CN106771147B - 一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶a2试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒及其使用方法，该试剂盒包含：标准品和质控品、脂质体复合物、磁性分离试剂、分析缓冲液及清洗液。其中，脂质体复合物的内部包被有三联吡啶钌的N‑羟基琥珀酰亚胺酯，表面通过链霉亲和素‑生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体。磁性分离试剂为以含有氨基末端的磁微粒为载体，通过链霉亲和素‑生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体。与国外Diadexus公司的酶联免疫试剂盒比较，本发明制备的试剂盒大大提高了对脂蛋白相关磷脂酶A2分析的灵敏度和精密度，且操作简便、快速、更易于推广。

Description

一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于医学生物类免疫检测试剂领域，具体涉及一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒及其使用方法。
背景技术
脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)属于磷脂酶A2超家族，主要由成熟的巨噬细胞和T淋巴细胞合成和分泌，受炎症介质的调节。Lp-PLA2主要以与脂蛋白结合的形式存在，它既能通过水解血小板活化因子、氧化磷脂等炎症介质达到抗动脉硬化的作用，同时又具有水解氧化低密度脂蛋白中的氧化磷脂，起到促动脉粥样硬化的作用。它的双重特性，使之成为关注的热点。
近年来越来越多的研究证明，Lp-PLA2是血管内皮炎症的独立危险因子，也是国际公认的一个反映心血管病、冠心病以及缺血性脑卒中疾病的炎性反应标志物，与其他炎性因子比较，Lp-PLA2受其他因素的影响较小，检测具有更高的灵敏度和特异性，可作为预测心血管病、冠心病以及缺血性脑卒中事件的风险指标，用于对患者心血管疾病的早期诊断、疗效观察及预后评价。
因此，检测血浆或血清中Lp-PLA2的生物活性将具有重大的临床意义和市场前景。目前，市面上测定Lp-PLA2的方法主要有：1)分光光度法、2)胶乳增强比浊法、3)放射性免疫法(RIA)、4)酶联免疫法(ELISA)。其中，1)分光光度法主要以PAF硫酯类或其类似物作为底物，Lp-PLA2将底物水解后，释放带有4-硝基苯酚基团的物质，该物质性质不稳定，马上分解成4-硝基苯酚，在405nm处可以测得由该变化引起的吸光度的改变，由此可以测定酶的活性，但该方法检测的灵敏度不高。2)胶乳增强比浊法，Lp-PLA2在磷酸盐缓冲系统中与试剂中结合有抗Lp-PLA2抗体的致敏乳胶颗粒发生抗原抗体反应，在促聚剂聚乙二醇作用下产生凝集以使浊度上升，在546nm波长检测反应液吸光度的变化，其变化程度与样本中的Lp-PLA2含量成正比，但该方法容易受血脂浓度影响产生假阳性，且不适合大批量、自动化检测。3)放射性免疫法，该方法根据竞争机制原理，125I-Lp-PLA2与抗体的结合量与标准品或样品中的Lp-PLA2的含量呈一定函数关系。用免疫分离剂将结合部分与游离部分分离后，测定结合部分的放射性强度，通过数据处理可求出样品中Lp-PLA2的浓度值，但该方法存在放射性污染的安全问题。4)酶联免疫法，此方法应用双抗体夹心法测定全血样本中人Lp-PLA2的水平。用纯化的抗LP-PLA2抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入Lp-PLA2，再与辣根过氧化物酶标记的Lp-PLA2抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物显色。用酶标仪测定吸光度，通过标准曲线计算样品中Lp-PLA2的含量，但该方法重复性较差，精密度较低。
新兴的化学发光免疫法(CLIA)、电化学发光免疫法(ECLI)和时间分辨免疫荧光法(TRFIA)等具有灵敏度高、线性范围宽、分析速度快、操作简便、容易实现自动化的优点，是理想的临床微量生化检验的分析手段。但目前，具有自主知识产权的国产Lp-PLA2检测试剂盒较少，均依靠国外进口，价格昂贵，给患者带来很大经济负担，不利于基层普及。基于此，国内本领域的学者致力于NSE试剂盒的研发，如公开号为CN 103698535 B的中国专利申请“脂蛋白相关磷脂酶A2定量检测试剂盒及制备、操作方法”以免疫磁珠微粒与化学发光酶免疫分析技术相结合，具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。又如公开号为CN 104634970 A的中国专利申请“用于检测脂蛋白相关磷脂酶A2的试剂盒及其制备和应用”以抗体包被磁球和示踪标记物标记抗体结合，用于检测Lp-PLA2，具有高重复性、高准确性和高灵敏度。
电化学发光免疫法(ECLI)检测是在化学发光和电化学基础上发展而来的一种分析方法，其通过在电极上施加一定电压以引发电化学反应，电化学反应释放的能量再激发发光体，当激发态发光体返回基态时便产生光发射，从而可以根据光发射强度来实现对待测物的分析。目前没有基于ECLI技术用于检测Lp-PLA2的试剂盒相关研究。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)试剂盒，采用该试剂盒进行Lp-PLA2检测具有较高的灵敏度和特异性，且操作简单，操作流程短。
