CN101545912A - 胰岛素微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胰岛素微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明试剂盒包括：1)胰岛素校准品；2)胰岛素单克隆抗体包被的磁颗粒；3)碱性磷酸酶(ALP)标记的另一株单克隆抗体或多克隆抗体；4)微孔板；5)洗涤液；6)上述酶所作用的化学发光底物液。根据本发明制备上述试剂盒的制备方法包括：a)配制校准品；b)制备胰岛素抗体包被磁颗粒；c)以碱性磷酸酶标记胰岛素抗体；d)配制洗涤液；e)配制化学发光底物液。本发明试剂盒可以进行同时批量测量，适合大批量临床血清筛查。

Description

胰岛素微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明公开了一种胰岛素微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

胰岛素的分子量5700，由两条氨基酸肽链组成。A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。空腹时，血浆胰岛素浓度是5～15μIU/mL。进餐后血浆胰岛素水平可增加5～10倍。胰岛素的生物合成速度受血浆葡萄糖浓度的影响，当血糖浓度升高时，B细胞中胰岛素原含量增加，胰岛素合成加速。胰岛素主要用来治疗胰岛素依赖型糖尿病，而胰岛素的检测主要与C肽、谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)、胰岛素自身抗体(IAA)、胰岛素细胞自身抗体(ICA)等项目联合检测用来确诊糖尿病分型、疗效观察等。

目前用于检测胰岛素的免疫分析方法主要有放射免疫分析、酶联免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、化学发光免疫分析等。根据大量的试验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，优先顺序依次为：化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。

放射免疫分析技术因其使用放射性元素作为标记物，因此对环境有放射性污染，并存在灵敏度不高，操作复杂，试剂保存时间短等缺点；酶免疫分析法存在灵敏度低，信噪比不高，线性范围窄等方法学制约因素；时间分辨荧光免疫分析对检测环境的要求较高，易受空气尘埃的干扰；化学发光免疫分析法是一种较先进而有效的方法，可使检测灵敏度达到10^-18摩尔水平，而且检测范围可达6个数量级，其酶标记物稳定，可长期使用。化学发光免疫分析技术因其高灵敏、高特异、快速、高通量等特点得到越来越广泛的应用，目前化学发光主要有酶促底物化学发光和标记物直接发光两大系列，酶促化学发光所使用示踪物一般为碱性磷酸酶和碱性磷酸酶。而标记物直接发光分为：通过改变溶液酸碱度而发光的发光物质为吖啶酯；通过电极作用的电化学发光的发光物质是三联吡啶钌。

目前微孔板式免疫分析主要有酶联免疫分析和化学发光免疫分析，而微孔板式化学发光一般将微孔板作为固相载体，通过抗体的物理吸附作用包被在微孔板上，也有通过将亲和素或链亲和素包被在微孔板上，然后通过将生物素标记在抗体上，以亲和素-生物素较强的结合能力为桥联，间接地将抗体固定到微孔板的方法。

目前磁颗粒在化学发光的应用上主要采用单个反应杯或反应槽的形式。

本发明采用微孔板式磁颗粒整合了目前两种技术，主要体现在：(1)在微孔板上使用磁颗粒，利用磁颗粒在相同体积的情况下表面积最大的原理，较目前微孔板式化学发光固相物理吸附或用亲和素-生物素桥联方法包被抗体方式会结合更多的抗体，这样就会使反应的灵敏度更高，线性范围更宽。(2)较目前磁颗粒在化学发光的应用上采用单个反应杯或反应槽的形式相比，微孔板的反应模式因为几十或几百个反应微孔在同一块微孔板上，可以进行同时批量测量，适合大批量血清筛查(如96孔微孔板，一次就可以实现96个样本的测试)。

发明内容

本发明的目的是提供一种胰岛素微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒。

根据本发明胰岛素微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒，其中，所述试剂盒包括：

1)胰岛素校准品；

2)胰岛素单克隆抗体包被的磁颗粒；

3)碱性磷酸酶(ALP)标记的另一株单克隆抗体或多克隆抗体；

4)微孔板；

5)洗涤液；

6)上述酶所作用的化学发光底物液。

根据本发明的试剂盒，其中，所述反应微孔板为48孔、96孔、256孔不透明微孔板。

根据本发明的试剂盒，其中，所述化学发光底物液配方为10％的4-甲氧基-4-(3-磷酰氧基苯)-螺旋-(1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-金刚烷)、0.05mol/L PH7.8Tris-HCL、0.02g/L氯化镁。

