CN101545913A - 三碘甲腺原氨酸磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种定量检测三碘甲腺原氨酸(T3)磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。主要由三碘甲腺原氨酸系列校准品、抗异硫氰酸酯荧光素(FITC)单克隆抗体包被的磁微粒溶液、生物素标记的T3抗原、FITC标记的T3单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的链亲和素、化学发光底物液以及20倍浓缩洗涤液组成。本发明采用“竞争法”的反应模式,有效地利用了化学发光技术结合磁微粒和生物素-亲和素免疫放大技术原理,定量检测人体血清、血浆样品中T3的含量,确保了检测的灵敏度。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点,为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析领域,特别涉及到一种定量测定三碘甲腺原氨酸的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒。本发明试剂盒结合了生物素—亲和素免疫放大技术、免疫磁微粒分离技术和化学发光免疫分析技术。
背景技术
甲状腺是内分泌系统中重要的组成部分,是人体内最大的内分泌腺,平均生理重量约为20-25g,甲状腺分泌两种具有生理活性的激素,即甲状腺素(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)。它们在人体生长发育、细胞代谢和体内激素平衡,对维持代谢、骨骼肌和各器官系统的发育都起着重要的调节作用。然而,三碘甲腺原氨酸(T3),是不具有明显的生物活性的,血液中3%以下的T3是由甲状腺分泌的,97%以上都是由甲状腺素(T4)代谢脱碘而来的,在血液循环中绝大部分与血浆中甲状腺结合球蛋白(TBG)结合。在临床上,检测血液中T3的含量有助于了解人体的碘代谢及其甲状腺功能状况,另外,血清中T3的测定不仅可作为诊断甲状腺机能亢进症(甲亢)和甲状腺机能减退症(甲低)的参考指标,而且还有助于低T3综合症和甲低的鉴别诊断,同时还可以作为观察影响甲状腺激素代谢的药物胺碘酮副作用的一种手段。因此,发明一种快速、高灵敏和高特异性检测人血液中T3具有一定的价值和深远意义。
目前,免疫分析法作为一种重要的分析方法已广泛应用于临床诊断和生物化学等方面的研究。常用三碘甲腺原氨酸检测的方法有放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)、酶联免疫分析法(enzymelinked immunoassay,ELIA)和时间分辨荧光免疫分析法(time resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)等。这些方法均有着不足之处:放射免疫法不可避免地用到放射性元素125I,对人和环境都有一定的影响;酶联免疫分析法有着较低的灵敏度;荧光免疫分析法需要昂贵的仪器和试剂。而化学发光免疫分析法是一种基于化学发光分析的高灵敏度和免疫分析的高特异性的分析方法,该法具有特异性高、灵敏度高、快速、简便及无放射性污染等优点,已受到广大医学、生物和化学工作者的关注。
在实际的免疫检测中,由于待测样品中所含的杂质成分较多,一定程度上影响了检测灵敏度和准确性,所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物,是临床检验工作者面临的难题之一。免疫磁微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体,以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲合力的各种免疫活性物质(抗原或抗体),使其致敏为免疫磁微粒,具有分离速度快、效率高、可重复性好;操作简单;不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能等特点,在外加磁场作用下定向运动,使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。采用免疫磁微粒技术与化学发光免疫分析技术结合检测待测物,可大大提高检测的灵敏度和准确性。该技术的新颖之处有:(1)采用微小的磁微粒作为固相载体,可增加包被表面积,从而增加了抗体的有效包被量,增加了抗原、抗体的接触面积及底物发光面积,提高反应的灵敏度;(2)使用单克隆抗体,提高了反应的特异性。
