CN102565401A - 检测喹诺酮类药物的磁颗粒化学发光试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测喹诺酮类药物的磁颗粒化学发光试剂盒，包括的试剂有：发光标记物、荧光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。发光标记物是异鲁米诺发光标记物标记的喹诺酮类药物半抗原，荧光标记物是指荧光素或其衍生物标记的喹诺酮类药物单克隆抗体，分离试剂是指包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠。本发明还涉及一种采用所述的试剂盒检测动物源性食品中喹诺酮类药物的方法，本方法对喹诺酮类药物检测具备较高的灵敏度、特异性和较快的检测速度。

Description

检测喹诺酮类药物的磁颗粒化学发光试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种直接化学发光检测试剂盒及其测试方法，特别是检测动物组织、鸡蛋、蜂蜜等样本中喹诺酮类药物残留量的磁颗粒竞争直接化学发光检测试剂盒。 

技术背景

喹诺酮类药物类抗菌药(4-quinoloes)，又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是一类较新的合成抗菌药，该类药物的开发始于1962年的萘啶酸，自1978年诺氟沙星的问世以来，以开发及正在开发的超过五十种。 

喹诺酮类药物类抗菌药以细菌的脱氧核糖核酸(DNA)为靶，造成染色体的不可逆损害，而使细胞细菌不再分裂，主要作用于革兰阴性菌的抗菌药物，对格兰阳性菌的抗菌作用较弱(某些品种对金黄色葡萄球菌有较好的抗菌作用)。 

喹诺酮类药物抗菌药按发明先后及其抗菌性能的不同，分为一、二、三、四代，第一代喹诺酮类药物类抗菌药的品种有萘啶酸(Nalidixic acid)和吡咯酸(Piromidic acid)等，第二代喹诺酮类药物类抗菌药的品种有新恶酸(Cinoxacin)和甲氧噁喹酸(Miloxacin)等，第三代喹诺酮类药物类抗菌药的品种有诺氟沙星(Norfloxaicin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、培氟沙星(Perfloxacin)、依诺沙星(Enoxacin)和环丙沙星(Ciprofloxacin)等，第四代喹诺酮类药物类抗菌药的品种有加替沙星(Gatifloxacin)与莫西沙星(Moxifloxacin)等。 

喹诺酮类药物类药物可用于治疗呼吸道感染、泌尿生殖系统感染、消化系统感染及其它类的各种感染，还可用于抗肿瘤和抗病毒作用。除了被应用于人体的疾病治疗，还被应用到水产业上。该类药物易诱发细菌耐药性，故对生产食品动物使用的管理方式越来越严格，欧盟和北美等国家只批准恩诺沙星作为动物专用的抗菌药，诺氟沙星和环丙沙星已禁止在水产养殖业中使用。同时我 国及世界卫生组织、日本等国家和组织都将喹诺酮类药物类药物列入限制使用的兽药名单，并制订出相应的最高残留限量：根据不同动物品种、组织和药物种类，最高残留限量在10-6000μg/kg之间。日本2006年5月开始实施“肯定列表制度”后，对喹诺酮类药物类药物残留的检测要求进一步提高 

目前，喹诺酮类药物类药物的检测主要有微生物法(MIA)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS)、酶联免疫法(ELISA)等。 

1、微生物法(MIA)是利用抗菌药物具有的抗微生物活性，在特定的培养基上接种已知微生物，再加入被测样品或提取液，经过一定时间的培养，根据对特异微生物的抑制作用观察所含药物的抑菌效果，利用抑菌差异筛选出残留物质的种类。微生物法是日本食肉卫生检查所和各个食品检查机构检测肉食品中抗生素残留的常规筛选方法。MIA方法的灵敏度与分析者所期望的水平和规定的最高残留限量(MRL)显示出满意的结果，尽管如此，在所期望的检测水平下，阴性样品的可靠性不被保证。 

2、高效液相色谱法(HPLC)具有检测精度高、假阳性率低的特点。HPLC法的主要缺点是仪器价格昂贵，操作比较繁琐，耗时长，检测费用昂贵，对检测人员专业要求较高，样本前处理较复杂。 

3、液相色谱-质谱法(LC-MS)，样品不需要衍生化处理，可对尿液、血液、肝脏、毛发和眼球样品进行检测。该方法对喹诺酮类药物的最低检测限达到1.0μg/kg，LC-MS/MS联用，可进一步提高信噪比，所以可用于对阳性结果的确认手段。但是，无论LC-MS还是LC-MS/MS，仪器检测法未能解决仪器造价昂贵，操作步骤繁琐，样本前处理复杂，对操作人员专业素养要求高等问题。 

