好的广谱抗菌效果，能提高畜禽饲料消化率、促生长，被广泛应用于兽药及饲料添加剂中。在饲料加工工业中常与淀粉或麦麸、磷酸氢钙、碳酸钙配制成饲料预混剂。研究表明，喹乙醇具有一定的蓄积毒性，通过食物链进入人体富集，影响机体代谢平衡，有致突变、致畸、致癌等危害，间接威胁人体健康。喹乙醇在美国和欧盟都被禁止用作饲料添加剂，中国兽药典(2005版)也有明确规定，喹乙醇被禁止用于家禽及水产养殖，但是至今滥用现象时有发生，因此，为了减少其对人类的潜在危害，建立一种简单，廉价，高灵敏性的方法来检测动物源性食品中喹乙醇的残留是非常必要的。

现在，在动物源性食品中检测喹乙醇的方法主要是仪器分析法和免疫分析法。仪器分析法的优点是准确度高，精密性好，但常常需要昂贵和复杂的仪器，样品预处理费时。基于酶和抗原抗体反应的分析方法具有高特异性和选择性的优点，但是由于酶和抗体的不稳定性，所以对检测环境的要求很高。本研究中，我们有效的结合电化学传感器和分子印迹技术的优点来建立一种简单、快速、特异性、廉价、现场分析、准确而且灵敏的方法来检测动物源性食品中的喹乙醇残留。

发明内容

本发明利用了聚多巴胺@石墨烯大的表面积，分子印迹材料对目标物的特异性吸附，制备了一种吸附痕量喹乙醇分子印迹膜电化学传感材料并提供了一种用于实际样品中喹乙醇的检测方法。

原理如下：(1)在玻碳电极表面滴涂聚多巴胺@石墨烯，聚多巴胺可以增加粘附性，石墨烯可以增大表面积；(2)聚吡咯属于导电聚合物，其稳定性好，附着力强，电化学聚合的均匀性好；(3)通过在含盐酸多巴胺和喹乙醇的磷酸缓冲液中进行循环伏安扫描，电聚合分子印迹膜，然后洗脱得到能特异性识别模板分子的分子印迹孔穴；(4)在吸附时，喹乙醇进入到印迹膜上具有特异性识别的分子印迹孔穴中，用K₃[Fe(CN)₆]作为电化学传感器中的探针，通过测量峰电流的变化情况，可以实现对喹乙醇的定量检测。

一种喹乙醇分子印迹膜电化学传感器的制备方法，所述电化学传感器包含工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极为玻碳电极，参比电极为饱和氯化钾电极，对电极为铂柱电极，包括如下步骤：

(1)制备聚多巴胺@石墨烯复合物

盐酸多巴胺用Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)配成1mg/mL，再用上述配成的溶液将石墨烯粉末分散成1mg/mL，避光，磁力搅拌5h，之后，用双蒸水洗涤、过滤多次，用真空干燥箱烘干，备用；

(2)电极预处理

(3)滴涂聚多巴胺@石墨烯复合物

在步骤(2)中处理好的玻碳电极表面滴涂5～15μL的1mg/mL的聚多巴胺@石墨烯复合物，在空气中自然晾干；

(4)电聚合吡咯

将步骤(3)中滴涂了聚多巴胺@石墨烯复合物的玻碳电极浸于吡咯和高氯酸锂的混合液中，在-0.2～0.8V范围内通电聚合多圈，得到聚吡咯修饰的电极；

(5)电聚合分子印迹膜

将步骤(4)中得到的修饰电极在电聚合溶液中进行循环伏安扫描，电聚合形成分子印迹膜；

(6)模板分子的洗脱

将步骤(5)中得到的修饰电极在甲醇：5％乙酸＝1：10(v/v)溶液中震荡洗脱20min，除去模板分子喹乙醇。

进一步，步骤(2)电极预处理是玻碳电极表面依次使用1.0，0.3，0.05μm的氧化铝粉末进行抛光，用双蒸水完全冲洗后，在含有0.2mol/L KNO₃的1mmol/L K₃[Fe(CN)₆]溶液中采用循环伏安法在-0.2～0.6V范围内扫描多圈，直至获得稳定的电化学响应，然后在空气中干燥，备用。