本发明采用竞争法测定血清中的三碘甲腺原氨酸,通过抗体分别与抗原和酶标抗原或是生物素化的抗原竞争,从而可以迅速的从血清中高度特异的识别相应的抗原。单纯利用物理吸附把单克隆抗体包被到固相载体上会存在抗体用量大,活性损失大等缺点,而采用生物素-亲和素系统(biotin-avidin system,BAS)就可以避免这样的缺点。该系统具有多级的信号放大作用,并且不增加非特异性干扰,且具有灵敏度高、特异性好、稳定性高、适用性强和实验成本低等特点。待测反应体系可以利用生物素化的抗原,使得亲和素-生物素系统与免疫分析检测体系偶联,放大终反应:先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化的抗原与抗原(标准抗原和待测抗原)同时竞争反应,在固相载体表面形成免疫复合物,再加入亲和素与复合物中的生物素结合,最终使反应信号放大,从而提高了免疫分析的灵敏度。本发明就是利用链亲和素标记碱性磷酸酶(ALP)和生物素化的抗原以适当的比例混合,将血清样品和标准加入固相抗体,再加入两种标记物的混合液,链亲和素迅速与生物素结合,生物素化的抗原和ALP标记链亲和素与血清中的蛋白分子竞争形成特异性的结合,然后加入化学发光底物,利用化学发光仪检测相对发光强度,就可以定量分析人血清中的三碘甲腺原氨酸。
本发明的化学发光免疫分析结合生物素-亲和素系统体系是一种检测T3的先进而有效的方法,无需昂贵的仪器,还可以大大提高灵敏度,并且操作简便、适用性广,既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪,也可用于全自动的测量系统,更加有助于促进化学发光免疫分析技术在临床检验、检测中的应用与发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物素—亲和素免疫放大技术和免疫磁微粒技术结合化学发光免疫分析定量测定T3的磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒。
根据本发明的试剂盒包括:T3校准品、抗异硫氰酸酯荧光素(FITC)单克隆抗体包被的磁微粒溶液、生物素标记的T3与FITC标记的T3单克隆抗体的混合液、碱性磷酸酶标记的链亲和素液、上述酶所作用的化学发光底物液、以及20倍浓缩洗涤液。
本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。
根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤:
1)以T3纯品配制校准品;
2)制备抗FITC单克隆抗体包被的磁微粒溶液;
3)制备生物素标记的T3;
4)FITC标记的T3单克隆抗体;
5)以碱性磷酸酶标记链亲和素;
6)配制碱性磷酸酶所作用的化学发光底物液;
7)配制20倍浓缩洗涤液;
8)分装上述校准品、抗体包被的磁微粒、生物素标记物、FITC标记物、酶标记物、化学发光底物液和20倍浓缩洗涤液;以及
9)组装为成品。
根据本发明的方法,在所述制备抗FITC单克隆抗体包被的磁微粒步骤2)中:
所述磁微粒为2~3μm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹带有活性基团的聚合物,其使用浓度为3~8mg/mL;
所述抗体包被磁微粒是通过戊二醛两步法以抗FITC单克隆抗体包被磁微粒。
所述制备生物素标记的T3步骤3)中:
所述生物素标记的T3是通过生物素琥珀酰亚胺酯在微碱性条件下与抗原发生偶联反应而实现的。
根据本发明的方法,在所述以碱性磷酸酶标记链亲和素的步骤5)中,采用改良的戊二醛法以碱性磷酸酶标记链亲和素。
根据本发明的方法,所述化学发光底物液1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷(AMPPD)。
所述20倍浓缩洗涤液包含2.4%Tris、16%NaCl、0.4%KCl、1.5%HCl,pH值为7.4。
