CN106770210A - 一种喹乙醇快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种喹乙醇快速检测方法，包括如下步骤：在抗原预包被条的每个微孔内分别加入50μL 系列浓度的喹乙醇标准液或是处理好的样品液以及50μL铕标记单克隆抗体，混匀，37℃孵育1h，用洗涤液洗涤微孔3～5次 ；B.每个微孔加入200μL增强液，37℃避光振荡孵育10min；用时间分辨仪测定其荧光强度值cps。本发明喹乙醇快速检测方法避免了传统检测中复杂的样品前处理过程，使检测过程简单、快速且具有高的灵敏度，对保证我国食品中喹乙醇的有效检测和监控监管，尽快提升我国的食品安全性和食品安全的控制能力将发挥重要作用，具有十分重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法，具体是一种喹乙醇快速检测方法。
背景技术
乙醇（Olaquindox，2-[N-(2-羟基-乙基)-氨基甲酰]-3-甲基-喹恶啉-1,4-二氧化物）因其具有良好的广谱抗菌效果并且有促进畜禽对饲料的消化利用，提高生长速度；是一种低毒、高效、用量少的抗菌促生长剂，被广泛用于多种兽药及饲料添加剂中。
目前国内外食品中喹乙醇的检测大都采用液相色谱及液相色谱质谱联联用的方法进行定性和定量检测，但上述几种检测方法所使用的设备价格昂贵且在喹乙醇含量较低时很难检出，需要复杂样品前处理技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种喹乙醇快速检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种喹乙醇快速检测方法，包括如下步骤：在抗原预包被条的每个微孔内分别加入50μL 系列浓度的喹乙醇标准液或是处理好的样品液以及50μL铕标记单克隆抗体，混匀，37℃孵育1h，用洗涤液洗涤微孔3～5次 ； B. 每个微孔加入200μL增强液，37℃避光振荡孵育10min ；用时间分辨仪测定其荧光强度值cps；制备分子印迹聚合物：在甲醇溶液中，将喹乙醇、功能单体3-氨基丙基三乙氧基硅烷、交联剂四乙氧基硅烷以1:3:8的摩尔比例混合均匀，然后加入活化硅球作为支持载体，0.1mol醋酸作为催化剂进行聚合反应；用1:3（v/v）冰乙酸-甲醇溶液连续洗脱8h以除去喹乙醇，再用100%甲醇洗至中性，干燥后得分子印迹聚合物MIP；建立流动注射分子印迹-化学发光在线联用体系向一根6mm×5cm的玻璃管内填充步骤1制备的100mg分子印迹聚合物，两端塞少许玻璃棉制成MIP柱；将MIP柱放在化学发光仪的检测光窗上，建立流动注射分子印迹-化学发光在线联用体系；将3.0×104mol高锰酸钾溶液、1.5mol硫酸溶液和5.0×104mol硫代硫酸钠溶液分别通过三条流路同时流动注射流过MIP柱，除去MIP柱上的杂质直至基线平稳；流动注射分子印迹-化学发光在线联用检测：a把喹乙醇标准溶液流动注射入分子印迹-化学发光在线联用体系4min，当喹乙醇标准溶液流经MIP柱时，溶液中的喹乙醇被MIP柱选择性吸附；b把蒸馏水注入体系2min，清洗并除去MIP柱上除喹乙醇以外的杂质；c将3.0×104mol高锰酸钾溶液、1.5mol硫酸溶液和5.0×104mol硫代硫酸钠分别通过三条流路同时流动注射入体系与MIP柱上吸附的喹乙醇反应产生光信号，记录光信号响应值；d把蒸馏水注入体系2min，清洗并除去MIP柱上喹乙醇反应后残留的杂质；以步骤3）中喹乙醇标准溶液浓度为横坐标，以对应浓度产生的光信号响应值为纵坐标，绘制标准曲线将含喹乙醇的分析物粉碎，按重量体积比（g/mL）1:5加入乙腈溶液超声提取三次，合并提取液，定容；3000r离心30min，得样品提取液；将得到的样品提取液代替喹乙醇标准溶液，根据化学发光信号响应值由标准曲线计算出分析物中喹乙醇含量。
作为本发明进一步的方案：用包被缓冲液即0.05M pH为9.6的碳酸钠缓冲液将包被原OLA-HS-OVA稀释至1.0μg·mL，每微孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板中，37℃包被2h。
