CN107643285A - 一种基于磁微粒的微流控化学发光检测系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于磁微粒的微流控化学发光检测系统，包括底盘和上层芯片；所述上层芯片包括位于上层芯片中心的加样区和至少一个与所述加样区连通的微流控反应检测通道；所述微流控反应检测通道为竞争法微流控反应检测通道或夹心法微流控反应检测通道；应用时，所述底盘设置于上层芯片的下方，所述底盘对应各微流控反应检测通道的磁微粒包被区的位置设有磁铁，所述磁铁为永磁铁或电磁铁。

Description

一种基于磁微粒的微流控化学发光检测系统及其应用

技术领域

本发明属于医学检验领域，尤其涉及一种基于磁微粒的微流控化学发光检测系统。

背景技术

近年来，生物分析技术领域得到了快速的发展，出现了很多重要的研究方向。微流控芯片分析技术是其中最活跃的一支，在科研和应用领域都获得了广泛的重视。微流控芯片作为一种新型的分析检测平台，具有高通量、集成化、便携式、易操作、低成本等优点，已经在众多领域中得到了广泛的应用。

目前的化学发光检测适应的样品为血清，在检测的过程中需要对样本进行离心分离来获得血清，过程复杂繁琐并且耗时。缺乏充分洗脱、以消除非特异性吸附造成的干扰。

目前用于生化分析的磁微粒具有以下特点：1) 超强的顺磁性，就是指在磁场的存在下能迅速聚集，离开磁场能够均匀分散，不出现聚集显现现象；2) 合适的粒径且粒径分布范围窄，使微球有足够强的磁响应性，又不会因粒径太大而发生沉降；3) 具有丰富的表面活性基团，以便微球可以和生化物质偶联，并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于磁微粒的微流控化学发光检测系统，其包括底盘和上层芯片；

所述上层芯片包括位于上层芯片中心的加样区和至少一个与所述加样区连通的微流控反应检测通道；

所述微流控反应检测通道为竞争法微流控反应检测通道或夹心法微流控反应检测通道；

其中，所述竞争法微流控反应检测通道包括：样本分离区，其与加样区连通；抗原包被区，其通过毛细管微通道与所述样本分离区连通；抗体包被区，其通过毛细管微通道与所述抗原包被区连通；磁微粒包被区，其通过毛细管微通道与所述抗体包被区连通；废液收集区，其通过毛细管微通道与所述磁微粒包被区连通；所述抗原包被区包被有发光物质标记的待测物质抗体包被区包被有具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的所述待测物质的抗体；

所述夹心法微流控反应检测通道包括：样本分离区，其与加样区连通；第一抗体包被区，其通过毛细管微通道与所述样本分离区连通；第二抗体包被区，其通过毛细管微通道与所述第一抗体包被区连通；磁微粒包被区，其通过毛细管微通道与所述第二抗体包被区连通；废液收集区，其通过毛细管微通道与所述磁微粒包被区连通；所述第一抗体包被区包被有发光物质标记的待测物质的一株抗体，第二抗体包被区包被的是具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测物质的另一株抗体；

应用时，所述底盘设置于上层芯片的下方，所述底盘对应各微流控反应检测通道的磁微粒包被区的位置设有磁铁，所述磁铁为永磁铁或电磁铁。

在本发明的优选实施方案中，所述加样区通过加样通道与所述样本分离区连通；所述加样通道为围绕加样区形成的环形通道，加样通道的一端与所述加样区连通，加样通道的侧壁连通所述样本分离区。

在本发明的优选实施方案中，所述发光物质为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或吖啶酯；所述具有特异亲和性的一对物质为生物素和链霉亲和素，生物素和亲和素，或者为荧光素和抗荧光素。

在本发明的优选实施方案中，磁微粒的平均粒径在0.5~2μm。

在本发明的优选实施方案中，所述微流控反应检测通道为多个，其中，部分微流控反应检测通道为竞争法微流控反应检测通道，部分微流控反应检测通道为夹心法微流控反应检测通道；或者多个所述微流控反应检测通道均为竞争法微流控反应检测通道；或者多个所述微流控反应检测通道均为夹心法微流控反应检测通道。

在本发明一优选实施方案中，竞争法微流控反应检测通道中：抗原包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径小于出口直径；抗体包被区与抗原包被区之间的毛细管微通道的入口直径小于出口直径；磁微粒包被区与抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径小于出口直径；废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径小于出口直径；抗原包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径、抗体包被区与抗原包被区之间的毛细管微通道的入口直径、磁微粒包被区与抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径和废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径依次缩小；