具体的上述试剂盒可以包括校准品、磁微粒溶液、生物素标记物、FITC标记物、酶标记物、化学发光底物液与洗涤缓冲液等。其中,所述校准品的原料为标准级,纯度不低于90%;抗FITC抗体包被于磁微粒上;FITC标记的是单克隆抗体;生物素标记的抗原;标记链亲和素的酶为碱性磷酸酶;化学发光底物液为1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷(AMPPD)溶液;洗涤缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
本发明“三碘甲腺原氨酸磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒”可以简便快捷、高灵敏、高重现性地检测出人血清中三碘甲腺原氨酸的含量,可以根据三碘甲腺原氨酸含量的多少判断病情及治疗效果。本发明的试剂盒(化学发光法、生物素-亲和素免疫放大技术与免疫磁微粒结合)提供了一种高灵敏、宽范围、简便快速、稳定地定量检测T3的测定试剂盒,该试剂盒适于产业化,具有良好的市场应用前景,特别适合广大的中小医院推广使用,为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。
本发明采用“竞争法”的反应模式,有效地利用了化学发光技术结合磁微粒和生物素-亲和素免疫放大技术原理,定量检测人体血清、血浆样品中T3的含量,确保了检测的灵敏度。本发明的试剂盒结构简单,使用方便,价格便宜,携带便利,与市场上的酶免疫试剂盒相比,线性表现均很好,并且临床符合率也大大提高,可为诊断人体甲状腺机能亢进症(甲亢)和甲状腺机能减退症(甲低)提供更为特异、快速、可靠的依据。
附图说明
图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图(logit-log标准曲线)。
图2为本发明的试剂盒同ELISA试剂盒临床血样测值比对的相关曲线。
具体实施方式
实施例1制备本发明的T3磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒
一、T3校准品的制备
用去激素人血清将T3纯品稀释成校准品,分装0、0.5、1.0、2.5、7.5、15ng/mL共6瓶。
二、抗FITC单克隆抗体包被磁微粒溶液的制备
将粒径为2~3μm的磁微粒用戊二醛进行活化,室温搅拌,混匀2小时后,加磁场,静置20~25min,倒出上清,用pH值为7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液清洗三次,并用该溶液进行悬浮,浓度为50~100mg/mL;每毫升悬浮液中加入抗FITC单克隆抗体60~100μg,在4℃下搅拌过夜后,加磁场,静置10~15min,倒出上清,用含有0.2%~1.0%牛血清白蛋白、0.5%~1.0%酪蛋白、0.02mol/L的磷酸缓冲液(pH为7.2)于室温封闭3~4小时;最后用pH值为7.4、含吐温-20和叠氮化钠防腐剂的磷酸盐洗涤缓冲液清洗3~5次,并用该溶液配制成5~10mg/mL的工作液。磁微粒溶液在4℃保存,不应冻存,用时轻轻摇匀。
三、生物素标记物和FITC标记物的制备
1、生物素标记的T3的制备
生物素标记T3以生物素琥珀酰亚胺酯在微碱性条件下与抗原发生偶联反应,对PBS充分透析,生物素标记物以去激素人血清稀释,加入1‰的proclin 300,—20℃以下保存。
2、FITC标记的T3单克隆抗体的制备
FITC可以与抗体的伯氨基直接反应。将适量抗T3单克隆抗体置于透析袋在50mmol·L-1NaHCO3缓冲液(pH9.3)中过夜透析后,置入溶有适量FITC的50mmol·L-1碳酸盐缓冲液(pH9.5)中,在4℃下搅拌反应16~20小时。更换透析液,以0.01mol·L-1PBS液(pH7.4)为透析液,每隔4~6小时更换一次,共更换4~5次。之后提取反应液于离心管中,3000rpm离心30min,弃去沉淀。标记物中加入等体积甘油后,置-20℃下保存待用。
四、碱性磷酸酶标记的链亲和素的制备
以碱性磷酸酶标记链亲和素采用改良的戊二醛,具体标记过程如下:
称取2.0mg碱性磷酸酶和4.0mg加入用碳酸盐缓冲液配制的链亲和素分别溶解于生理盐水中至1.5mL。加入新鲜配制的0.5mL的戊二醛,室温磁力搅拌15min,避光反应4h;加入1.0mol/L的乙醇胺0.1mL,室温振荡2h。4℃条件下用PBS加磁力搅拌10h透析,更换透析液两次。离心去除沉淀;加等体积甘油,分装后,—20℃以下保存。采用方阵法选择酶标记物的工作浓度范围为1:2000~4000。