作为本发明再进一步的方案：还包括用琥珀酸酐 (HS) 将喹乙醇偶联到载体蛋白BSA上，合成免疫原OLA-HS-BSA，免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出能稳定分泌抗喹乙醇单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进入小鼠体内诱生腹水，纯化获得抗喹乙醇的单克隆抗体。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明喹乙醇快速检测方法避免了传统检测中复杂的样品前处理过程，使检测过程简单、快速且具有高的灵敏度，对保证我国食品中喹乙醇的有效检测和监控监管，尽快提升我国的食品安全性和食品安全的控制能力将发挥重要作用，具有十分重要意义。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例中，一种喹乙醇快速检测方法，包括如下步骤：在抗原预包被条的每个微孔内分别加入50μL 系列浓度的喹乙醇标准液或是处理好的样品液以及50μL铕标记单克隆抗体，混匀，37℃孵育1h，用洗涤液洗涤微孔3～5次 ； B. 每个微孔加入200μL增强液，37℃避光振荡孵育10min ；用时间分辨仪测定其荧光强度值cps；制备分子印迹聚合物：在甲醇溶液中，将喹乙醇、功能单体3-氨基丙基三乙氧基硅烷、交联剂四乙氧基硅烷以1:3:8的摩尔比例混合均匀，然后加入活化硅球作为支持载体，0.1mol醋酸作为催化剂进行聚合反应；用1:3（v/v）冰乙酸-甲醇溶液连续洗脱8h以除去喹乙醇，再用100%甲醇洗至中性，干燥后得分子印迹聚合物MIP；建立流动注射分子印迹-化学发光在线联用体系向一根6mm×5cm的玻璃管内填充步骤1制备的100mg分子印迹聚合物，两端塞少许玻璃棉制成MIP柱；将MIP柱放在化学发光仪的检测光窗上，建立流动注射分子印迹-化学发光在线联用体系；将3.0×104mol高锰酸钾溶液、1.5mol硫酸溶液和5.0×104mol硫代硫酸钠溶液分别通过三条流路同时流动注射流过MIP柱，除去MIP柱上的杂质直至基线平稳；流动注射分子印迹-化学发光在线联用检测：a把喹乙醇标准溶液流动注射入分子印迹-化学发光在线联用体系4min，当喹乙醇标准溶液流经MIP柱时，溶液中的喹乙醇被MIP柱选择性吸附；b把蒸馏水注入体系2min，清洗并除去MIP柱上除喹乙醇以外的杂质；c将3.0×104mol高锰酸钾溶液、1.5mol硫酸溶液和5.0×104mol硫代硫酸钠分别通过三条流路同时流动注射入体系与MIP柱上吸附的喹乙醇反应产生光信号，记录光信号响应值；d把蒸馏水注入体系2min，清洗并除去MIP柱上喹乙醇反应后残留的杂质；以步骤3）中喹乙醇标准溶液浓度为横坐标，以对应浓度产生的光信号响应值为纵坐标，绘制标准曲线将含喹乙醇的分析物粉碎，按重量体积比（g/mL）1:5加入乙腈溶液超声提取三次，合并提取液，定容；3000r离心30min，得样品提取液；将得到的样品提取液代替喹乙醇标准溶液，根据化学发光信号响应值由标准曲线计算出分析物中喹乙醇含量。用包被缓冲液即0.05M pH为9.6的碳酸钠缓冲液将包被原OLA-HS-OVA稀释至1.0μg·mL，每微孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板中，37℃包被2h。还包括用琥珀酸酐 (HS) 将喹乙醇偶联到载体蛋白BSA上，合成免疫原OLA-HS-BSA，免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出能稳定分泌抗喹乙醇单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进入小鼠体内诱生腹水，纯化获得抗喹乙醇的单克隆抗体。
实施例1：