进一步，步骤(3)中，在玻碳电极表面滴涂聚多巴胺@石墨烯聚合物时，先将合成的聚多巴胺@石墨烯聚合物用N，N-二甲基甲酰胺：水＝1:1(v/v)配成1mg/mL分散液，超声使其分散均匀，然后用移液枪取5～15μL的1mg/mL聚多巴胺@石墨烯分散液滴涂到步骤(2)中的处理好的玻碳电极表面。

进一步，步骤(4)中，在聚合吡咯时，先将10μL的吡咯用3mL的双蒸水稀释，再加入32mg/mL的高氯酸锂333mL，电聚合溶液在使用之前氮吹10～15min除去溶解氧，在-0.2～0.8V范围内通电聚合多圈，扫描速度20mV/s。

进一步，步骤(5)中，将步骤(4)得到的修饰电极浸于含1mmol/L盐酸多巴胺和2mmol/L喹乙醇的磷酸缓冲液中，磷酸缓冲液pH＝7.9，浓度0.01mol/L，采用循环伏安法在-0.5～0.5V范围内扫描多圈，扫描速率为50mV/s，磷酸缓冲液在电聚合之前氮吹10～15min除去溶解氧。

进一步，步骤(6)中，在11mL的甲醇：5％乙酸＝1：10(v/v)的溶液中震荡洗脱20min以除去模板分子。

进一步，所述的分子印迹膜修饰电极检测喹乙醇的方法包括如下步骤：

(1)本发明检测方法：

在室温即25℃下，将修饰好的印迹电极浸入含浓度为50nmol/L～500nmol/L的喹乙醇溶液进行吸附，平衡时间15min，之后将电极置于含有0.2mol/L KNO₃的1mmol/L K₃[Fe(CN)₆]溶液中进行差分脉冲伏安法扫描，扫描电压-0.2～0.6V，电位增量，脉冲幅度，脉冲宽度，脉冲间隔和等待时间分别为0.01V，0.1V，0.5s，1s和1s。

(2)检测标准曲线的建立：

用相对电流变化(ΔI)分析还原峰电流值与喹乙醇浓度之间的关系。ΔI＝I_c-I₀，I_c和I₀分别表示当溶液中浓度为c mol/L和0mol/L时的还原峰电流值。

(3)喹乙醇含量的测定：

随着越来越多的喹乙醇分子被分子印迹膜上的识别位点所吸附，还原峰电流值逐渐降低；喹乙醇浓度(50nmol/L～500nmol/L)与相对电流变化(△I)呈良好的线性关系：ΔI＝0.035C_OLA+1.234，其线性相关系数r²＝0.9934，该分子印迹电化学传感器对喹乙醇的检出限(LOD)为7.5×10^-9mol/L(S/N＝3)。

本发明的优点是：

本发明优点是：

(1)巧妙的利用了多巴胺的两种性质：①粘附性和分散性,聚多巴胺@石墨烯复合膜具有多巴胺的粘附性，克服了传统滴涂法易脱落的缺点，又具有石墨烯大的比表面积，方便目标物的吸附和洗脱；②功能单体，多巴胺聚合形成分子印迹薄膜，提供与喹乙醇分子相对应的分子印迹空穴。

(2)本发明提供的传感器使用寿命长、稳定性好、灵敏度高、检测限低，能够特异性识别喹乙醇。

(3)本发明提供的喹乙醇分子印迹膜电化学传感器的制备方法，克服了传统方法检测喹乙醇时存在的样品前处理过程繁琐、仪器昂贵，操作复杂和传统的合成分子印迹方法耗时等问题，为实际样品中痕量喹乙醇的检测提供了一种新颖、快速和准确的分析检测方法。

(4)聚合吡咯既可以增加导电性，又可以进一步增强聚多巴胺@石墨烯层的稳定性。双重稳定基质(聚多巴胺和聚吡咯)，双重放大信号(石墨烯和聚吡咯)。

附图说明

构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解。

图1五支不同修饰电极在1.0mmol/L铁氰化钾溶液中的循环伏安图。(a)裸电极；(b)聚吡咯/聚多巴胺@石墨烯聚合物/裸电极(c)未去除模板的喹乙醇印迹电极；(d)去除模板后的喹乙醇印迹电极；(e)未洗脱的非印迹电极；