夹心法微流控反应检测通道中：第一抗体包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径小于出口直径；第二抗体包被区与第一抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径小于出口直径；磁微粒包被区与第二抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径小于出口直径；废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径小于出口直径；第一抗体包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径、第二抗体包被区与第一抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径、磁微粒包被区与第二抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径和废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径依次缩小。

在本发明另一优选实施方案中，竞争法微流控反应检测通道中：抗原包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；抗体包被区与抗原包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；磁微粒包被区与抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；抗原包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的出口直径、抗体包被区与抗原包被区之间的毛细管微通道的出口直径、磁微粒包被区与抗体包被区之间的毛细管微通道的出口直径和废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的出口直径依次缩小；

夹心法微流控反应检测通道中：第一抗体包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；第二抗体包被区与第一抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；磁微粒包被区与第二抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；第一抗体包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的出口直径、第二抗体包被区与第一抗体包被区之间的毛细管微通道的出口直径、磁微粒包被区与第二抗体包被区之间的毛细管微通道的出口直径和废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的出口直径依次缩小。

优选地，所述上层芯片与所述底盘为形状相同的圆形，所述加样区位于上层芯片的圆心，所述微流控反应检测通道沿所述上层芯片的半径方向形成；底盘的中心设有通孔；所述底盘上的磁铁为圆环形，对应位于磁微粒包被区的下方。

本发明还提供上述的基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的制备方法，包括如下步骤：

1）在芯片基板上开设所述加样区和所述微流控反应检测通道；

2）将发光物质标记的待测抗原溶液覆于所述竞争法微流控反应检测通道的抗原包被区，将具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的抗待测抗原抗体溶液覆于所述竞争法微流控反应检测通道的抗体包被区；将发光物质标记的待测抗原的一株抗体溶液覆于所述夹心法微流控反应检测通道的第一抗体包被区，将具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测抗原的另一株抗体溶液覆于所述夹心法微流控反应检测通道的第二抗体包被区；

3）将表面标记有具有特异亲和性的一对物质中的另一个的磁微粒的溶液覆于磁微粒包被区，干燥；

4）底盘对应所述磁微粒包被区的位置设置磁铁。

本发明还提供上述的基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的应用方法，包括如下步骤：

1）上层芯片固定在检测仪器的自转轴上部；当底盘上的磁铁为永磁铁时，将底盘套设在自转轴的下部远离上层芯片底面；当底盘上的磁铁为电磁铁时，底盘贴附在上层芯片底面，电磁铁对应位于上层芯片的磁微粒包被区下方，电磁铁不通电；从加样区加入全血样本，启动仪器，自转轴自转，在离心力的作用下，全血经设置在加样区的抗红细胞滤血膜过滤，进入各微流控反应检测通道的样本分离区；

2）待全血样本流动稳定后，通过增加自转轴自转转速以加大离心作用使样本分离区的血样样本冲破毛细管微通道的毛细管微阀作用而流向各微流控通道的抗原包被区或第一抗体包被区：

在竞争法微流控反应检测通道中，在抗原包被区，血样样本中的待测抗原不与发光物质标记的待测抗原反应；在夹心法微流控反应检测通道中，在第一抗体包被区，血液样本中的待测抗原与发光物质标记的待测抗原的一株抗体发生反应形成一抗免疫复合物；

3)随后加大离心力使抗原或一抗免疫复合物进入各微流控通道的抗体包被区或第二抗体包被区：

在竞争法微流控反应检测通道中，在抗体包被区，血样样本中的待测抗原与发光物质标记的待测抗原构成竞争关系，分别与具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的抗待测抗原的抗体发生反应形成免疫复合物；

在夹心法微流控反应检测通道中，在第二抗体包被区，一抗免疫复合物与具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测抗原的另一株抗体反应，形成二抗免疫复合物；

4）通过再次加大离心力使各微流控反应检测通道中的免疫复合物或二抗免疫复合物冲破毛细管微通道的毛细管微阀作用进入到磁微粒包被区，标记在磁微粒表面的具有特异亲和性的一对物质中的另一个与免疫复合物或二抗免疫复合物中的具有特异亲和性的一对物质中的一个快速发生反应形成结合磁微粒的免疫复合物，然后，将带永磁铁的底盘向上移动至贴合上层芯片的底面，永磁铁对应位于上层芯片的磁微粒包被区下方；或者对带电磁铁的底盘的电磁铁通电使其富有磁性；由于磁铁的磁吸力，结合磁微粒的免疫复合物或二抗免疫复合物在磁场的作用下富集到磁微粒包被区的底端，然后通过再次加大离心力使未参加反应的样本经毛细管微通道流向废液收集区；