五、化学发光底物液的配置
本发明所使用的碱性磷酸酶(ALP)的化学发光底物液的配制方法:
Tris 24g
NaCl 160g
KCl 4g
HCl 15mL
双蒸水 1000mL
Proclin 300 1mL
AMPPD 200mL
六、20倍浓缩洗涤缓冲液
Tris 24g
NaCl 160g
KCl 4g
HCl 15mL
去离子水 1000mL
pH值为7.4。
七、半成品及成品组成
上述步骤所得产品分装即为半成品。随机抽出几份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成三碘甲腺原氨酸磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒,组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。
实施例2本发明的试剂盒的使用方法
一、样品前处理
取人的空腹晨血清样品,3000rpm离心5min,取上层血清进行分析。
二、检测方法
使用本试剂盒按照如下步骤操作:
1)洗涤缓冲液配制:将试剂盒提供的洗涤液缓冲液加蒸馏水20倍稀释;
2)将校准品、抗体包被的磁微粒、生物素标记物、FITC标记物和酶标记物从4℃冰箱中取出,放置15min,平衡至室温;
3)将实验需要的圆底聚苯乙烯试管编号后固定在板架上;
4)反应孔中分别加待测样品和各浓度校准品每孔加0、0.5、1.0、2.5、7.5、15ng/mL各50μL,每次试验设空白1管,然后除空白管外各管加标记物、碱性磷酸酶标记的亲和素和磁微粒溶液各100μL,37℃振荡反应45min;
5)将试管架置于磁分离器上分离5min,然后弃去管中溶液,用Tris洗液,洗涤5次,在吸水纸上拍干;
6)每管加化学发光底物300μL,充分混匀,37℃温育10min,置于磁分离器内,暗处放置10min;
7)在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU),测量时间1秒/管;
8)分别对校准品浓度和对应RLU取对数,在双对数坐标图上建立标准曲线,以校准品浓度的Log值为横坐标,RLU的Logit值为纵坐标绘出标准曲线,以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清三碘甲腺原氨酸的浓度,其中,RLU为发光强度,Concentration为T3浓度(单位为ng/mL)见附图1;
9)打印检测结果报告。
实施例3本发明的试剂盒的方法学检定
按照本领域中常规的检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定,本发明对试剂盒的精密度、准确度、灵敏度、特异性以及稳定性等都进行了具体的实验操作,结果如下:
1、试剂盒精密度测定
将实施例1中制备的试剂盒分别取三批进行精密度实验,分别测定低、中、高三种不用浓度的血清,8孔平行测定,重复3次,得出每次分析的批内和多次分析的批间变异(表1)。其批内和批间变异系数均小于10%。
表1 方法精密度考察
2、试剂盒准确度测定
准确性是指测量值接近真值的程度,通常用回收率表示。选用三份人血清,在最佳实验条件下测定浓度,然后分别向血清内加入浓度为0.5、2.5、10ng/mL的T3校准品,按照实施例1的方法对每个浓度做3个平行,计算回收率。结果如表2所示,表明T3的加标回收率在93.5%~106.2%之间。
表2 样品回收率测定
3、试剂盒灵敏度实验
灵敏度是在一给定的显著性水平上可与零剂量相区别的剂量,是指分析方法的最小检出量(记为零标准点的平均减去2SD)。平均测定10个S0标准点,计算其发光强度的平均值和标准偏差,带入线性方程,计算出对应的浓度值,并重复该操作5次,得到该方法的最低检出限为0.06ng/mL。并与其它方法比对,见表3。
表3 方法灵敏度实验
4、试剂盒稳定性实验
将固相抗体、酶结合物、标准品、发光底物液等在4℃和37℃下放置3d、7d、10d后进行实验,结果见表3。实验结果表明,结果表明实施例1的试剂盒指标均在正常范围之内,不同条件对实验结果均没有明显的影响,则说明该产品的稳定性很好。
表4 试剂盒稳定性的考察结果
经过大量的实验证明,本发明的试剂盒方法学指标如下:
检测范围:0~16ng/mL;
灵敏度:最小检出限为0.06ng/mL;
精密度:小于10%(n=5);
准确性:平均回收率在93.5%~106.2%之间;