本发明另外一个目的在于提供一种所述快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒的使用方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒，其包含：标准品和质控品、脂质体复合物、磁性分离试剂、分析缓冲液及清洗液。
其中，脂质体复合物的内部包被有三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯，表面通过链霉亲和素-生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体。
磁性分离试剂为以含有氨基末端的磁微粒为载体，通过链霉亲和素-生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体。
本发明提供的试剂盒为夹心法电化学发光免疫分析法与磁性微粒分离技术相结合的一种检测方法，基本原理为：利用脂质体将发光物质三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯进行包裹，利用间接法将抗体结合到脂质体的表面，具体为利用生物素与链霉亲和素的相互作用，将表面包被链霉亲和素的脂质体与生物素化的抗体结合，制备脂质体复合物。
此外，利用生物素与链霉亲和素的相互作用，将生物素化的抗体与链霉亲和素包被的磁性微粒进行络和，制备磁性分离试剂；将脂质体复合物、待测物质(抗原)、磁性分离试剂混合，在室温下充分反应，形成磁性微粒-抗原-脂质体复合物的“三明治”结构，具体为(链霉亲和素脂质体-生物素抗体)-抗原-(生物素抗体-链霉亲和素磁性微球)的结构，在外磁场的作用下，磁性微粒-抗原-脂质体复合物吸附于电极表面，加入反应缓冲液，使脂质体复合物释放出三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯，溶出的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯上的酰基与链霉亲和素上的氨基发生偶联反应形成酰胺键，通过链霉亲和素和生物素的相互作用，与抗体结合，开启电压后，发光底物及反应参与物在电极表面失去电子而被氧化。电子供体失去一个H+而成为强还原剂，将发光底物还原为激发态，随即释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光子而常保持底物浓度的恒定。
根据本发明的具体实施方案，本发明的快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒中，所述的脂质体复合物的制备包括以下步骤：
(1)取磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰甘油、生物素化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，混合，溶于5mL的氯仿中，超声处理5min，然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去氯仿，静置30min，然后加入1mL三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液，在60℃水浴中振荡反应约1h，得脂质体悬浮液，将脂质体悬浮液超声处理3min，然后使用注射器式滤器调整脂质体的粒径至90～100nm，得到内部包裹有三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯的脂质体；
(2)取50μL浓度为1x10-10mol/L的链霉亲和素与500μL步骤(1)制得的脂质体，混合，在室温下孵育1h，制得表面包被有链霉亲和素的脂质体；
(3)往步骤(2)制得的脂质体中加入生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，所述抗体在体系中的终浓度为10μg/mL，孵育12h，加入2％(w/v)BSA，继续孵育12h，以阻断脂质体表面上的非特异性位点，将得到的脂质体复合物置于4℃保存，即得脂质体复合物。
其中，上述的步骤(1)中磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰甘油、生物素化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的摩尔比为10:8:2:0.6。