5）从加样区加入清洗液洗涤结合磁微粒的免疫复合物或二抗免疫复合物，清洗液移动到磁微粒包被区时，将带永磁铁的底盘向下移动远离上层芯片，或者断开通电装置使电磁铁失去磁性，超声振荡，结合磁微粒的免疫复合物或二抗免疫复合物得到充分洗涤，然后将带永磁铁的底盘向上层芯片处运动，或者对带电磁铁的底盘的电磁铁通电使其富有磁性，将结合磁微粒的免疫复合物或二抗免疫复合物富集到磁微粒包被区的底端，通过加大离心力使清洗液流入废液收集区；

6）从加样区加入发光基底液，通过离心将发光基底液转移至磁微粒包被区，将带磁铁的底盘向下移动远离上层芯片，或者断开通电装置使电磁铁失去磁性，超声振荡后，仪器检测系统检测发光信号的强度，从而实现待测物的定量检测。

本发明能够达到如下效果：

1、本发明将微流控技术和磁微粒化学发光技术巧妙地结合，实现目标物质的快速、高度灵敏、准确定量检测。

2、采用磁微粒免疫富集分离反应，简化了分离过程，提高样品检测的灵敏度。磁微粒的分离效应，有效捕捉待测样本中低浓度待测样品，结合化学发光检测方式，使灵敏度大幅度提高。

3、本发明的基于磁微粒的微流控化学发光检测系统可同时进行多项检测，节约时间、提高效率。

4、本发明的基于磁微粒的微流控化学发光检测系统可以用于全血检测，克服了传统化学发光只能进行血清检测的，而不能进行全血检测的缺陷，简化操作过程。

5、在反应和洗涤的过程中采用超声振荡的方式，有效地提高了反应速度以及消除非特异性吸附造成的干扰。

附图说明

图1A为基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的微流控化学发光检测系统的上层芯片结构示意图一。

图1B为基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的上层芯片结构示意图二。

图2为基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的底盘部分结构示意图。

图3A是竞争法微流控反应检测通道的截面结构示意图；图3B是夹心法微流控反应检测通道的截面结构示意图。

图4A 是基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的竞争法微流控反应检测通道的应用方法的步骤1的过程示意图;图4B是基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的夹心法微流控反应检测通道的应用方法的步骤1的过程示意图。

图5A是基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的竞争法微流控反应检测通道的应用方法的步骤2的过程示意图; 图5B是基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的竞争法微流控反应检测通道的应用方法的步骤3的过程示意图。

图6A是基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的夹心法微流控反应检测通道的应用方法的步骤2的过程示意图; 图6B是基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的夹心法微流控反应检测通道的应用方法的步骤3的过程示意图。

图7A是基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的竞争法微流控反应检测通道的应用方法的步骤4的过程示意图; 图7B是基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的夹心法微流控反应检测通道的应用方法的步骤4的过程示意图。

图8是基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的应用方法的夹心法步骤5的过程示意图。

图9是基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的应用方法的夹心法步骤6的过程示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

结合图1A~3所示，本发明提供的一种基于磁微粒的微流控化学发光检测系统，包括底盘2和上层芯片1；

上层芯片1包括位于上层芯片1中心的加样区10和至少一个与加样区连通的微流控反应检测通道；在优选的实施方式中，加样区10的孔口上方可覆盖有抗红细胞滤血膜（图中未示出），抗红细胞滤血膜上可覆盖有血液盖（图中未示出）；

微流控反应检测通道为竞争法微流控反应检测通道11a或夹心法微流控反应检测通道11b；

其中，竞争法微流控反应检测通道11a包括：样本分离区100，其与加样区10连通；抗原包被区102，其通过毛细管微通道101与样本分离区100连通；抗体包被区104，其通过毛细管微通道103与抗原包被区102连通；磁微粒包被区106，其通过毛细管微通道105与抗体包被区104连通；废液收集区108，其通过毛细管微通道107与磁微粒包被区106连通；抗原包被区包被有发光物质标记的待测物质抗体包被区包被有具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的所述待测物质的抗体；

