CN102928411A - 检测链霉素的磁颗粒化学发光试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测链霉素的磁颗粒化学发光试剂盒，包括的试剂有：发光标记物、荧光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。发光标记物是异鲁米诺发光标记物标记的链霉素半抗原，荧光标记物是指荧光素或其衍生物标记的链霉素单克隆抗体，分离试剂是指包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠。本发明还涉及一种采用所述的试剂盒检测动物源性食品中链霉素的方法，本方法对链霉素检测具备较高的灵敏度、特异性和较快的检测速度。

Description

检测链霉素的磁颗粒化学发光试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种化学发光检测试剂盒及其应用法，特别是检测动物性食品和饲料生产中链霉素残留量的磁颗粒化学发光检测试剂盒。

技术背景

链霉素(Streptomycin)是氨基糖苷类抗生素的一种，对格兰是阴性菌和部分革兰氏阳性菌特别是结核分歧杆菌具有显著的抗菌活性。链霉素主要作用域细胞的核糖体，通过抑制细菌蛋白质的生物合成而呈现杀菌的作用。正是由于其独特的抗菌活性，所以自1943年首次在灰色链球菌属中发现链霉素以来，他被广泛用于多种疾病的治疗和动物饲料添加剂，并在人、畜传染病的防治方面发挥了巨大作用。同时，链霉素对人又有一定、有时甚至是严重的毒副作用。链霉素引起的主要毒副作用是耳毒性。因其能选择性的损害第八对脑神经，导致前庭功能损害和耳蜗神经损害。严重时可造成永久性的耳聋。

链霉素对鸡、羊、牛、猪的各类炎症有很好的疗效，所以现在经常被添加到动物的饲料中，用于动物疾病的预防和治疗。但凡使用过链霉素的动物，在一定时期内其产品都有残留，所以在动物食品中残留会对人类健康造成威胁和影响。

我国对食品中链霉素残留的测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、微生物法和酶联免疫吸附法(ELISA)等。

1、高效液相色谱法(HPLC)具有检测精度高、假阳性率低的特点，HPLC法虽然是一种较理想的药物残留分析方法，但链霉素分子中没有紫外发光团和荧光团，在化学分析中需要见他转变成具有紫外发光团或荧光团的衍生物才能进行分析，这给检测工作带来了极大困难。而且HPLC法使用的仪器价格昂贵，检测费用昂贵，对检测人员专业要求较高，样本前处理较复杂。

2、微生物法是我国近年来才开始的研究，该方法的可靠检测限可达0.1ug/ml，低于国家规定残留量的最高限量。该方法灵敏度高。操作简便、检测结果准确，但其涉及到微生物培养，还需培训专门技术人才和建立专用实验室，技术含量仍然很高，一般检测单位很难做到。

3、酶联免疫吸附法(ELISA)是20世纪70年代出现，用于微量物质的检测，最早应用于传染病、肿瘤标志物、激素水平等临床检测，90年代开始在我国食品安全检测领域推广应用，目前依托ELISA技术的试剂盒、试纸条已经成为食品安全快速检测领域的主导产品，同时也是我公司研发和销售的主要产品类型。酶联免疫检测法基于抗原-抗体的特异性反应，检测灵敏度较高、特异性较好，技术操作简易，容易掌握，确实解决了大量的以前难以解决的许多微量小分子物质如抗生素、激素、农药残留等的定性、定量分析工作，对食品安全快速检测技术的发展起到了积极的促进作用。但是，ELISA方法存在许多自身无法克服的缺陷，主要表现在：

1)非均相反应：检测过程中为分离游离物与结合物，需要多步洗板过程，耗时费力，难以提高操作的自动化程度。

2)酶催化反应：借助酶催化底物显色，测定反应液吸光度值。反应的时间与温度对酶活力存在较大影响，试剂稳定性差。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测链霉素的磁颗粒化学发光试剂盒，采用该试剂盒进行链霉素残留的检测时不仅具备较高的灵敏度，特异性，而且具有较高的反应速度。

本发明的另一个目的在于提供一种链霉素残留的测试方法，该方法操作简单，灵敏度高，特异性好。

实现上述目的，本发明提供一种链霉素检测试剂盒，其包含的主要试剂有：发光标记物、荧光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。

所述的分离试剂是包被有羊抗FITC抗体的顺磁性纳米微珠。

所述的顺磁性纳米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH₂活性基团的微珠，用于包被羊抗FITC单克隆抗体，其内芯是Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃，使得微珠具有顺磁性。