图2为本发明创造实施例喹乙醇含量与电流变化值的关系图。

具体实施方式

本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。下面结合附图说明和具体实施例对本发明做进一步详细描述。

本发明使用的石墨烯纳米材料是购买自南京先锋纳米材料科技有限公司。

实施例1

(1)制备聚多巴胺@石墨烯复合物

盐酸多巴胺用Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)配成1mg/mL，再用上述配成的溶液将石墨烯粉末分散成1mg/mL，避光，磁力搅拌5h，之后，用双蒸水洗涤、过滤多次，用真空干燥箱烘干，备用。

(2)电极预处理

玻碳电极表面依次使用1.0μm，0.3μm，0.05μm的氧化铝粉末进行抛光，用双蒸水完全冲洗后，在含有0.2mol/L KNO₃的1mmol/L K₃[Fe(CN)₆]溶液中采用循环伏安法在-0.2～0.6V范围内扫描多圈，直至获得稳定的电化学响应，然后在空气中干燥，备用。

(3)滴涂聚多巴胺@石墨烯复合物

将合成的聚多巴胺@石墨烯聚合物用N，N-二甲基甲酰胺：水＝1:1(v/v)配成1mg/mL分散液，超声使其分散均匀，然后用移液枪取5μL的1mg/mL聚多巴胺@石墨烯分散液滴涂到处理好的玻碳电极表面，在空气中自然晾干。

(4)电聚合吡咯

将滴涂了聚多巴胺@石墨烯复合物的玻碳电极浸于吡咯溶液中(高氯酸锂作支持电解质)，在-0.2～0.8V范围内通电聚合多圈，得到聚吡咯修饰的电极；吡咯溶液的配制：先将10μL的吡咯用3mL的双蒸水稀释，再加入32mg/mL的高氯酸锂333mL。吡咯溶液在使用之前氮吹10min除去溶解氧。

(5)电聚合分子印迹膜

将得到的聚吡咯修饰的电极浸于含1mmol/L盐酸多巴胺和2mmol/L喹乙醇的磷酸缓冲液中，磷酸缓冲液pH＝7.9，浓度0.01mol/L，采用循环伏安法在-0.5～0.5V范围内扫描多圈，扫描速率为50mV/s，电聚合溶液在使用之前氮吹10min除去溶解氧。

(6)模板分子的洗脱

将制备好的修饰电极在11mL的甲醇：5％乙酸＝1：10(v/v)的溶液中震荡洗脱20min，除去模板分子，得到能够特异性识别喹乙醇的分子印迹空穴。

实施例2

(1)制备聚多巴胺@石墨烯复合物

盐酸多巴胺用Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)配成1mg/mL，再用上述配成的溶液将石墨烯粉末分散成1mg/mL，避光，磁力搅拌5h，之后，用双蒸水洗涤、过滤多次，用真空干燥箱烘干，备用。

(2)电极预处理

玻碳电极表面依次使用1.0μm，0.3μm，0.05μm的氧化铝粉末进行抛光，用双蒸水完全冲洗后，在含有0.2mol/L KNO₃的1mmol/L K₃[Fe(CN)₆]溶液中采用循环伏安法在-0.2～0.6V范围内扫描多圈，直至获得稳定的电化学响应，然后在空气中干燥，备用。

如图1所示，循环伏安法是监控修饰电极表面电子转移过程的有效的方法。曲线a表示在裸电极表面有一对典型的氧化还原峰。曲线b表示修饰了石墨烯和吡咯的电极，峰电流明显增加，这是因为聚吡咯属于导电聚合物，而且石墨烯又可以增大表面积。曲线c是未去除模板之前的循环伏安曲线，几乎观察不到氧化还原峰，这是因为电极表面覆盖了致密的不导电的聚多巴胺膜，阻碍了铁氰化钾探针在电极表面的反应。曲线d展示的是修饰电极去除模板之后的循环伏安曲线，可以观察到氧化还原峰，这可以解释为洗脱后暴露的孔穴增强了铁氰化钾在印迹聚合物膜中的扩散。曲线e表示非印迹电极，几乎也观察不到氧化还原峰。