夹心法微流控反应检测通道包括：样本分离区200，其与加样区10连通；第一抗体包被区202，其通过毛细管微通道201与样本分离区200连通；第二抗体包被区204，其通过毛细管微通道203与第一抗体包被区202连通；磁微粒包被区206，其通过毛细管微通道205与第二抗体包被区204连通；废液收集区208，其通过毛细管微通道207与磁微粒包被区206连通；所述第一抗体包被区包被有发光物质标记的待测物质的一株抗体，第二抗体包被区包被的是具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测物质的另一株抗体；

如图2所示，应用时，底盘2设置于上层芯片的下方，底盘（塑料盘）对应磁微粒包被区的位置设有磁铁20，磁铁20可为永磁铁或电磁铁。

在本发明的优选实施方式中，上层芯片1与底盘2为形状相同的圆形，加样区10位于上层芯片的圆心，各微流控反应检测通道沿上层芯片1的半径方向形成；底盘2的中心设有通孔。

结合图1B，在本发明的另一优选实施方式中，加样区10通过加样通道12与各微流控反应检测通道的样本分离区连通；加样通道12为围绕加样区10形成的环形通道，加样通道12的一端与加样区10连通，加样通道的侧壁连通各微流控反应检测通道的样本分离区。

本发明中，发光物质为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或吖啶酯；具有特异亲和性的一对物质为生物素和链霉亲和素，生物素和亲和素，或者为荧光素和抗荧光素。

磁微粒的平均粒径在0.5~2μm。

在本发明的一具体实施方式中，如图1A和1B所示，微流控反应检测通道可为多个，其中，部分微流控反应检测通道为竞争法微流控反应检测通道，部分微流控反应检测通道为夹心法微流控反应检测通道。根据实际检测需要，该多个微流控反应检测通道也可全部为竞争法微流控反应检测通道或全部为夹心法微流控反应检测通道。

为了形成毛细管微阀效应，在本发明的一具体实施方式中，竞争法微流控反应检测通道中：抗原包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径A1小于出口直径B1，抗体包被区与抗原包被区之间的毛细管微通道的入口直径A2小于出口直径B2，磁微粒包被区与抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径A3小于出口直径B3，废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径A4小于出口直径B4；抗原包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径A1、抗体包被区与抗原包被区之间的毛细管微通道的入口直径A2、磁微粒包被区与抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径A3和废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径A4依次缩小。夹心法微流控反应检测通道中：第一抗体包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径A1’小于出口直径B1’，第二抗体包被区与第一抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径A2’小于出口直径B2’，磁微粒包被区与第二抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径A3’小于出口直径B3’，废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径A4’小于出口直径B4’；第一抗体包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径A1’、第二抗体包被区与第一抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径A2’、磁微粒包被区与第二抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径A3’和废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径A4’依次缩小。

为了形成毛细管微阀效应，在本发明的一具体实施方式中（图中未示出），竞争法微流控反应检测通道中：抗原包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；抗体包被区与抗原包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；磁微粒包被区与抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；抗原包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的出口直径、抗体包被区与抗原包被区之间的毛细管微通道的出口直径、磁微粒包被区与抗体包被区之间的毛细管微通道的出口直径和废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的出口直径依次缩小。夹心法微流控反应检测通道中：第一抗体包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；第二抗体包被区与第一抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；磁微粒包被区与第二抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；第一抗体包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的出口直径、第二抗体包被区与第一抗体包被区之间的毛细管微通道的出口直径、磁微粒包被区与第二抗体包被区之间的毛细管微通道的出口直径和废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的出口直径依次缩小。

本发明的基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的制备方法，包括如下步骤：

1）在芯片基板上开设所述加样区和所述微流控反应检测通道；

2）将发光物质标记的待测物质溶液覆于所述竞争法微流控反应检测通道的抗原包被区，将具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的抗待测物质抗体溶液覆于所述竞争法微流控反应检测通道的抗体包被区；

将发光物质标记的待测物质的一株抗体溶液覆于所述夹心法微流控反应检测通道的第一抗体包被区，将具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测物质的另一株抗体溶液覆于所述夹心法微流控反应检测通道的第二抗体包被区；

3）将表面标记有具有特异亲和性的一对物质中的另一个的磁微粒的溶液覆于磁微粒包被区，干燥；

4）底盘对应所述磁微粒包被区的位置设置磁铁。

本发明的基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的应用方法，包括如下步骤：

1）上层芯片1固定在检测仪器的自转轴3上部；当底盘上的磁铁20为永磁铁时，将底盘2套设在自转轴的下部远离上层芯片底面；当底盘2上的磁铁20为电磁铁时，底盘2贴附在上层芯片1底面，电磁铁对应位于上层芯片1的磁微粒包被区下方，电磁铁不通电；从加样区加入全血样本，启动仪器，自转轴自转，在离心力的作用下，全血经设置在加样区的抗红细胞滤血膜过滤，进入各微流控反应检测通道的样本分离区；