所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物标记的链霉素半抗原。所述的异鲁米诺衍生物是ABEI、AHEI或ABEN。

所述的试剂盒还包括标准品，质控品和浓缩洗液。

所述的荧光素标记物是FITC标记链霉素单克隆抗体。

本发明还提供一种利用试剂盒检测链霉素的方法，包括下列步骤：

1)分别吸取20μl-100μl标准品或样本，然后加入20μl-100μl发光标记物，再加20μl-100μl荧光素标记物，充分混匀后，37℃温育15min；

2)加入包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠80-150μl，混匀后在37℃温育5min；

3)用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500μl冲洗复合物沉淀；

4)上述清洗步骤重复2-4次；

5)4)所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物1和激发底物2，延迟3-5s后检测发出的相对光强度(RLU)，样本中的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU集合标准曲线法计算链霉素的浓度。

所述的发光底物的主要成分是NaOH和H₂O₂。

本发明中分析测试方法所用的分析仪是：包括电源电路、自动注射泵1和2、测量室、发光室、光电倍增管计数器和输出系统，同时还配置有计算机与中文界面的Windows控制软件，可进行资料录入、结果汇总、质量控制、结果储存和结果查询等功能，可完成多种分析模式的编程，定量或定性报告结果，自动生成并储存、更新功能，两点自动修正标准曲线，所采用的系统是CI-2008系统。

本发明所述的分离试剂是包被羊抗FITC单克隆抗体，其表面基团的含量是0.1-0.3eqm/g，其保存于含有3％卵清蛋白，0.2％Tween-20，0.2％NaN₃，pH7.6的tris缓冲液中。所述的FITC是异硫氰酸荧光素。所述百分含量为质量百分含量。

所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物ABEI、AHEI或ABEN标记的链霉素半抗原标记其保存于含pH7.2，0.4％Tween-20，0.3％NaN₃的tiis缓冲液中。所述百分含量是质量百分含量。

所述的荧光素标记物是FITC标记的链霉素单克隆抗体，其保存于pH7.2，含6％牛血清白蛋白，0.4％NaN₃的tris缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。

链霉素标准品溶液(0ng/ml，0.01ng/ml，0.03ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml，1.0ng/ml)，标准品稀释液为pH7.4，0.3％NaN₃，0.05mol/L tris缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。

链霉素质控品溶液浓度分别为0.02ng/ml，0.8ng/ml，质控品稀释液pH7.4，0.3％NaN₃，0.05mol/L tris缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。

所述的浓缩洗液为PH7.6，0.3％Tween-20，0.3％NaN₃，0.2mol/L PBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。

本发明的有益效果如下：

1)本发明试剂盒可特异性检测链霉素，对其他药物无交叉。

2)本发明试剂盒的灵敏度较高，对链霉素的检测灵敏度可达0.01ng/ml。

3)本发明试剂盒的检测快捷，检测时间低于20min。

具体实施方式

实施例一 试剂盒具体组分的制备

1)链霉素半抗原的合成

将双氢链霉素用琥珀酸酐法改造其分子结构中的胍基为羧基，制备链霉素类药物半抗原。

2)免疫原的制备

将链霉素半抗原与甲状腺蛋白采用活化酯法(NHS-DCC法)进行偶联得到免疫原。

3)单克隆抗体的制备

动物免疫：以免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，免疫剂量为100μg/只，使其产生抗血清。

细胞融合和克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，得到单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细胞冻存和复苏：将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的制备与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁷个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到单克隆抗体。

4)发光标记物的制备

取4.5mmol/L ABEI，溶于4ml蒸馏水中，5.0mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺溶于0.5ml N，N-二甲基甲酰胺中，二者充分混匀后室温反应3-4h。取上述制备的链霉素半抗原15mg，用pH7.4PBS调节体积到1.5ml，然后加入上述活化的ABEI溶液，充分混匀后室温反应过夜，过G-25凝胶柱纯化。

5)荧光标记物制备

用0.025mol/L，pH9.0的碳酸盐缓冲液将链霉素单克隆抗体稀释成1％质量百分比浓度；根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0.01mg FITC，用分析天平准确称取所需的FITC粉末。用同一缓冲液将FITC配成0.1mg/ml的溶液，按上述抗体溶液体积的3-5倍，混入FITC稀释液；在4～℃避光条件下电磁搅拌、标记30-48h；将标记溶液3000r/min，室温离心20min，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再pH7.4的PBS缓冲液透析2-3天，期间至少更换透析液3次；取透析过夜的标记物，通过SephadexG-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光标记物进行鉴定，分装，贮存于4℃冰箱中。