(3)滴涂聚多巴胺@石墨烯复合物

将合成的聚多巴胺@石墨烯聚合物用N，N-二甲基甲酰胺：水＝1:1(v/v)配成1mg/mL分散液，超声使其分散均匀，然后用移液枪取10μL的1mg/mL聚多巴胺@石墨烯分散液滴涂到处理好的玻碳电极表面，在空气中自然晾干。

(4)电聚合吡咯

将滴涂了聚多巴胺@石墨烯复合物的玻碳电极浸于吡咯溶液中(高氯酸锂作支持电解质)，在-0.2～0.8V范围内通电聚合多圈，得到聚吡咯修饰的电极；吡咯溶液的配制：先将10μL的吡咯用3mL的双蒸水稀释，再加入32mg/mL的高氯酸锂333mL。吡咯溶液在使用之前氮吹12min除去溶解氧。

(5)电聚合分子印迹膜

将得到的聚吡咯修饰的电极浸于含1mmol/L盐酸多巴胺和2mmol/L喹乙醇的磷酸缓冲液中，磷酸缓冲液pH＝7.9，浓度0.01mol/L，采用循环伏安法在-0.5～0.5V范围内扫描多圈，扫描速率为50mV/s，电聚合溶液在使用之前氮吹12min除去溶解氧。

(6)模板分子的洗脱

将制备好的修饰电极在11mL的甲醇：5％乙酸＝1：10(v/v)的溶液中震荡洗脱20min，除去模板分子，得到能够特异性识别喹乙醇的分子印迹空穴。

实施例3

(1)制备聚多巴胺@石墨烯复合物

盐酸多巴胺用Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)配成1mg/mL，再用上述配成的溶液将石墨烯粉末分散成1mg/mL，避光，磁力搅拌5h，之后，用双蒸水洗涤、过滤多次，用真空干燥箱烘干，备用。

(2)电极预处理

玻碳电极表面依次使用1.0μm，0.3μm，0.05μm的氧化铝粉末进行抛光，用双蒸水完全冲洗后，在含有0.2mol/L KNO₃的1mmol/L K₃[Fe(CN)₆]溶液中采用循环伏安法在-0.2～0.6V范围内扫描多圈，直至获得稳定的电化学响应，然后在空气中干燥，备用。

(3)滴涂聚多巴胺@石墨烯复合物

将合成的聚多巴胺@石墨烯聚合物用N，N-二甲基甲酰胺：水＝1:1(v/v)配成1mg/mL分散液，超声使其分散均匀，然后用移液枪取15μL的1mg/mL聚多巴胺@石墨烯分散液滴涂到处理好的玻碳电极表面，在空气中自然晾干。

(4)电聚合吡咯

将滴涂了聚多巴胺@石墨烯复合物的玻碳电极浸于吡咯溶液中(高氯酸锂作支持电解质)，在-0.2～0.8V范围内通电聚合多圈，得到聚吡咯修饰的电极；吡咯溶液的配制：先将10μL的吡咯用3mL的双蒸水稀释，再加入32mg/mL的高氯酸锂333mL。吡咯溶液在使用之前氮吹15min除去溶解氧。

(5)电聚合分子印迹膜

将得到的聚吡咯修饰的电极浸于含1mmol/L盐酸多巴胺和2mmol/L喹乙醇的磷酸缓冲液中，磷酸缓冲液pH＝7.9，浓度0.01mol/L，采用循环伏安法在-0.5～0.5V范围内扫描多圈，扫描速率为50mV/s，电聚合溶液在使用之前氮吹15min除去溶解氧。