2）待全血样本流动稳定后，通过增加自转轴自转转速以加大离心作用使样本分离区的血样样本冲破毛细管微通道的毛细管微阀作用而流向各微流控通道的抗原包被区或第一抗体包被区：

在竞争法微流控反应检测通道中，在抗原包被区，血样样本中的待测物质不与发光物质标记的待测物质反应；在夹心法微流控反应检测通道中，在第一抗体包被区，血液样本中的待测抗原与发光物质标记的待测抗原的一株抗体发生反应形成一抗免疫复合物；

3)随后加大离心力使待测物质或一抗免疫复合物进入各微流控通道的抗体包被区或第二抗体包被区：

在竞争法微流控反应检测通道中，在抗体包被区，血样样本中的待测物质与发光物质标记的待测物质构成竞争关系，分别与具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的抗待测物质的抗体发生反应形成免疫复合物；

在夹心法微流控反应检测通道中，在第二抗体包被区，一抗免疫复合物与具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测物质的另一株抗体反应，形成二抗免疫复合物；

4）通过再次加大离心力使各微流控反应检测通道中的免疫复合物或二抗免疫复合物冲破毛细管微通道的毛细管微阀作用进入到磁微粒包被区，标记在磁微粒表面的具有特异亲和性的一对物质中的另一个与免疫复合物或二抗免疫复合物中的具有特异亲和性的一对物质中的一个快速发生反应形成结合磁微粒的免疫复合物，然后，将带永磁铁的底盘向上移动至贴合上层芯片的底面，永磁铁对应位于上层芯片的磁微粒包被区下方；或者对带电磁铁的底盘的电磁铁通电使其富有磁性；由于磁铁的磁吸力，结合磁微粒的免疫复合物或二抗免疫复合物在磁场的作用下富集到磁微粒包被区的底端，然后通过再次加大离心力使未参加反应的样本经毛细管微通道流向废液收集区；

5）从加样区加入清洗液洗涤结合磁微粒的免疫复合物，清洗液移动到磁微粒包被区时，将带永磁铁的底盘向下移动远离上层芯片，或者断开通电装置使电磁铁失去磁性，超声振荡，结合磁微粒的免疫复合物得到充分洗涤，然后将带永磁铁的底盘向上层芯片处运动，或者对带电磁铁的底盘的电磁铁通电使其富有磁性，将结合磁微粒的免疫复合物富集到磁微粒包被区的底端，通过加大离心力使清洗液流入废液收集区；

6）从加样区加入发光基底液，通过离心将发光基底液转移至磁微粒包被区，将带磁铁的底盘向下移动远离上层芯片，或者断开通电装置使电磁铁失去磁性，超声振荡后，仪器检测系统检测发光信号的强度，从而实现待测物的定量检测。

本发明的基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的检测过程需要的离心力来自于配套的检测仪器。自转轴不属于微流控化学发光检测系统的一部分，而是与微流控化学发光检测系统配套使用的仪器中的一部分，轴承与芯片托盘相连接固定；芯片可以夹在芯片托盘上；底盘不依附于自转轴，其通过通孔套设在自转轴上而自由上下移动。

磁场产生装置的磁场由磁铁提供，永磁铁可以通过移动与芯片的相对位置（电磁铁通过通电或断电），使磁微粒处于或脱离磁铁的磁场，来实现收集磁微粒技术效果。

以下，以微流控芯片中有一个夹心法微流控反应检测通道和一个竞争法微流控反应监测通道来检测甲状旁腺激素（PTH）和25-羟基维生素D₃(25-OH-D₃)为例对本发明进行进一步说明。甲状旁腺激素为夹心法，25-羟基维生素D₃为竞争法。

步骤1 从加样区（此处有抗红细胞滤血膜）加入10~100μL全血样本，盖上血液盖，将微流控化学发光检测系统放入配套的仪器中，启动仪器，在离心力的作用下，全血经抗红细胞滤血膜过滤，随后通过加样通道依次填满夹心法微流控反应检测通道和竞争法微流控反应监测通道中。