上述的步骤(3)中生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的制备包括以下步骤：取抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体溶于pH为7.2的PBS缓冲液中，制成浓度为1.0～2.0mg/mL的溶液；另取EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin溶于pH为7.2的PBS缓冲液中，制成浓度为10～20mM的溶液；然后取1mL浓度为1.0～2.0mg/mL的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体溶液与25μL的浓度为10～20mM的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin溶液混合，置于室温中反应1～2h，再使用PD-10的凝胶过滤器进行过滤，即得生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体。
上述的步骤(1)中三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液的制备为：取N-羟基琥珀酰亚胺酯，溶于二甲基甲酰胺中，制成质量浓度为3％的溶液。
本发明通过大量的试验发现，使用三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯作为发光物质，较常规使用的发光物质Ru(bpy)32+，可产生较强的ECL，提高检测灵敏度，通过使用脂质体将其包裹在内，使得体系的稳定性好，改善检测的重复性。
本发明所述的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯可通过本领域常用的技术手段进行制备，以二氯二联吡啶(Ru(bpy)2Cl2)、NaHCO3、2,2’-联吡啶-4,4’-二羧酸(dcbpy)为原料进行回流加热反应，将生成的沉淀与六氟磷酸钠(NaPF6)反应，得到Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2，在二环乙基碳二亚胺(DCC)的催化作用下，将Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行反应，得到Ru(bpy)2(dcbpy)NHS。具体的细节请参考Wilson,R等人在“Comparison between acridan ester,luminol,and ruthenium chelateelectrochemiluminescence”(Electroanalysis.2001,13,1083-1092.和Cui,H等人在“Electrochemiluminescence of luminol in alkaline solution at a paraffin-impregnated graphite electrode”(AnalytiealChemistry.2003,75,324-331)披露的相关内容。
根据本发明的具体实施方案，本发明的快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒中，所述的磁性分离试剂的制备包括以下步骤：
取1mL生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体与200μg的链霉亲和素包被的磁微粒混合，在室温条件下，100r/min反应1～2h，反应结束后，磁性分离，去上清，加入pH为7.4的Tris-HCl缓冲液反复洗涤多次，然后加入1mL浓度为0.2～0.4mM的D-生物素水溶液，室温下反应30min，以充分阻断未与生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体结合的链霉亲和素位点，反应结束后，磁性分离，去上清，用pH为7.4的Tris-HCl缓冲液反复洗涤多次以除去多余的D-生物素，加入含2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐温-20、pH为7.2的PBS溶液复溶，即得磁性分离试剂。
其中，所述的链霉亲和素包被的磁微粒的制备包括以下步骤：
(1)取1mg氨基末端磁性微粒，加入400μL甲醇反复清洗，磁性分离，弃上清，加入400μL的交联剂溶液，置于恒温振荡器，反应10h，然后依次用甲醇和超纯水将反应后的磁性微粒反复清洗多次，保存于水中备用；
(2)将步骤(1)制得的磁性微粒用500μL PBS缓冲溶液平衡30～60min，加入200μg链霉亲和素，置于恒温振荡器中反应1～2h，磁性分离去上清，用含1mmol/L EDTA的PBS缓冲溶液反复清洗，制得链霉亲和素包被的磁性微粒；
进一步地，上述步骤(1)中的交联剂溶液的制备包括以下步骤：取50mg的碳化二亚胺和50mg的N-羟基琥珀酰亚胺混合，加入100ml的PBS缓冲溶液溶解，即得。
根据本发明的具体实施方案，本发明的快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒中，所述的标准品的制备包括以下步骤：
使用含0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐温-20的溶液将脂蛋白相关磷脂酶A2抗原配制成浓度分别为0，50，100，250，500，1000ng/ml的标准液，即得。
所述的质控品的制备包括以下步骤：使用含0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐温-20的溶液将脂蛋白相关磷脂酶A2抗原配制成浓度分别为300，700ng/ml的溶液液，即得。