本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的制备方法。

根据本发明胰岛素微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒的制备方法，具体地，制备方法包括：a)配制校准品；b)制备胰岛素抗体包被磁颗粒；c)以碱性磷酸酶标记胰岛素抗体；d)配制洗涤液；e)配制化学发光底物液。

根据本发明所述配制校准品，其中校准品基质的配方为：

三羟甲基氨基甲烷(Tris)            6.06g

牛血清白蛋白(BSA)                 1.5g

0.1mol/L盐酸(HCL)                 3.45ml

Proclin300                        1ml

甘蓝红                      0.1ml

双蒸水定容                  1000ml

配制校准品基质液后，用此基质液将胰岛素抗原纯品稀释成系列浓度校准品，每个浓度点，每瓶装1ml，冻干保存。其中，所述校准品的胰岛素抗原原料纯度应不低于90％。

根据本发明试剂盒制备方法中胰岛素抗体包被磁颗粒的稀释液配方为：

三羟甲基氨基甲烷(Tris)              6.06g

0.1mol/L盐酸(HCL)                   3.45ml

牛血清白蛋白(BSA)                   10g

明胶                                15g

乙二醇                              50ml

去离子水定容                        1000ml

配制完成后，应混匀，放置30分钟后用肉眼观察无晶体或沉淀析出，应采用电子pH计或中性pH试纸进行检验pH应控制在7.0-8.0之间，最佳pH为7.8。然后分装到适当体积的聚乙烯塑料瓶中。

根据本发明的制备方法，其中，所述制备胰岛素抗体包被磁颗粒，是将磁颗粒通过偶联羧基和/或氨基中的至少一种活性基团后，与胰岛素抗体中的赖氨酸残基中裸露氨基反应共价结合的过程，反应结束后用去离子水冲洗3次，2％BSA封闭，离心去上清液后，用上述磁颗粒稀释液适当体积溶解，备用。

根据本发明提到的磁颗粒如果活化的为羧基基团，则与胰岛素抗体中的赖氨酸残基中裸露氨基反应以共价键结合的过程；

根据本发明提到的磁颗粒如果活化的为氨基基团则通过偶联剂戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺三种中的至少一种氨基基团偶联剂与胰岛素抗体中的赖氨酸残基中裸露氨基反应以共价键结合的过程。

包被磁颗粒的胰岛素单克隆抗体应为鼠源或兔源的。

包被磁颗粒的胰岛素单克隆抗体在使用前应摇匀。

根据本发明以碱性磷酸酶标记胰岛素抗体是采用戊二醛偶联法进行标记。

碱性磷酸酶标记胰岛素单克隆抗体或多克隆抗体应为鼠源、兔源或羊源的。

根据本发明试剂盒制备方法中洗涤液的配方为：

三羟甲基氨基甲烷(Tris)             1.212g

0.1mol/L盐酸(HCL)                  0.69ml

Tween20                            0.1ml

去离子水定容                       1000ml

根据本发明的试剂盒，其中：免疫反应结束后，磁颗粒以及反应复合物是通过在微孔板的底部安装有磁铁和/或电磁场的至少一种磁场，磁颗粒以及反应复合物被吸附到微孔板底部后，再洗涤。

综上，在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量检定，包括包被抗体的活性、磁颗粒的吸附性能和变异大小、ALP的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。对于ALP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法。

本发明公开了基于上述摸索试验得到的各种试剂配方，包括：化学发光底物液配方、校准品的基质配方、洗涤液的配方、胰岛素抗体包被磁颗粒的稀释液配方。进一步，公开了碱性磷酸酶标记胰岛素抗体的制备过程和胰岛素抗体包被磁颗粒的制备过程。

利用本发明方法进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强，更适用于我国临床检测及筛查实验室。

附图说明

图1为实施例4所制备的试剂盒中的校准品线性图(双对数标准曲线)。

图2为实施例9中本发明的试剂盒同国外试剂盒(MONOBIND公司CLIA试剂盒)临床血样测值比对的相关曲线。

具体实施方式

实施例1  胰岛素抗体磁颗粒的制备

根据本发明试剂盒制备方法中胰岛素抗体包被磁颗粒的稀释液配方进行配制：

三羟甲基氨基甲烷(Tris)            6.06g

0.1mol/L盐酸(HCL)                 3.45ml

牛血清白蛋白(BSA)                 10g

明胶                              15g

乙二醇                            50ml

去离子水定容                      1000ml

配制完成后，应混匀，放置30分钟后用肉眼观察无晶体或沉淀析出，应采用电子pH计或中性pH试纸进行检验pH应控制在7.0-8.0之间，最佳pH为7.8。然后分装到适当体积的聚乙烯塑料瓶中。