4、酶联免疫法(ELISA)是20世纪70年代出现，用于微量物质的检测，最早应用于传染病、肿瘤标志物、激素水平等临床检测，90年代开始在我国食品安全检测领域推广应用，目前依托ELISA技术的试剂盒、试纸条已经成为食品安全快速检测领域的主导产品，同时也是我公司研发和销售的主要产品类型。酶联免疫检测法基于抗原-抗体的特异性反应，检测灵敏度较高、特异性较好，技术操作简易，容易掌握，确实解决了大量的以前难以解决的许多微量小分子物质如抗生素、激素、农药残留等的定性、定量分析工作，对食品安全快速检 测技术的发展起到了积极的促进作用。但是，ELISA方法存在许多自身无法克服的缺陷，主要表现在： 

1)非均相反应：检测过程中为分离游离物与结合物，需要多步洗板过程，耗时费力，难以提高操作的自动化程度。 

2)酶催化反应：借助酶催化底物显色，测定反应液吸光度值。反应的时间与温度对酶活力存在较大影响，试剂稳定性差。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种喹诺酮类药物检测试剂盒，采用该试剂盒进行喹诺酮类药物的检测时不仅具备较高的灵敏度，特异性，而且具有较高的反应速度。 

本发明的另一个目的在于提供一种喹诺酮类药物的测试方法，该方法操作简单，灵敏度高，特异性好。 

实现上述目的，本发明提供一种喹诺酮类药物检测试剂盒，其包含的主要试剂有：发光标记物、荧光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。 

所述的分离试剂是包被有羊抗FITC单克隆抗体的磁珠。 

所述的顺磁性纳米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH₂活性基团的微珠，用于包被羊抗FITC单克隆抗体，其内芯是Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃，使得微珠具有顺磁性。 

所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物标记的喹诺酮类药物半抗原。所述的异鲁米诺衍生物是ABEI、AHEI或ABEN。 

所述的试剂盒还包括标准品，质控品和浓缩洗液。 

所述的荧光素标记物是FITC标记喹诺酮类药物单克隆抗体。 

本发明还提供一种利用试剂盒检测喹诺酮类药物的方法，包括下列步骤： 

1)分别吸取20μl-100μl标准品或样本，然后加入20μl-100μl发光标记物，再加20μl-100μl荧光素标记物，充分混匀后，37℃温育15min； 

2)加入包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠80-150μl，混匀后在37℃温育5min； 

3)用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500μl冲洗复合物沉淀； 

4)上述清洗步骤重复2-4次； 

5)4)所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物1和激发底物2，延迟3-5s后检测发出的相对光强度(RLU)，样本中的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU集合标准曲线法计算喹诺酮类药物的浓度。 

所述的发光底物的主要成分是NaOH和H₂O₂。 

本发明中分析测试方法所用的分析仪是：包括电源电路、自动注射泵1和2、测量室、发光室、光电倍增管计数器和输出系统，同时还配置有计算机与中文界面的Windows控制软件，可进行资料录入、结果汇总、质量控制、结果储存和结果查询等功能，可完成多种分析模式的编程，定量或定性报告结果，自动生成并储存、更新功能，两点自动修正标准曲线，所采用的系统是CI-2008系统。 

本发明所述的分离试剂是包被羊抗FITC单克隆抗体，其表面基团的含量是0.1-0.3eqm/g，其保存于含有pH7.1-7.4，4-7％卵清蛋白，0.2-0.5％吐温-20，0.2-0.4％NaN₃，0.2-0.3mol/LPBS缓冲液中。所述的FITC是异硫氰酸荧光素。所述百分含量为质量百分含量。 

所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物ABEI、AHEI或ABEN标记的喹诺酮类药物半抗原，其保存于pH6.4-6.8，0.1-0.3％吐温-20，0.1-0.3％NaN₃的0.1-0.2mol/LPBS缓冲液中。所述百分含量是质量百分含量。 

所述的荧光素标记物是FITC标记的喹诺酮类药物单克隆抗体，其保存于pH7.0-7.4，含1-3％卵清蛋白，0.2-0.4％NaN₃的0.1-0.2mol/LPBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。 