根据本发明的具体实施方案，本发明的快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒中，所述的分析缓冲液的组成为：0.1mol/L三丙胺、0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、0.1％(v/v)吐温-20、1％(v/v)Triton X-100，pH为7.0～7.2。
所述的清洗液为含0.1％(v/v)吐温-20、0.1mol/L氯化钠，且浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液。
上述的反应缓冲液中磷酸二氢钾主要起缓冲作用，维持反应体系的pH值，添加吐温-20和Triton X-100可增强发光作用，提高发光效率，减少三丙胺的用量，提高试剂盒的使用安全性。
此外，本发明还提供了一种所述的脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用含2％(w/v)BSA的PBS缓冲液将脂质体复合物按1:5的比例进行稀释；
(2)取25μL稀释后的脂质体复合物、25μL磁性分离试剂、50μL待测样本或脂蛋白相关磷脂酶A2标准品，混合，在室温条件下涡旋1h，充分反应，形成磁性微粒-抗原-脂质体复合物，将反应液吸入电化学反应池中，所述的磁性微粒-抗原-脂质体复合物通过磁性吸附于电极表面，加入100μL清洗液轻轻润洗电极表面3次，去清洗液，然后加入500μL反应缓冲液，使脂质体内的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶出，溶出的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯上的酰基与链霉亲和素上的氨基发生偶联反应，通过链霉亲和素和生物素的相互作用，与抗体结合，电化学工作站通电，启动ECL反应，通过光电倍增管收集电化学发光信号；
(3)测定梯度浓度的脂蛋白相关磷脂酶A2标准液的发光强度变化值，根据发光强度变化值对数与相应的浓度对数绘制反应曲线，计算待测标本中脂蛋白相关磷脂酶A2的浓度。
本发明试剂盒中提及的各种缓冲溶液，除另有注明外，均为市售产品，未提及的试剂盒的外包装以及各试剂组分的独立包装容器等均可以按照所属领域的常规操作进行，符合相关行业规定即可。本发明的方法中未详细提及的操作步骤也可参照所属领域的常规操作进行，所用检测仪器设备，如电化学分析仪的使用按说明书操作进行。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)本发明采用间接标记法，即利用链霉亲和素-生物素的相互作用将脂质体与抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体连接，利用链霉亲和素-生物素的相互作用，将磁性微粒与抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体连接，形成磁性微粒-抗原(待测物)-脂质体复合物的“三明治”结构，有利于减弱空间效应和信号的放大，大大提高了检测的特异性和灵敏度，降低变异系数，与干扰物质交叉反应小，具有较宽的检测线性范围，检测结果可靠。
(2)与美国Diadexus公司的酶联免疫试剂盒检测结果比较，采用本发明提供的试剂盒对脂蛋白相关磷脂酶A2进行检测，两者测定值接近，相关系数为0.975，达到国外进口的水平，且操作简单，耗时少，大大提高检测的效率，适合大规模推广和应用。
(3)本发明以三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯作为发光物质，较常规使用的联吡啶钌Ru(bpy)3 2+，可产生较强的ECL，显著增强发光强度，提高检测灵敏度，并将形成的复合物包裹于脂质体内部，显著提高检测的稳定性，并且在检测过程中，所述的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶出后，可通过酰基与链霉亲和素上的氨基发生偶联反应形成酰胺键，与体系中的抗体结合，进行反应，进一步提高检测的灵敏度。
(4)本发明提供的试剂盒中各试剂稳定性好，储存时间较长，且毒性低，对操作人员的健康影响小。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。
实施例1本发明检测试剂盒的组成与制备
本发明所述的试剂盒包括以下组分：
试剂a：标准品和质控品
试剂b：脂质体复合物
试剂c：磁性分离试剂
试剂d：分析缓冲液
试剂e：清洗液
本发明试剂盒中各试剂的制备包括以下步骤：
(1)脂蛋白相关磷脂酶A2标准品和质控品的制备
原料 厂家
磷酸二氢钾 深圳卓越生物科技有限公司
氯化钠 深圳卓越生物科技有限公司
BSA Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司
吐温-20 上海麦克林生化科技有限公司
脂蛋白相关磷脂酶A2抗原 Abnova公司
①使用含0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐温-20的溶液将脂蛋白相关磷脂酶A2抗原配制成浓度分别为0，50，100，250，500，1000ng/ml的标准液，即得；