6)分离试剂制备

a)磁珠活化

表面-COOH基团的磁珠(购于DYNAL，粒径为2.8μm)，其含量是0.15eq/g；取100μl磁珠，用100μl 25mmol/L，pH5.0，0.05％Tween-20MES溶液洗涤两次，磁分离后移除上清；使用前，用4℃贮存的25mmol/L MES溶液分别配置50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50μl新配置的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min；离心管置于磁分离架上磁分离4min，移除上清，加入100μl，25mmol/L，pH5.0，MES清洗2-3次后即可得表面羧基活化的磁珠。

b)磁珠偶联羊抗FITC单克隆抗体

将50-100μg羊抗FITC单克隆抗体溶解到60μl，25mmol/L，pH5.0MES中，用所述MES溶液调节总体积至100μl，轻柔混匀磁珠与抗体；室温条件下至少偶联30min或4℃偶联2h，该期间可利用涡旋仪使磁珠保持混匀状态；离心管置于磁分离架上磁分离3-5min，移除上清；为了淬灭未反应的-COOH，可加入100μl，pH7.4，TRIS反应15min或100μl，pH8.0，含有50mmol/L乙醇胺的PBS封闭磁珠；用100μl，0.1-0.3％BSA，0.1％Tween-20的PBS或TRIS清洗封闭好的磁珠3-5次；最后将磁珠复溶于含0.1-0.5％BSA，0.01-0.1％Tween-20，0.02％NaN₃的PBS或TRIS缓冲液中，2-8℃保藏。

实施例二 试剂盒的组建

组建检测链霉素的磁颗粒化学发光试剂盒，使其含有下列组分：

FITC标记的链霉素单克隆抗体的荧光标记物

ABEI标记的链霉素半抗原的发光标记物

表面包被羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠的分离试剂

链霉素标准品溶液(0ng/ml，0.01ng/ml，0.03ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml，1.0ng/ml)，标准品稀释液为pH7.4，0.3％NaN₃，0.05mol/L tris缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。

链霉素质控品溶液浓度分别为0.02ng/ml，0.8ng/ml，质控品稀释液pH7.4，0.3％NaN₃，0.05mol/L tris缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。

浓缩洗液为PH7.6，0.3％Tween-20，0.3％NaN₃，0.2mol/L PBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。

实施例三 实际样品中链霉素的检测

1、样本前处理

(一)鸡肉前处理方法

除去鸡肉中的脂肪部分，用均质器均质鸡肉样本；称取2±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入8ml PBST缓冲液用振荡器振荡5min，加入正己烷5ml充分上下振荡混合10min后静置1h；3000g以上，室温(20-25℃)离心15min；移取1ml中间层至5ml聚苯乙烯离心管中，加入1ml正己烷，用振荡器充分振荡5min，3000g以上，室温(20-25℃)离心15min；除去上层，取下层清液用复溶工作液按1∶9体积比进行稀释(50μl下层清液加入450μl复溶工作液)混匀；取50μl用于分析，样品稀释倍数：40。

(二)肝脏前处理方法

除去肝脏中的脂肪部分，用均质器均质肝脏样本；称取5.0±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入20ml PBST缓冲液用振荡器振荡30min；3000g以上，室温(20-25℃)离心10min；移取2ml上层清液至10ml玻璃离心管中，加入3ml正己烷用振荡器充分振荡5min；3000g以上，室温(20-25℃)离心10min；除去上层，取下层清液用复溶工作液按1∶9体积比进行稀释(50μl下层清液加入450μl复溶工作液)混匀；取50μl水相进行分析，样本稀释倍数：40。

(三)鸡血前处理方法

用加有肝素钠(20-30单位/ml血)的离心管采集鸡血样本(建议采血注射器也用肝素钠润洗)，鸡血样本室温静置1h，待析出血浆后，3000g以上，15℃离心10min；取制备好的血浆样本20μl至5ml聚苯乙烯离心管，用复溶工作液按1∶199体积比进行稀释(20μl血清加入3980μl复溶工作液)；取50μl用于分析，样本稀释倍数：200。

(四)牛奶前处理方法

取20μl牛奶样本；加入780μl复溶工作液，混匀；取50μl用于分析，样本稀释倍数：40。

(五)奶粉前处理方法

称取1.0±0.05g奶粉样本；加入5ml去离子水，充分振荡至奶粉全部溶解；取出50μl，加入1950μl复溶工作液，混匀；取50μl用于分析，样本稀释倍数：200。