步骤2 待样本流动稳定后，通过加大离心作用使样本分离区的样本冲破毛细管微阀流向夹心法微流控反应检测通道中的第一抗体包被区和竞争法微流控反应监测通道中的抗原包被区。在夹心法微流控反应检测通道中，样本将烘干后形成的粉末状碱性磷酸酶标记的抗甲状旁腺激素抗体进行复溶，样本中的甲状旁腺激素与碱性磷酸酶标记的抗甲状旁腺激素抗体发生反应结合形成一抗免疫复合物；在竞争法微流控反应检测通道中，样本将烘干后形成的粉末状碱性联酸酶标记的25-羟基维生素D₃进行复溶，样本中的25-羟基维生素D₃不与碱性联酸酶标记的25-羟基维生素D₃反应。

步骤3 通过加大离心力，在夹心法微流控反应检测通道中，一抗免疫复合物冲破毛细管微阀作用流向第二抗体包被区，一抗免疫复合物与生物素标记的另一株抗甲状旁腺激素抗体发生反应形成二抗免疫复合物；在竞争法微流控反应检测通道中，样本中的25-羟基维生素D₃和碱性联酸酶标记的25-羟基维生素D₃冲破毛细管微阀作用流向抗体包被区，样本中25-羟基维生素D₃和碱性联酸酶标记的25-羟基维生素D₃构成竞争关系分别与生物素标记的抗25-羟基维生素D₃抗体发生反应形成免疫复合物1和免疫复合物2。

步骤4 通过再次加大离心力，二抗免疫复合物冲破毛细管微阀进入到夹心法微流控反应检测通道中的磁微粒包被区，免疫复合物1和免疫复合物2冲破毛细管微阀作用进入到竞争法微流控反应检测通道中的磁微粒包被区，复溶在各自区域的链霉亲和素标记的微磁粒（平均粒径1 μm），链霉亲和素与免疫复合物中的生物素快速发生反应形成结合磁微粒的免疫复合物，1~5 min后，将带永磁铁的底盘向上层芯片处运动，结合磁微粒的免疫复合物在磁场的作用下富集到磁微粒包被区的底端，然后通过再次加大离心力使未参加反应的样本经毛细管微阀流向废液收集区；

步骤5 从加样口加入清洗液洗涤结合磁微粒的免疫复合物或二抗免疫复合物，清洗液移动到磁微粒包被区时，将带永磁铁的底盘向下移动远离上层芯片，超声振荡，结合磁微粒的免疫复合物或二抗免疫复合物得到充分洗涤，将带永磁铁的底盘向上层芯片处运动，将结合磁微粒的免疫复合物或二抗免疫复合物富集到磁微粒包被区的底端，通过加大离心力使清洗液流入废液收集区；

步骤6 从加样口加入碱性磷酸酶发光底物，通过离心将发光基底液转移至磁微粒包被区，将带永磁铁的底盘向下移动远离上层芯片，超声振荡后，仪器检测系统检测发光信号的强度，从而实现分析物的定量检测。

在全血样本中PTH的结果如下表1所示：

表1

浓度ng/mL	相对光单位（RLU）	变异系数（CV）
			0	1009	1.8%
10	11239	0.3%
			30	32531	0.5%
100	132165	1.1%
			300	317280	2.1%
1000	1223654	0.4%

检测灵敏度范围为0~1000 ng/mL，并且在此范围的检测CV值低于10%。

在全血样本中25-OH-D₃的结果如下表2所示：

表2

浓度ng/mL	相对光单位（RLU）	变异系数（CV）
			0	925914	2.2%
4	789524	0.7%
			10	483251	0.2%
20	314552	1.3%
			40	197825	0.2%
100	108970	0.5%

检测灵敏度范围为0~100 ng/mL，并且在此范围的检测CV值低于10%。

1.碱性磷酸酶标记的抗体或抗原

(1)碱性磷酸酶标记的一株抗PTH抗体

将2.5mg的碱性磷酸酶（50IU/mg）加入到200μL 100mM的PBS缓冲溶液（pH=6.8）中，其中含有1.25%的戊二醛，搅拌混匀，4℃下活化24小时，透析至50mM（pH=7.2），18小时，换液3次；将1.8mg的一株鼠抗PTH单克隆抗体溶于120μL 1M的碳酸盐溶液（pH=9）中；将活化的碱性磷酸酶加入到配置的鼠抗PTH单克隆抗体的溶液中，混合均匀，4℃下反应24h，然后再加入20μL 100 mM的赖氨酸溶液，混合均匀，在20℃下反应4h；4℃下透析12h至50 mM PBS（pH=7.2），换液3次；离心去上层清液，用50mM TB7.4+0.6% BSA+0.05%NaN₃稀释，在-20℃下保存。