当粒径为1～2μm磁颗粒表面附有氨基基团时，将此磁颗粒在碱性条件下用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺进行活化，室温搅拌，混匀3小时后，加磁场，静置20～25min，倒出上清，用pH值为7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液将磁颗粒进行悬浮，浓度为50～100g/L；每毫升悬浮液中加入胰岛素单克隆抗体20～50μg，在4℃下搅拌过夜后，反应结束后加电磁场，用去离子水冲洗3次，2％BSA封闭，离心去上清液后，用磁颗粒稀释液适当体积溶解，备用。

实施例2  胰岛素试剂盒中洗涤液的制备

根据本发明试剂盒制备方法中洗涤液的配方进行配制：

三羟甲基氨基甲烷(Tris)           1.212g

0.1mol/L盐酸(HCL)                0.69ml

Tween20                          0.1ml

去离子水定容                     1000ml

配制完成后，应混匀，放置30分钟后用肉眼观察无晶体或沉淀析出，应采用电子pH计或中性pH试纸进行检验pH应控制在7.0-8.0之间，最佳pH为7.8。然后分装洗涤液到适当规格的聚乙烯塑料瓶中。

实施例3胰岛素微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒发光底物液的制备

按照化学发光底物液配方：

三羟甲基氨基甲烷(Tris)         6.06g

0.1mol/L盐酸(HCL)             3.45ml

4-甲氧基-4-(3-磷酰氧基苯)-螺旋-(1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-金刚烷)

                              100ml

氯化镁                        0.02g

双蒸水定容                    1000ml

配制完成后用聚乙烯塑料瓶，每瓶分装10ml。

实施例4  胰岛素校准品的制备

根据本发明校准品的基质液配方

三羟甲基氨基甲烷(Tris)        6.06g

牛血清白蛋白(BSA)             1.5g

0.1mol/L盐酸(HCL)             3.45ml

Proclin300                    1ml

甘蓝红                        0.1ml

双蒸水                        1000ml

配制校准品基质液，用此基质液将胰岛素抗原纯品(>90％)稀释成校准品，浓度分别为1.5μIU/ml、5μIU/ml、15μIU/ml、50μIU/ml、150μIU/ml，另加基质液0μIU/ml，共6瓶，每瓶装1ml，冻干保存。

实施例5胰岛素抗体磁颗粒和碱性磷酸酶标记的胰岛素抗体的浓度选定标准

采用方阵法将胰岛素抗体磁颗粒和碱性磷酸酶标记抗体以不同稀释度进行配比，以最高信噪比大于1500，最低信噪比大于5为基准，优化选择成本最低的配比关系。

采用，将胰岛素抗体磁颗粒以1/1000、1/2000、1/4000、1/8000、1/16000、1/32000、1/64000、1/128000的不同稀释度，与碱性磷酸酶标记抗体1/1000、1/2000、1/4000、1/8000、1/16000、1/32000、1/64000、1/128000的不同稀释度进行方阵法，两组比例交叉配比，发现满足最高信噪比大于1200，最低信噪比大于5的组合中，将胰岛素抗体磁颗粒以1/8000和碱性磷酸酶标记抗体1/32000的配比比例所用成本最低。故选择这个合适的配比比例。

实施例6胰岛素微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成胰岛素微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒，组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。

实施例7本发明的试剂盒的使用方法

一、样品前处理

取人的空腹及口服75g葡萄糖1h、2h、3h晨血清样品，3000rpm离心15min，取上层液50μl进行分析。

二、检测方法

使用本试剂盒进行实验前，需先取出碱性磷酸酶标记的胰岛素抗体、校准品/待测样品、胰岛素抗体磁颗粒、发光底物液和洗涤液，在室温放置15～30分钟，使它们平衡到室温；之后，将恒温温箱或者水浴锅调至37℃；准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪是否正常工作。