(六)疫苗前处理方法

将2×样本稀释液按1∶1稀释即为1×样本稀释液，备用；将待测样品用1×样本稀释液稀释至链霉素含量为0.05-4.05ng/ml范围内，取50μl用于分析，稀释倍数：2。

2、用试剂盒检测与结果分析

分别吸取20μl-100μl标准品或样本，然后加入20μl-100μl发光标记物，再加20μl-100μl荧光素标记物，充分混匀后，37℃温育15min；加入包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠80-150μl，混匀后在37℃温育5min；用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500μl冲洗复合物沉淀；所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物1和激发底物2，延迟3-5s后检测发出的相对光强度(RLU)，样本中链霉素的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU结合标准曲线法计算链霉素的浓度。

激发底物1是NaOH，激发底物2是H₂O₂。底物装载前，用蒸馏水清洗底物泵10-20遍，排空管道内残存的水迹后，再将相应的底物直接放入仪器内，将泵管插入底物瓶中；用底物冲洗管道5次，并测定底物的RLU值，正常情况下，底物的RLU值不应超过1200。若超过1200，需重新用蒸馏水对管道和底物泵进行更多次清洗，直至空白值降至合理范围内。若超过三天不做实验，需卸载底物瓶，并盖上盖子，以防蒸发。随后用蒸馏水清洗管道，并排空，以免强碱溶液腐蚀底物泵。

本发明采用6个链霉素标准品(0ng/ml，0.01ng/ml，0.03ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml，1.0ng/ml)进行曲线测绘。仪器根据所述方法检测得到一条RLU值与链霉素浓度相关的定标曲线，此后测量中，每一个样本中的链霉素浓度与标准曲线相比较得出样本中的链霉素含量。

实施例四 试剂盒质量的测定

1、试剂盒的灵敏度

试剂盒灵敏度的定义为：测定20次零标准品，测定的平均值加上3倍标准差。该试剂盒的灵敏度为0.01ng/ml。

2、样本的准确度和精密度

准确度是指测定值与真值间的符合程度，试剂盒准确度常用回收率表示。精密度又称可重复性，常用变异系数表示。

按照实施例三的样本提取方法，以0.8ng/g(ml)、1.6ng/g(ml)两个浓度的链霉素分别对鸡肉、鸡肝、牛奶进行添加，以4ng/g、8ng/g两个浓度的链霉素对鸡血、奶粉样本进行添加回收，以0.04ng/g、0.08ng/g两个浓度的链霉素对疫苗样本进行添加回收，每种样本每个浓度各4个平行，用三批试剂盒进行测定，计算样本的平均回收率及精密度。实验结果见下表。

表1 准确度和精密度测定ng/g(ml)

从表可知，鸡肉、鸡肝、鸡血、牛奶、奶粉、疫苗样品中链霉素两个浓度均添加的平均回收率范围在85.7-96.3％之间，批内、批间均变异系数小于15％。

3、特异性

交叉反应率是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。

表2 试剂盒交叉反应率

药物名称	交叉反应率
		链霉素	100％
硫酸链霉素	94％
		双氢链霉素	105％
卡拉霉素	小于1％

庆大霉素

小于1％

4、相关性

X＝CI-2008，Y＝RIA

Y＝1.24X-2.68

R＝0.9765

X为CI-2008系统测定结果，Y为放免测定结果。

Claims (8)

1.一种检测链霉素的磁颗粒化学发光试剂盒，包括的试剂有：发光标记物、荧光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的分离试剂是包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的顺磁性纳米微珠是里面包覆有Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃，表面含有-OH、-COOH或-NH₂活性基团的微珠。

4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物标记的链霉素半抗原。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的异鲁米诺发光标记物是ABEI、AHEI或ABEN。

6.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括标准液、质控品和浓缩洗液。

7.根据权利要求1-3之一所述的试剂盒，其特征在于：所述的荧光素标记物是FITC标记的链霉素单克隆抗体。

8.一种利用权利要求1-7任一项所述的试剂盒检测链霉素的方法，包括下列步骤：

1)分别吸取20μl-100μl标准品或样本，然后加入20μl-100μl发光标记物，再加20μl-100μl荧光素标记物，充分混匀后，37℃温育15min；

2)加入包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠80-150μl，混匀后在37℃温育5min；

3)用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500μl冲洗复合物沉淀；

4)上述清洗步骤重复2-4次；

5)4)所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物1和激发底物2，延迟3-5s后检测发出的相对光强度(RLU)，样本中链霉素的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU集合标准曲线法计算链霉素的浓度。