(6)模板分子的洗脱

将制备好的修饰电极在11mL的甲醇：5％乙酸＝1：10(v/v)的溶液中震荡洗脱20min，除去模板分子，得到能够特异性识别喹乙醇的分子印迹空穴。

实施例4

实际样品中喹乙醇含量的测定：

分别利用本发明所述实施例1-3制备的传感器和高效液相色谱法对实际样品饲料和鱼肉中的喹乙醇进行分析测定，均未检出喹乙醇。采用标准加入法进行加标回收实验，于三个浓度下利用本发明所述的传感器分别平行测定三次，计算回收率为83.43％～92.83％，实施例2达到92.83％，说明利用本发明的制备方法构建的分子印迹电化学传感器具有较高的准确度。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种喹乙醇分子印迹膜电化学传感器的制备方法，在玻碳电极表面包裹三层薄膜，所述薄膜由聚多巴胺@石墨烯复合物、聚吡咯和分子印迹聚合物组成，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备聚多巴胺@石墨烯复合物

盐酸多巴胺用pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液配成1mg/mL浓度的溶液，再用上述配成的溶液将石墨烯粉末分散成1mg/mL的溶液，避光，磁力搅拌5h，之后，用双蒸水洗涤、过滤多次，用真空干燥箱烘干，备用；

(2)玻碳电极预处理

(3)滴涂聚多巴胺@石墨烯复合物

在步骤(2)中处理好的玻碳电极表面滴涂5～15μL的1mg/mL的聚多巴胺@石墨烯复合物，在空气中自然晾干；

(4)电聚合吡咯

将步骤(3)中滴涂了聚多巴胺@石墨烯复合物的玻碳电极浸于吡咯溶液中，在-0.2～0.8V范围内通电聚合多圈，得到聚吡咯修饰的电极；

(5)电聚合分子印迹膜

将步骤(4)中得到的聚吡咯修饰电极在聚合分子印迹膜的磷酸缓冲液中进行循环伏安扫描，其中功能单体是盐酸多巴胺，模版分子是喹乙醇，电聚合形成分子印迹膜；

(6)模板分子的洗脱

将步骤(5)中得到的电聚合分子印迹膜的修饰电极在甲醇：5％乙酸＝1：10(v/v)溶液中震荡洗脱20min，除去模板分子。

2.根据权利要求1所述的一种喹乙醇分子印迹膜电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)电极预处理是玻碳电极表面依次使用1.0μm，0.3μm，0.05μm的氧化铝粉末进行抛光，用双蒸水完全冲洗后，在含有0.2mol/L KNO₃的1mmol/L K₃[Fe(CN)₆]溶液中采用循环伏安法在-0.2～0.6V范围内扫描多圈，直至获得稳定的电化学响应，然后在空气中干燥，备用。

3.根据权利要求1所述的一种喹乙醇分子印迹膜电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)滴涂聚多巴胺@石墨烯聚合物，先将合成的聚多巴胺@石墨烯聚合物用N，N-二甲基甲酰胺：水＝1:1(v/v)配成1mg/mL分散液，超声使其分散均匀，然后用移液枪取5～15μL的1mg/mL聚多巴胺@石墨烯分散液滴涂到步骤(2)中的处理好的玻碳电极表面。

4.根据权利要求1所述的一种喹乙醇分子印迹膜电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)电聚合吡咯，先将10μL的吡咯用3mL的双蒸水稀释，再加入32mg/mL的高氯酸锂333mL得到分散液，分散液在使用之前氮吹10～15min除去溶解氧。

5.根据权利要求1所述的一种喹乙醇分子印迹膜电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)电聚合分子印迹膜，将步骤(4)得到的修饰电极浸于含1mmol/L盐酸多巴胺和2mmol/L喹乙醇的磷酸缓冲液中，磷酸缓冲液pH＝7.9，浓度0.01mol/L，采用循环伏安法在-0.5～0.5V范围内扫描多圈，扫描速率为50mV/s，磷酸缓冲液在电聚合前氮吹10～15min除去溶解氧。

6.根据权利要求1所述的一种喹乙醇分子印迹膜电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)模板分子的洗脱，在11mL的甲醇：5％乙酸＝1：10(v/v)的溶液中震荡洗脱20min以除去模板分子。

7.权利要求1-6任一权利要求所述的制备方法得到的分子印迹膜电化学传感器用于食品中喹乙醇的检测。

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