(2)碱性联酸酶标记的25-OH-D₃

将2.5mg的碱性磷酸酶（50IU/mg）加入到200μL 100mM的PBS缓冲溶液（pH=6.8）中，其中含有1.25%的戊二醛，搅拌混匀，4℃下活化24小时，透析至50mM（pH=7.2），18小时，换液3次；将1.8mg的25-OH-D₃溶于120μL 1M的碳酸盐溶液（pH=9）中；将活化的碱性磷酸酶加入到配置的25-OH-D₃溶液中，混合均匀，4℃下反应24h，然后再加入20μL 100 mM的赖氨酸溶液，混合均匀，在20℃下反应4h；4℃下透析12h至50 mM PBS（pH=7.2），换液3次；离心去上层清液，用50mM TB7.4+0.6% BSA+0.05%NaN₃稀释，在-20℃下保存。

2.生物素标记的抗体

(1)生物素标记的另一株抗PTH抗体

首先用碳酸钠缓冲液将另一株鼠抗PTH单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液室温（25℃±5℃）避光搅拌4小时透析；随后用N,N-二甲基酰胺（DMF）将6-氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素（BCNHS）配置成1mg/mL；在1mL鼠抗PTH单克隆抗体-2溶液中加入上述DMF溶液125μL~66.7μL，玻璃瓶中混合，室温（25℃±5℃）避光搅拌2小时；加入1mol/L 氯化铵溶液9.6μL，室温（25℃±5℃）避光搅拌10分钟；然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜；最后取出加等量甘油 -20℃保存即可。

(2)生物素标记的抗25-OH-D₃抗体

首先用碳酸钠缓冲液将鼠抗25-OH-D₃单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液室温（25℃±5℃）避光搅拌4小时透析；随后用N,N-二甲基酰胺（DMF）将6-氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素（BCNHS）配置成1mg/mL；在1mL鼠抗25-OH-D₃单克隆抗体溶液中加入上述DMF溶液125μL~66.7μL，玻璃瓶中混合，室温（25℃±5℃）避光搅拌2小时；加入1mol/L 氯化铵溶液9.6μL，室温（25℃±5℃）避光搅拌10分钟；然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜；最后取出加等量甘油 -20℃保存即可。

3.加样孔处抗红细胞滤血膜的处理

所选材料为玻璃纤维素膜或者聚酯纤维膜，浸泡于浓度为30 mg/L的鼠抗人红细胞单克隆抗体溶液，浸泡时长为1~6 h；随后将其置于湿度<35%的环境中沥干水分，时长8~16小时；最后将抗红细胞滤血膜裁剪成相应规格，用仪器将其贴于加样孔处。

4.抗体包被区或抗原包被区的处理

将碱性磷酸酶标记的抗原或抗体5～50μg于抗原包被区或第一抗体包被区，将生物素标记的抗体于5～50μg抗体包被区或第二抗体包被区，置于湿度<35%环境中干燥8~16小时。

5.磁微粒包被区的处理

磁微粒溶液的的配置：选用表面标记有链霉亲和素的具有超顺磁性的生物纳米磁珠，直径1μm，将其用磁微粒稀释液溶解成1~20 mg/mL。

磁微粒包被区的干燥：取5~15μL配置好的磁微粒溶液置于芯片上的磁微粒包被区，置于湿度<35%环境中干燥0.5小时。

6.检测

取15-150μL全血滴于样本区，在毛细管或者离心力的作用下，样本流经芯片。5-20分钟后，在化学发光免疫分析仪下检测磁微粒包被区的发光强度，即可反算出样本中待测物质的浓度。

附：所需溶液配制

（1）鼠抗人红细胞单克隆抗体浸泡液

磷酸二氢钠 0.99g

磷酸氢二钠 5.16g

牛血清蛋白 1g

氯化钠 0.9g

鼠抗人红细胞单克隆抗体 34mg

叠氮钠 1g

纯化水定容至 1000mL。

（2）磁微粒稀释液

磷酸二氢钠 0.99g

磷酸氢二钠 5.16g

氯化钠 0.9g

牛血清蛋白 5g

十六烷基三甲基氯化铵 0.224g

叠氮钠 0.5g

Proclin300 1mL

罗氏清洁抗体（HBR-3） 50mg

纯化水定容至 1000mL。

（3）清洗液

磷酸二氢钠 0.99g

磷酸氢二钠 5.16g

吐温-20 1ml

Proclin300 1mL。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种基于磁微粒的微流控化学发光检测系统，其特征在于，包括底盘和上层芯片；