喹诺酮类药物标准品溶液(0ng/ml，0.01ng/ml，0.03ng/ml，0.09ng/ml，0.27ng/ml，0.81ng/ml)，标准品稀释液为pH6.4-6.7，0.3-0.5％NaN₃，0.2-0.3mol/LPBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。 

喹诺酮类药物质控品溶液浓度分别为0.02ng/ml，0.5ng/ml，质控品稀释液pH6.4-6.7，0.3-0.5％NaN₃，0.2-0.3mol/LPBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。 

所述的浓缩洗液为PH7.2-7.6，0.2-0.4％吐温-20，0.2-0.4％NaN₃，0.1-0.2mol/L PBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。 

本发明的有益效果如下： 

1)本发明试剂盒可特异性检测喹诺酮类药物。 

2)本发明试剂盒的灵敏度较高，对喹诺酮类药物的检测灵敏度可达0.1ng/ml。 

3)本发明试剂盒的检测快捷，检测时间低于20min。 

具体实施方式

实施例1试剂盒具体组分的制备 

1、发光标记物的制备 

a)半抗原的合成 

将环丙沙星和丁二酸酐合成带有羧基的喹诺酮半抗原，从而在分子中引入羧基。 

b)发光标记物制备 

取4.5mmol/L ABEI，溶于4ml蒸馏水中，5.0mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺溶于0.5ml N，N-二甲基甲酰胺中，二者充分混匀后室温反应3-4h。取上述制备的喹诺酮类药物半抗原15mg，用pH7.4PBS调节体积到1.5ml，然后加入上述活化的ABEI溶液，充分混匀后室温反应过夜，过G-25凝胶柱纯化。 

2、荧光标记物制备 

a)免疫原的制备： 

将喹诺酮类药物半抗原与牛血清白蛋白采用混合酸酐法进行偶联得到免疫原。 

b)喹诺酮类药物单克隆抗体的制备 

动物免疫：以氟喹诺酮类药物免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，免疫剂量为100μg/只，使其产生抗血清。 

细胞融合和克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，得到单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

细胞冻存和复苏：将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除 冻存液后，移入培养瓶内培养。 

单克隆抗体的制备与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.4ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20℃环境保存。 

c)荧光标记物制备用0.025mol/L，pH9.0的碳酸盐缓冲液将喹诺酮类药物单克隆抗体稀释成1％质量百分比浓度；根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0.01mg FITC，用分析天平准确称取所需的FITC粉末。用同一缓冲液将FITC配成0.1mg/ml的溶液，按上述抗体溶液体积的3-5倍，混入FITC稀释液；在4～℃避光条件下电磁搅拌、标记30-48h；将标记溶液3000r/min，室温离心20min，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再pH7.4的PBS缓冲液透析2-3天，期间至少更换透析液3次；取透析过夜的标记物，通过SephadexG-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光标记物进行鉴定，分装，贮存于4℃冰箱中。 

3、分离试剂制备 

a)磁珠活化 

表面-COOH基团的磁珠(购于DYNAL，粒径为2.8μm)，其含量是0.15eq/g；取100μl磁珠，用100μl 25mmol/L，pH5.0，0.05％Tween-20MES溶液洗涤两次，磁分离后移除上清；使用前，用4℃贮存的25mmol/L MES溶液分别配置50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50μl新配置的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min；离心管置于磁分离架上磁分离4min，移除上清，加入100μl，25mmol/L，pH5.0，MES清洗2-3次后即可得表面羧基活化的磁珠。 

b)磁珠偶联羊抗FITC单克隆抗体 

将50-100μg羊抗FITC单克隆抗体溶解到60μl，25mmol/L，pH5.0MES中，用所述MES溶液调节总体积至100μl，轻柔混匀磁珠与抗体；室温条件下至少偶联30min或4℃偶联2h，该期间可利用涡旋仪使磁珠保持混匀状态；离心管置于磁分离架上磁分离3-5min，移除上清；为了淬灭未反应的-COOH，可加入100μl，pH7.4，TRIS反应15min或100μl，pH8.0，含有50mmol/L乙醇胺的PBS 封闭磁珠；用100μl，0.1-0.3％BSA，0.1％Tween-20的PBS或TRIS清洗封闭好的磁珠3-5次；最后将磁珠复溶于含0.1-0.5％BSA，0.01-0.1％Tween-20，0.02％NaN₃的PBS或TRIS缓冲液中，2-8℃保藏。 