本发明喹乙醇快速检测方法，包括如下步骤：在抗原预包被条的每个微孔内分别加入50μL 系列浓度的喹乙醇标准液或是处理好的样品液以及50μL铕标记单克隆抗体，混匀，37℃孵育1h，用洗涤液洗涤微孔3次；B. 每个微孔加入200μL增强液，37℃避光振荡孵育10min；用时间分辨仪测定其荧光强度值cps；制备分子印迹聚合物：在甲醇溶液中，将喹乙醇、功能单体3-氨基丙基三乙氧基硅烷、交联剂四乙氧基硅烷以1:3:8的摩尔比例混合均匀，然后加入活化硅球作为支持载体，0.1mol醋酸作为催化剂进行聚合反应；用1:3（v/v）冰乙酸-甲醇溶液连续洗脱8h以除去喹乙醇，再用100%甲醇洗至中性，干燥后得分子印迹聚合物MIP；建立流动注射分子印迹-化学发光在线联用体系向一根6mm×5cm的玻璃管内填充步骤1制备的100mg分子印迹聚合物，两端塞少许玻璃棉制成MIP柱；将MIP柱放在化学发光仪的检测光窗上，建立流动注射分子印迹-化学发光在线联用体系；将3.0×104mol高锰酸钾溶液、1.5mol硫酸溶液和5.0×104mol硫代硫酸钠溶液分别通过三条流路同时流动注射流过MIP柱，除去MIP柱上的杂质直至基线平稳；流动注射分子印迹-化学发光在线联用检测：a把喹乙醇标准溶液流动注射入分子印迹-化学发光在线联用体系4min，当喹乙醇标准溶液流经MIP柱时，溶液中的喹乙醇被MIP柱选择性吸附；b把蒸馏水注入体系2min，清洗并除去MIP柱上除喹乙醇以外的杂质；c将3.0×104mol高锰酸钾溶液、1.5mol硫酸溶液和5.0×104mol硫代硫酸钠分别通过三条流路同时流动注射入体系与MIP柱上吸附的喹乙醇反应产生光信号，记录光信号响应值；d把蒸馏水注入体系2min，清洗并除去MIP柱上喹乙醇反应后残留的杂质；以步骤3）中喹乙醇标准溶液浓度为横坐标，以对应浓度产生的光信号响应值为纵坐标，绘制标准曲线将含喹乙醇的分析物粉碎，按重量体积比（g/mL）1:5加入乙腈溶液超声提取三次，合并提取液，定容；3000r离心30min，得样品提取液；将得到的样品提取液代替喹乙醇标准溶液，根据化学发光信号响应值由标准曲线计算出分析物中喹乙醇含量。用包被缓冲液即0.05M pH为9.6的碳酸钠缓冲液将包被原OLA-HS-OVA稀释至1.0μg·mL，每微孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板中，37℃包被2h。还包括用琥珀酸酐 (HS) 将喹乙醇偶联到载体蛋白BSA上，合成免疫原OLA-HS-BSA，免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出能稳定分泌抗喹乙醇单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进入小鼠体内诱生腹水，纯化获得抗喹乙醇的单克隆抗体。
实施例2：
本发明喹乙醇快速检测方法，包括如下步骤：在抗原预包被条的每个微孔内分别加入50μL 系列浓度的喹乙醇标准液或是处理好的样品液以及50μL铕标记单克隆抗体，混匀，37℃孵育1h，用洗涤液洗涤微孔5次；B.每个微孔加入200μL增强液，37℃避光振荡孵育10min；用时间分辨仪测定其荧光强度值cps；制备分子印迹聚合物：在甲醇溶液中，将喹乙醇、功能单体3-氨基丙基三乙氧基硅烷、交联剂四乙氧基硅烷以1:3:8的摩尔比例混合均匀，然后加入活化硅球作为支持载体，0.1mol醋酸作为催化剂进行聚合反应；用1:3（v/v）冰乙酸-甲醇溶液连续洗脱8h以除去喹乙醇，再用100%甲醇洗至中性，干燥后得分子印迹聚合物MIP；建立流动注射分子印迹-化学发光在线联用体系向一根6mm×5cm的玻璃管内填充步骤1制备的100mg分子印迹聚合物，两端塞少许玻璃棉制成MIP柱；将MIP柱放在化学发光仪的检测光窗上，建立流动注射分子印迹-化学发光在线联用体系；将3.0×104mol高锰酸钾溶液、1.5mol硫酸溶液和5.0×104mol硫代硫酸钠溶液分别通过三条流路同时流动注射流过MIP柱，除去MIP柱上的杂质直至基线平稳；流动注射分子印迹-化学发光在线联用检测：a把喹乙醇标准溶液流动注射入分子印迹-化学发光在线联用体系4min，当喹乙醇标准溶液流经MIP柱时，溶液中的喹乙醇被MIP柱选择性吸附；b把蒸馏水注入体系2min，清洗并除去MIP柱上除喹乙醇以外的杂质；c将3.0×104mol高锰酸钾溶液、1.5mol硫酸溶液和5.0×104mol硫代硫酸钠分别通过三条流路同时流动注射入体系与MIP柱上吸附的喹乙醇反应产生光信号，记录光信号响应值；d把蒸馏水注入体系2min，清洗并除去MIP柱上喹乙醇反应后残留的杂质；以步骤3）中喹乙醇标准溶液浓度为横坐标，以对应浓度产生的光信号响应值为纵坐标，绘制标准曲线将含喹乙醇的分析物粉碎，按重量体积比（g/mL）1:5加入乙腈溶液超声提取三次，合并提取液，定容；3000r离心30min，得样品提取液；将得到的样品提取液代替喹乙醇标准溶液，根据化学发光信号响应值由标准曲线计算出分析物中喹乙醇含量。