②所述的质控品的制备包括以下步骤：使用含0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐温-20的溶液将脂蛋白相关磷脂酶A2抗原配制成浓度分别为300，700ng/ml的溶液液，即得。
(2)脂质体复合物的制备
本发明的脂质体复合物的内部包被有三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯，表面通过链霉亲和素-生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，其制备包括以下步骤：
①生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的制备：取抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体溶于pH为7.2的PBS缓冲液中，制成浓度为1.0mg/mL的溶液；另取EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin溶于pH为7.2的PBS缓冲液中，制成浓度为10mM的溶液；然后取1mL浓度为1.0mg/mL的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体溶液与25μL的浓度为10mM的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin溶液混合，置于室温中反应1.5h，再使用PD-10的凝胶过滤器进行过滤，即得生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体。
②按摩尔比为10:8:2:0.6分别称取磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰甘油、生物素化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)，混合，溶于5mL的氯仿中，超声处理5min，然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去氯仿，静置30min，然后加入1mL三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液，在60℃水浴中振荡反应约1h，得脂质体悬浮液，将脂质体悬浮液超声处理3min，然后使用注射器式滤器调整脂质体的粒径至100nm，得到内部包裹有三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯的脂质体，其中，三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液的制备为：取N-羟基琥珀酰亚胺酯，溶于二甲基甲酰胺中，制成质量浓度为3％的溶液。
③取50μL浓度为1x10-10mol/L的链霉亲和素与500μL步骤②制得的脂质体，混合，在室温下孵育1h，制得表面包被有链霉亲和素的脂质体。
④往步骤③制得的脂质体中加入步骤①制得的生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，所述抗体在体系中的终浓度为10μg/mL，孵育12h，加入2％(w/v)BSA，继续孵育12h，以阻断脂质体表面上的非特异性位点，将得到的脂质体复合物置于4℃保存，即得脂质体复合物。
(3)磁性分离试剂的制备
本发明的磁性分离试剂为以含有氨基末端的磁微粒为载体，通过链霉亲和素-生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，其制备包括以下步骤：
1)生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的制备同(2)脂质体复合物的制备过程中生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的制备。
2)链霉亲和素包被的磁微粒的制备：
①取1mg氨基末端磁性微粒，加入400μL甲醇反复清洗，磁性分离，弃上清，加入400μL的交联剂溶液，置于恒温振荡器，反应10h，然后依次用甲醇和超纯水将反应后的磁性微粒反复清洗多次，保存于水中备用，其中，交联剂溶液的制备为：取50mg的碳化二亚胺和50mg的N-羟基琥珀酰亚胺混合，加入100ml的PBS缓冲溶液溶解，即得。
②将步骤①制得的磁性微粒用500μL PBS缓冲溶液平衡60min，加入200μg链霉亲和素，置于恒温振荡器中反应2h，磁性分离去上清，用含1mmol/L EDTA的PBS缓冲溶液反复清洗，制得链霉亲和素包被的磁性微粒。
3)取1mL生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体与200μg的链霉亲和素包被的磁微粒混合，在室温条件下，100r/min反应2h，反应结束后，磁性分离，去上清，加入pH为7.4的Tris-HCl缓冲液反复洗涤多次，然后加入1mL浓度为0.2mM的D-生物素水溶液，室温下反应30min，以充分阻断未与生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体结合的链霉亲和素位点，反应结束后，磁性分离，去上清，用pH为7.4的Tris-HCl缓冲液反复洗涤多次以除去多余的D-生物素，加入含2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐温-20、pH为7.2的PBS溶液复溶，即得磁性分离试剂。