实施例二试剂盒的组建 

组建检测喹诺酮类药物的磁颗粒化学发光检测试剂盒，使其含有下列组分： 

FITC标记的喹诺酮类药物单克隆抗体的荧光标记物 

ABEI标记的喹诺酮类药物半抗原的发光标记物 

表面包被羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠的分离试剂 

喹诺酮类药物标准品溶液(0ng/ml，0.01ng/ml，0.03ng/ml，0.09ng/ml，0.27ng/ml，0.81ng/ml)，标准品稀释液为pH6.5，含有0.4％NaN₃，0.3mol/L PBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。 

喹诺酮类药物浓度质控品溶液浓度分别为0.02ng/ml，0.5ng/ml，标准品稀释液为pH6.5，含有0.4％NaN₃，0.3mol/L PBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。 

浓缩洗液为PH7.4，0.4％吐温-20，0.3％NaN₃，0.2mol/L PBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。 

实施例三实际样品中喹诺酮类药物的检测 

1、样本前处理 

(一)鸡肉样本 

用均质器均质组织样本；称取3.0±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中； 

加入9ml乙腈-0.1M氢氧化钠溶液，充分上下振荡混合10min，3000g以上，15℃离心10min；移取4ml上清液至50ml聚苯乙烯离心管中，加入4ml 0.02M磷酸盐缓冲液，再加入8ml二氯甲烷，振荡器振荡10min，3000g以上，15℃离心10min，去上层，取下层有机相6ml至10ml干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；用0.5ml复溶工作液，用涡旋仪充分涡动2min溶解干燥的残留物，加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动2min，3000g以上，15℃离心5min；轻吸掉上层正己烷及中间层杂质，取下层50μl用于分析，样本稀释倍数：1。 

(二)血清样本前处理方法 

将采集的鸡血样本室温放置，待析出血清；吸取0.5ml血清样本至10ml干净的聚苯乙烯离心管中，加入4ml乙腈-二氯甲烷溶液，用振荡器剧烈振荡5min，3000g以上，室温(20-25℃)离心8min；吸取上层有机相2ml至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动10s，再加入1ml复溶工作液，用涡旋仪涡动1min，3000g以上，室温(20-25℃)离心5min；除去上层有机相，取下层水相50μl用于分析，样本稀释倍数：4。 

(三)鸡蛋前处理方法 

用均质器低速均质鸡蛋样本，使得蛋清和蛋黄充分混合；取2.0±0.05g鸡蛋样本至15ml聚苯乙烯离心管中，加入8ml乙腈，用振荡器充分振荡5min；取2ml上清液至10ml干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动1min；加入1ml复溶工作液，用涡旋仪充分涡动1～2min，3000g以上，室温(20-25℃)离心5min；去除上层有机相，取下层50μl用于分析，样本稀释倍数：2。 

(四)饲料前处理方法 

取1.0±0.05g饲料样本于50ml聚苯乙烯离心管中，加入9ml 0.1M氢氧化钠溶液，再加入1ml甲醇，充分振荡5min，3000g以上，室温(20-25℃)离心5min； 

移取50μl上清液至2ml聚苯乙烯离心管中，加入450μl复溶工作液；取50μl用于分析，样本稀释倍数：100。 

(五)水产前处理方法 

取2.0±0.05g均质样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入1ml 0.1M氢氧化钠溶液，再加入7ml乙腈，用振荡器充分振荡5min；3000g以上离心10min；取2ml上清液于10ml玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正已烷用涡旋仪涡动30s，再加入1ml复溶工作液，涡动30s，3000g以上，室温(20-25℃)离心5min；除去上层有机相，取下层50μl用于分析，样本稀释倍数：2。 

(六)蜂蜜前处理方法 

称取1.0±0.05g样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入1ml去离子水，涡动 充分溶解，再加入7ml乙腈，振荡混匀5min；3000g以上，室温(20-25℃)离心10min，取1ml上层清液，至10ml干燥玻璃管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml复溶工作液，涡动1min，取50μl用于分析，样本稀释倍数：8。 

注：有结晶析出的蜂蜜样本在称取之前请于60℃水浴30-60min，振荡样本充分混匀后再取样。 

2、用试剂盒检测与结果分析 

分别吸取20μl-100μl标准品或样本，然后加入20μl-100μl发光标记物，再加20μl-100μl荧光素标记物，充分混匀后，37℃温育15min；加入包被有抗羊FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠80-150μl，混匀后在37℃温育5min；用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500μl冲洗复合物沉淀；所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物1和激发底物2，延迟3-5s后检测发出的相对光强度(RLU)，样本中喹诺酮类药物的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU结合标准曲线法计算喹诺酮类药物的浓度。 