特异性:与T4、FT3、FT4等其他类似物的交叉反应率小于1.0%;
稳定性:各试剂组分置4℃和37℃,考察3d、7d、10d后,各组分仍稳定。
以上结果说明“三碘甲腺原氨酸磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒”的临床检测范围、灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性是完全合格的。
利用本发明方法进行检测,灵敏度高,特异性强,检测范围宽,操作简单,无放射性污染,试剂盒成本低,临床适用性强,更适用于我国临床检测实验。因此本发明试剂盒为诊断甲状腺机能亢进症(甲亢)和甲状腺机能减退症(甲低),以及对甲状腺机能的早期预警和动态监测,提供了一种灵敏、准确、快捷、特异的方法。
实施例4本发明的试剂盒同ELISA试剂盒临床血样测值比对
用本发明的试剂盒和ELISA试剂盒对40份临床血清样品同时进行检测。其检测结果见附图2,以本发明方法测定的血样T3结果为横坐标,以ELISA测定的结果为纵坐标作回归分析,相关方程为:Y=0.7858X+0.1697,相关系数r=0.9835。经统计学处理结果表明,本发明方法同国外试剂盒临床血样测值相关性良好。
Claims (9)
1、一种三碘甲腺原氨酸(T3)磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:T3校准品、抗异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)单克隆抗体包被的磁微粒溶液、生物素标记的T3、FITC标记的T3单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的链亲和素、上述碱性磷酸酶所作用的化学发光底物液、以及20倍浓缩洗涤液。
2、如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述化学发光底物液1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷(AMPPD)。
3、如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述20倍浓缩洗涤液包含2.4% Tris、16% NaCl、0.4% KCl、1.5% HCl,pH值为7.4。
4、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法,其特征在于包括以下步骤:
1)以T3纯品配制校准品;2)制备抗FITC单克隆抗体包被的磁微粒溶液;3)制备生物素标记的T3;4)FITC标记的T3单克隆抗体;5)以碱性磷酸酶标记链亲和素;6)配制碱性磷酸酶所作用的化学发光底物液;7)配制20倍浓缩洗涤液;8)分装上述校准品、抗体包被的磁微粒、生物素标记物与FITC标记物的混合液、酶标记物、化学发光底物液和20倍浓缩洗涤液;以及9)组装为成品。
5、如权利要求4所述的方法,其特征在于,在所述制备抗FITC单克隆抗体包被的磁微粒步骤2)中:
所述磁微粒为2~3μm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹带有活性基团的聚合物,其使用浓度为3~8mg/mL;
所述抗体包被磁微粒是通过戊二醛两步法以抗FITC单克隆抗体包被磁微粒。
6、如权利要求4所述的方法,其特征在于,在所述制备生物素标记的T3步骤3)中:
所述生物素标记的T3是通过生物素琥珀酰亚胺酯在微碱性条件下与抗原发生偶联反应而实现的。
7、如权利要求4所述的方法,其特征在于,在所述以碱性磷酸酶标记链亲和素的步骤5)中,采用改良的戊二醛法以碱性磷酸酶标记链亲和素。
8、如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述化学发光底物液1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷(AMPPD)。
9、如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述制备20倍浓缩洗涤液包含2.4% Tris、16% NaCl、0.4% KCl、1.5% HCl,pH值为7.4。
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