(4)分析缓冲液的制备
原料 厂家
三丙胺 Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司
Triton X-100 Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司
其他试剂的来源见上表。
本发明的分析缓冲液组成为：0.1mol/L三丙胺、0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、0.1％(v/v)吐温-20、1％(v/v)Triton X-100，pH为7.0～7.2，制备方法：以配制100ml反应缓冲液为例：
取1.43g三丙胺、1.36g磷酸二氢钾、0.58g氯化钠溶于100ml水中，加入0.1ml吐温-20、1ml Triton X-100，搅拌均匀，调节pH为7.2，即得反应缓冲液。
(5)清洗液的制备
原料 厂家
磷酸二氢钠 深圳卓越生物科技有限公司
磷酸氢二钠 深圳卓越生物科技有限公司
其他试剂的来源见上表。
本发明的清洗液为含0.1％(v/v)吐温-20、0.1mol/L氯化钠，且浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液。
制备方法：以配制100ml清洗液为例：
①取0.599g磷酸二氢钠溶于100ml水中，制成浓度为0.05mol/L的磷酸二氢钠溶液，另取0.710g磷酸氢二钠溶于100ml水中，制成浓度为0.05mol/L的磷酸氢二钠溶液，分别取0.05mol/L的磷酸二氢钠溶液28ml，0.05mol/L的磷酸氢二钠溶液72ml，混合，制得浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液。
②取0.58g氯化钠、0.1ml吐温-20，加入100ml浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液，搅拌均匀即得。
实施例2采用本发明检测试剂盒进行Lp-PLA2检测
(1)待测样本的准备：样本的采集参照常规操作，具体为将采集的静脉血加入至试管或肝素抗凝管中，离心，取上清部分进行实验。
(2)使用含2％(w/v)BSA的PBS缓冲液将脂质体复合物按1:5的比例进行稀释。
(3)取25μL稀释后的脂质体复合物、25μL磁性分离试剂、50μL待测样本或脂蛋白相关磷脂酶A2标准品，混合，在室温条件下涡旋1h，充分反应，形成磁性微粒-抗原-脂质体复合物，将反应液吸入电化学反应池中，所述的磁性微粒-抗原-脂质体复合物通过磁性吸附于电极表面，加入100μL清洗液轻轻润洗电极表面3次，去清洗液，然后加入500μL反应缓冲液，使脂质体内的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶出，溶出的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯上的酰基与链霉亲和素上的氨基发生偶联反应，通过链霉亲和素和生物素的相互作用，与抗体结合，电化学工作站通电，启动ECL反应，通过光电倍增管收集电化学发光信号。
(4)测定梯度浓度的脂蛋白相关磷脂酶A2标准液的发光强度变化值，根据发光强度变化值对数与相应的浓度对数绘制反应曲线，计算待测标本中脂蛋白相关磷脂酶A2的浓度。
对比例1检测试剂盒的组成与制备
对比例1检测试剂盒的组成和制备与实施例1检测试剂盒的组成和制备基本相同，区别在于，所述的脂质体复合物为内部包裹有联吡啶钌Ru(bpy)3 2+而不是三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯，表面通过链霉亲和素-生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体。
实施例3本发明检测试剂盒的方法学检定
按照本领域中常规的制造和检定规程对实施例中制备成的检测试剂盒进行检定，结果如下：
①分析灵敏度
重复测定零校准品(或样本稀释液)不少于10次，计算出反应量的均值(x)和标准差(s)，将(x+2s)的反应量代入剂量-反应曲线，计算出相应浓度值，即为最低检出限，所得自制试剂盒的最低检出限为0.01ng/ml。
②线性关系
以自制试剂盒中参考标准品浓度的对数为横坐标，信号值计数的对数为纵坐标，由双对数数学模型Log-Log函数处理，测得NSE试剂盒剂量-反应曲线线性相关系数为r＝0.9992，表明自制试剂盒在浓度为0.01-1000ng/ml的范围内具有良好的剂量反应线性关系。
③精密度
以自制试剂盒中3个不同浓度的参考标准品进行测定(高、中、低浓度分别为50ng/ml、250ng/ml、1000ng/ml)，各设10个复孔。分别对同一批次和不同批次的自制试剂盒中3个不同浓度的参考标准品进行重复测定10次。结果自制试剂盒的批内变异系数(CV％)为1.0～2.8％，批间变异系数(CV％)为2.2～3.7％，符合试剂盒检定规程要求，精密度良好。
④特异性