使用本试剂盒实验的具体操作步骤如下：

首先，根据试验需求设计好分布图，然后向微孔中加入50μl血清样品或系列校准品溶液，校准品每孔加0μIU/ml、1.5μIU/ml、5μIU/ml、15μIU/ml、50μIU/ml、150μIU/ml各50μl，再加入胰岛素抗体包被的磁颗粒溶液100μl，加入碱性磷酸酶标记胰岛素抗体50μl，37℃振荡反应30min。之后，将微孔板置于带有磁分离器的微孔板洗板机上洗涤5次。将化学发光底物液每孔加入200μl，充分混匀，暗处放置30min，而后在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)。以校准品浓度的Log值为横坐标，RLU的Log值为纵坐标绘出标准曲线(双对数曲线)，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的胰岛素的浓度，见附图1，其中，纵坐标为发光强度，横坐标为胰岛素浓度(单位为μIU/ml)，相关系数r＝0.9996，Log(Y)＝1.0308Log(X)+3.5684。

实施例8本发明的试剂盒的方法学检定

按照本领域中常规的制造及检定规程对通过实施例1～6中制备成的试剂盒进行检定，结果如下：

1)准确性

试剂盒校准品与国家标准品同时测定，两条剂量-反应曲线不显著偏离平行。以国家标准品为对照品，试剂盒校准品的实测值与标示值之比应在0.90-1.10的范围内。

2)剂量-反应曲线的线性

用双对数数学模型拟合，在1.5μIU/ml-150μIU/ml浓度范围内，剂量-反应曲线相关系数(r)的绝对值应不低于0.9900

3)精密性

CV(％)应小于15.0％(n＝10)

4)最低检出量

应不高于0.5μIU/ml

5)质控血清测定值

各质控测值应在质控范围内。

6)特异性

与胰岛素原交叉反应率应小于1.5％

与C肽的交叉反应率应小于0.2％

7)稳定性

将试剂盒37℃放置7天，测定结果应符合上述1)～5)项要求。

实施例9本发明的试剂盒同国外试剂盒临床血样测值比对

用本发明的试剂盒和MONOBIND公司的试剂盒对50份正常人(经过传染病四项HBsAg、HIV、HCV、TP、肝功能、血常规、尿常规、血糖检测正常)血清样品同时进行检测。其检测结果见附图2，以本发明方法测定的血样胰岛素浓度结果为纵坐标，以MONOBIND测定的浓度结果为横坐标作回归分析，相关方程为：Y＝0.9655X+0.8806，相关系数r＝0.9830。经统计学处理结果表明，本发明方法同国外试剂盒临床血样测值相关性良好。

Claims (9)

1、胰岛素微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1)胰岛素校准品；2)胰岛素单克隆抗体包被的磁颗粒；3)碱性磷酸酶(ALP)标记的另一株单克隆抗体或多克隆抗体；4)微孔板；5)洗涤液；6)上述酶所作用的化学发光底物液。

2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述微孔板为48孔、96孔、256孔不透明微孔板。

3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液配方为10％的4-甲氧基-4-(3-磷酰氧基苯)-螺旋-(1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-金刚烷)、0.05mol/L PH7.8 Tris-HCL、0.02g/L氯化镁。

4、胰岛素微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒的制备方法，其特征在于制备方法包括：a)配制校准品；b)制备胰岛素抗体包被磁颗粒；c)以碱性磷酸酶标记胰岛素抗体；d)配制洗涤液；e)配制化学发光底物液。

5、如权利要求4所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述配制校准品的基质配方为：含1.5g/L BSA，0.1％ Proclin 300，0.05mol/L PH7.8 Tris-HCL，0.01％甘蓝红。

6、如权利要求4所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述以胰岛素抗体包被磁颗粒，是将磁颗粒通过偶联羧基和/或氨基中的至少一种活性基团后，与胰岛素抗体中的赖氨酸残基中裸露氨基反应共价结合的过程，反应结束后用去离子水冲洗3次，2％ BSA封闭，离心去上清液后，用磁颗粒稀释液溶解，备用。

7、如权利要求6所述试剂盒的制备方法，其特征在于，所述用磁颗粒稀释液溶解，稀释液配方为：0.05mol/L PH 7.8 Tris-HCL，1.5％明胶、1％ BSA，5％乙二醇。

8、如权利要求4所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述以碱性磷酸酶标记胰岛素抗体采用戊二醛偶联法进行标记。

9、如权利要求4所述的试剂盒制备方法，其特征在于，所述配制洗涤液，配方为：0.01mol/L PH 7.8 Tris-HCL，0.01％ Tween 20。

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