激发底物1是NaOH，激发底物2是H₂O₂。底物装载前，用蒸馏水清洗底物泵10-20遍，排空管道内残存的水迹后，再将相应的底物直接放入仪器内，将泵管插入底物瓶中；用底物冲洗管道5次，并测定底物的RLU值，正常情况下，底物的RLU值不应超过1200。若超过1200，需重新用蒸馏水对管道和底物泵进行更多次清洗，直至空白值降至合理范围内。若超过三天不做实验，需卸载底物瓶，并盖上盖子，以防蒸发。随后用蒸馏水清洗管道，并排空，以免强碱溶液腐蚀底物泵。 

本发明采用6个喹诺酮类药物标准品(0ng/ml，0.01ng/ml，0.03ng/ml，0.09ng/ml，0.27ng/ml，0.81ng/ml)进行曲线测绘。仪器根据所述方法检测得到一条RLU值与喹诺酮类药物浓度成反比的定标曲线，此后测量中，每一个样本中的喹诺酮类药物浓度与标准曲线相比较得出样本中的喹诺酮类药物含量。 

实施例四试剂盒质量的测定 

1、试剂盒的灵敏度 

试剂盒灵敏度的定义为：测定20次零标准品，测定的平均值加上3倍标准差。该试剂盒的灵敏度为0.01ng/ml。 

2、样本的准确度和精密度 

准确度是指测定值与真值间的符合程度，试剂盒准确度常用回收率表示。精密度又称可重复性，常用变异系数表示。 

按照实施例三的样本提取方法，以0.05ng/g(ml)、0.1ng/g(ml)两个浓度的喹诺酮类药物分别对鸡肉、鸡蛋、水产样本进行添加，以0.2ng/g(ml)、0.4ng/g(ml)两个浓度的喹诺酮类药物分别对血清、蜂蜜样本进行添加，以2ng/g、4ng/g两个浓度的喹诺酮类药物分别对饲料样本进行添加，每种样本每个浓度各4个平行，用三批试剂盒进行测定，计算样本的平均回收率及精密度。实验结果见下表。 

表1准确度和精密度测定ng/g(ml) 

从表可知，鸡肉、血清、鸡蛋、饲料、水产、蜂蜜样本中喹诺酮类药物两个浓度均添加的平均回收率范围在85.9-99.3％之间，批内、批间均变异系数小于15％。 

3、特异性 

交叉反应率是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。 

表2试剂盒交叉反应率 

药物名称	交叉反应率
		环丙沙星	100％
恩诺沙星	97.3％
		氧氟沙星	125.0％
达氟沙星	98.1％
		诺氟沙星	166.7％
洛美沙星	88.2％
		培氟沙星	153.6％
依诺沙星	105.3％
		噁喹酸	106.4％
氟甲喹	90.5％
		麻保沙星	92.5％
氨氟沙星	110％
		双氟沙星	小于1％
沙拉沙星	小于1％

4、相关性 

X＝CI-2008，Y＝RIA 

Y＝1.23X-2.84 

R＝0.9726 

X为CI-2008系统测定结果，Y为方面测定结果。 

Claims (8)

1.一种检测喹诺酮类药物的磁颗粒化学发光试剂盒，包括的试剂有：发光标记物、荧光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的分离试剂是包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的顺磁性纳米微珠是里面包覆有Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃，表面含有-OH、-COOH或-NH₂活性基团的微珠。

4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物标记的喹诺酮类药物半抗原。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的异鲁米诺发光标记物是ABEI、AHEI或ABEN。

6.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括标准液、质控品和浓缩洗液。

7.根据权利要求1-3之一所述的试剂盒，其特征在于：所述的荧光素标记物是FITC标记的喹诺酮类药物单克隆抗体。

8.一种利用权利要求1-7任一项所述的试剂盒检测喹诺酮类药物的方法，包括下列步骤：

1)分别吸取20μl-100μl标准品或样本，然后加入20μl-100μl发光标记物，再加20μl-100μl荧光素标记物，充分混匀后，37℃温育15min；

2)加入包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠80-150μl，混匀后在37℃温育5min；

3)用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500μl冲洗复合物沉淀；

4)上述清洗步骤重复2-4次；

5)4)所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物1和激发底物2，延迟3-5s后检测发出的相对光强度(RLU)，样本中喹诺酮类药物的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU集合标准曲线法计算喹诺酮类药物的浓度。