以磷脂酶C(PLC)500ng/ml和神经元特异性烯醇化酶(NSE)600ng/ml作为待测样品，用自制的NSE试剂盒测定，检测结果分别为0.12ng/ml、0.09ng/ml，无明显的交叉反应，表明自制的试剂盒对检测Lp-PLA2特异性高。
⑤稳定性
将自制的检测试剂盒置于37℃分别热处理0天、3天、5天和7天，在不同的处理时间之后分别测定Lp-PLA2校准品，各时间点的试剂盒信号值变化不大，线性关系良好，表明本发明检测试剂盒具有良好的热稳定性。
⑥准确度
对Lp-PLA2浓度为300ng/ml和700ng/ml的质控品溶液进行检测，每个做4个平行，分别计算回收率，回收率＝实测值/添加值╳100％，回收率均在101.01±1.05％。
实施例4本发明检测试剂盒与美国Diadexus公司的酶联免疫试剂盒测定结果比较
分别采用本发明自制的试剂盒和美国Diadexus公司的酶联免疫试剂盒同时对心血管病人血清样本60份进行检测。其中，动脉粥样硬化患者35例、冠心病25例。本发明自制试剂盒按照实施例2的方法进行操作，Diadexus公司的酶联免疫试剂盒按照说明书进行操作，分别检测血清中的Lp-PLA2的分析灵敏度、精密度、稳定性和线性范围的结果，与国外Diadexus公司的酶联免疫试剂盒比较，本发明自制试剂盒检测的灵敏度大大增加，降低变异系数，结果见下表。并以自制试剂盒测定的结果为横坐标，Diadexus公司的酶联免疫试剂盒测定的结果为纵坐标做回归分析，相关方程为：Y＝1.237X+0.625，相关系数r＝0.975。结果表明两种方法具有同样的使用价值，但本发明制备的试剂盒大大提高了对Lp-PLA2分析的灵敏度和精密度，且操作简便、快速、更易于推广。
实施例5对比例1试剂盒和本发明实施例1制得的试剂盒对Lp-PLA2进行检测的结果比较
对比例1试剂盒的使用方法参考实施例2具体的步骤。
分别采用对比例1试剂盒和实施例1试剂盒同时对冠心病患者血清样本40份(Lp-PLA2阳性率为100％)进行检测，结果见下表。
结果表明，对比例1制得的试剂盒对血清中Lp-PLA2检测的灵敏度降低，检测的线性范围缩窄，批内和批间精密度降低，使用三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯作为发光物质，较常规使用的发光物质Ru(bpy)32+，可产生较强的ECL，可显著提高检测灵敏度和检测精密度，使检测具有较宽的线性范围。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种快速检测脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒的使用方法，该试剂盒包含：标准品和质控品、脂质体复合物、磁性分离试剂、分析缓冲液及清洗液；
所述的脂质体复合物的内部包被有三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯，表面通过链霉亲和素-生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体；
所述的磁性分离试剂为以含有氨基末端的磁微粒为载体，通过链霉亲和素-生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体；
所述的脂质体复合物的制备包括以下步骤：
（1）取磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰甘油、生物素化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，混合，溶于5mL的氯仿中，超声处理5min，然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去氯仿，静置30min，然后加入1mL 三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液，在60℃水浴中振荡反应1h，得脂质体悬浮液，将脂质体悬浮液超声处理3 min，然后使用注射器式滤器调整脂质体的粒径至90~100nm，得到内部包裹有三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯的脂质体，其中，磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰甘油、生物素化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的摩尔比为10:8:2:0.6；三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液为溶于二甲基甲酰胺中质量浓度为3%的溶液；
（2）取50μL浓度为1x10-10 mol/L的链霉亲和素与500μL步骤（1）制得的脂质体，混合，在室温下孵育1h，制得表面包被有链霉亲和素的脂质体；
（3）往步骤（2）制得的脂质体中加入生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，所述抗体在体系中的终浓度为10μg/mL，孵育12 h，加入2%(w/v)BSA，继续孵育12 h，以阻断脂质体表面上的非特异性位点，将得到的脂质体复合物置于4℃保存，即得脂质体复合物；