用包被缓冲液即0.05M pH为9.6的碳酸钠缓冲液将包被原OLA-HS-OVA稀释至1.0μg·mL，每微孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板中，37℃包被2h。还包括用琥珀酸酐 (HS) 将喹乙醇偶联到载体蛋白BSA上，合成免疫原OLA-HS-BSA，免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出能稳定分泌抗喹乙醇单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进入小鼠体内诱生腹水，纯化获得抗喹乙醇的单克隆抗体。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (3)
1.一种喹乙醇快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：在抗原预包被条的每个微孔内分别加入50μL 系列浓度的喹乙醇标准液或是处理好的样品液以及50μL铕标记单克隆抗体，混匀，37℃孵育1h，用洗涤液洗涤微孔3～5次 ； B. 每个微孔加入200μL增强液，37℃避光振荡孵育10min ；用时间分辨仪测定其荧光强度值cps；制备分子印迹聚合物：在甲醇溶液中，将喹乙醇、功能单体3-氨基丙基三乙氧基硅烷、交联剂四乙氧基硅烷以1:3:8的摩尔比例混合均匀，然后加入活化硅球作为支持载体，0.1mol醋酸作为催化剂进行聚合反应；用1:3（v/v）冰乙酸-甲醇溶液连续洗脱8h以除去喹乙醇，再用100%甲醇洗至中性，干燥后得分子印迹聚合物MIP；建立流动注射分子印迹-化学发光在线联用体系向一根6mm×5cm的玻璃管内填充步骤1制备的100mg分子印迹聚合物，两端塞少许玻璃棉制成MIP柱；将MIP柱放在化学发光仪的检测光窗上，建立流动注射分子印迹-化学发光在线联用体系；将3.0×104mol高锰酸钾溶液、1.5mol硫酸溶液和5.0×104mol硫代硫酸钠溶液分别通过三条流路同时流动注射流过MIP柱，除去MIP柱上的杂质直至基线平稳；流动注射分子印迹-化学发光在线联用检测：a把喹乙醇标准溶液流动注射入分子印迹-化学发光在线联用体系4min，当喹乙醇标准溶液流经MIP柱时，溶液中的喹乙醇被MIP柱选择性吸附；b把蒸馏水注入体系2min，清洗并除去MIP柱上除喹乙醇以外的杂质；c将3.0×104mol高锰酸钾溶液、1.5mol硫酸溶液和5.0×104mol硫代硫酸钠分别通过三条流路同时流动注射入体系与MIP柱上吸附的喹乙醇反应产生光信号，记录光信号响应值；d把蒸馏水注入体系2min，清洗并除去MIP柱上喹乙醇反应后残留的杂质；以步骤3）中喹乙醇标准溶液浓度为横坐标，以对应浓度产生的光信号响应值为纵坐标，绘制标准曲线将含喹乙醇的分析物粉碎，按重量体积比（g/mL）1:5加入乙腈溶液超声提取三次，合并提取液，定容；3000r离心30min，得样品提取液；将得到的样品提取液代替喹乙醇标准溶液，根据化学发光信号响应值由标准曲线计算出分析物中喹乙醇含量。
2.根据权利要求1所述的喹乙醇快速检测方法，其特征在于，用包被缓冲液即0.05M pH为9.6的碳酸钠缓冲液将包被原OLA-HS-OVA稀释至1.0μg·mL，每微孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板中，37℃包被2h。
3.根据权利要求1所述的喹乙醇快速检测方法，其特征在于，还包括用琥珀酸酐 (HS)将喹乙醇偶联到载体蛋白BSA上，合成免疫原OLA-HS-BSA，免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出能稳定分泌抗喹乙醇单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进入小鼠体内诱生腹水，纯化获得抗喹乙醇的单克隆抗体。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20170531 |