所述的步骤（3）中生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的制备包括以下步骤：取抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体溶于pH为7.2的PBS缓冲液中，制成浓度为1.0~2.0mg/mL的溶液；另取EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin溶于pH为7.2的PBS 缓冲液中，制成浓度为10~20mM的溶液；然后取1mL浓度为1.0~2.0mg/mL 的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体溶液与25μL的浓度为10~20mM的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin溶液混合，置于室温中反应1~2h，再使用PD-10的凝胶过滤器进行过滤，即得生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体；
所述的磁性分离试剂的制备包括以下步骤：
取1mL生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体与200µg的链霉亲和素包被的磁微粒混合，在室温条件下，100r/min 反应1~2h，反应结束后，磁性分离，去上清，加入pH为7.4的Tris-HCl缓冲液反复洗涤多次，然后加入1mL浓度为0.2~0.4mM的D-生物素水溶液，室温下反应30min，以充分阻断未与生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体结合的链霉亲和素位点，反应结束后，磁性分离，去上清，用pH为7.4的Tris-HCl缓冲液反复洗涤多次以除去多余的D-生物素，加入含2% (w/v) BSA、0.1% (v/v) 吐温-20、pH为7.2的 PBS溶液复溶，即得磁性分离试剂；
所述的链霉亲和素包被的磁微粒的制备包括以下步骤：
（1）取1mg氨基末端磁性微粒，加入400μL甲醇反复清洗，磁性分离，弃上清，加入400μL的交联剂溶液，置于恒温振荡器，反应10h，然后依次用甲醇和超纯水将反应后的磁性微粒反复清洗多次，保存于水中备用；其中，交联剂溶液的制备包括以下步骤：取50mg的碳化二亚胺和50mg的N-羟基琥珀酰亚胺混合，加入100ml的PBS缓冲溶液溶解，即得；
（2）将步骤（1）制得的磁性微粒用500μL PBS缓冲溶液平衡30~60min，加入200 µg 链霉亲和素，置于恒温振荡器中反应1~2h，磁性分离去上清，用含1mmol/L EDTA的PBS缓冲溶液反复清洗，制得链霉亲和素包被的磁性微粒；
所述的标准品的制备包括以下步骤：
使用含0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、2% (w/v) BSA、0.1% (v/v) 吐温-20的溶液将脂蛋白相关磷脂酶A2抗原配制成浓度分别为 0，50，100，250，500，1000ng/ml 的标准液，即得；
所述的质控品的制备包括以下步骤：使用含0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、2%(w/v) BSA、0.1% (v/v) 吐温-20的溶液将脂蛋白相关磷脂酶A2抗原配制成浓度分别为300，700ng/ml 的溶液，即得；
所述的分析缓冲液的组成为：0.1mol/L三丙胺、0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、0.1% (v/v) 吐温-20、1% (v/v) Triton X-100，pH为7.0~7.2；
所述的清洗液为含0.1% (v/v) 吐温-20、0.1mol/L氯化钠，且浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液；
所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
（1）使用含2%(w/v) BSA的PBS缓冲液将脂质体复合物按1:5的比例进行稀释；
（2）取25μL稀释后的脂质体复合物、25μL磁性分离试剂、50μL待测样本或脂蛋白相关磷脂酶A2标准品，混合，在室温条件下涡旋1h，充分反应，形成磁性微粒-抗原-脂质体复合物，将反应液吸入电化学反应池中，所述的磁性微粒-抗原-脂质体复合物通过磁性吸附于电极表面，加入100μL清洗液轻轻润洗电极表面3次，去清洗液，然后加入500μL反应缓冲液，使脂质体内的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶出，溶出的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯上的酰基与链霉亲和素上的氨基发生偶联反应，通过链霉亲和素和生物素的相互作用，与抗体结合，电化学工作站通电，启动ECL反应，通过光电倍增管收集电化学发光信号；
（3）测定梯度浓度的脂蛋白相关磷脂酶A2标准液的发光强度变化值，根据发光强度变化值对数与相应的浓度对数绘制反应曲线，计算待测样本中脂蛋白相关磷脂酶A2的浓度。
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