所述上层芯片包括位于上层芯片中心的加样区和至少一个与所述加样区连通的微流控反应检测通道；

所述微流控反应检测通道为竞争法微流控反应检测通道或夹心法微流控反应检测通道；

其中，所述竞争法微流控反应检测通道包括：样本分离区，其与加样区连通；抗原包被区，其通过毛细管微通道与所述样本分离区连通；抗体包被区，其通过毛细管微通道与所述抗原包被区连通；磁微粒包被区，其通过毛细管微通道与所述抗体包被区连通；废液收集区，其通过毛细管微通道与所述磁微粒包被区连通；所述抗原包被区包被有发光物质标记的待测物质抗体包被区包被有具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的所述待测物质的抗体；

所述夹心法微流控反应检测通道包括：样本分离区，其与加样区连通；第一抗体包被区，其通过毛细管微通道与所述样本分离区连通；第二抗体包被区，其通过毛细管微通道与所述第一抗体包被区连通；磁微粒包被区，其通过毛细管微通道与所述第二抗体包被区连通；废液收集区，其通过毛细管微通道与所述磁微粒包被区连通；所述第一抗体包被区包被有发光物质标记的待测物质的一株抗体，第二抗体包被区包被的是具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测物质的另一株抗体；

应用时，所述底盘设置于上层芯片的下方，所述底盘对应各微流控反应检测通道的磁微粒包被区的位置设有磁铁，所述磁铁为永磁铁或电磁铁。

2.根据权利要求1所述的基于磁微粒的微流控化学发光检测系统，其特征在于，所述加样区通过加样通道与所述样本分离区连通；所述加样通道为围绕加样区形成的环形通道，加样通道的一端与所述加样区连通，加样通道的侧壁连通所述样本分离区。

3.根据权利要求1所述的基于磁微粒的微流控化学发光检测系统，其特征在于，所述发光物质为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或吖啶酯；所述具有特异亲和性的一对物质为生物素和链霉亲和素，生物素和亲和素，或者为荧光素和抗荧光素。

4.根据权利要求1所述的基于磁微粒的微流控化学发光检测系统，其特征在于，磁微粒的平均粒径在0.5~2μm。

5.根据权利要求1所述的基于磁微粒的微流控化学发光检测系统，其特征在于，所述微流控反应检测通道为多个，其中，部分微流控反应检测通道为竞争法微流控反应检测通道，部分微流控反应检测通道为夹心法微流控反应检测通道；或者多个所述微流控反应检测通道均为竞争法微流控反应检测通道；或者多个所述微流控反应检测通道均为夹心法微流控反应检测通道。

6.根据权利要求1所述的基于磁微粒的微流控化学发光检测系统，其特征在于，竞争法微流控反应检测通道中：抗原包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径小于出口直径；抗体包被区与抗原包被区之间的毛细管微通道的入口直径小于出口直径；磁微粒包被区与抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径小于出口直径；废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径小于出口直径；抗原包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径、抗体包被区与抗原包被区之间的毛细管微通道的入口直径、磁微粒包被区与抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径和废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径依次缩小；

夹心法微流控反应检测通道中：第一抗体包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径小于出口直径；第二抗体包被区与第一抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径小于出口直径；磁微粒包被区与第二抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径小于出口直径；废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径小于出口直径；第一抗体包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径、第二抗体包被区与第一抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径、磁微粒包被区与第二抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径和废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径依次缩小。

7.根据权利要求1所述的基于磁微粒的微流控化学发光检测系统，其特征在于，竞争法微流控反应检测通道中：抗原包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；抗体包被区与抗原包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；磁微粒包被区与抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；抗原包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的出口直径、抗体包被区与抗原包被区之间的毛细管微通道的出口直径、磁微粒包被区与抗体包被区之间的毛细管微通道的出口直径和废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的出口直径依次缩小；

夹心法微流控反应检测通道中：第一抗体包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；第二抗体包被区与第一抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；磁微粒包被区与第二抗体包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的入口直径大于出口直径；第一抗体包被区与样本分离区之间的毛细管微通道的出口直径、第二抗体包被区与第一抗体包被区之间的毛细管微通道的出口直径、磁微粒包被区与第二抗体包被区之间的毛细管微通道的出口直径和废液收集区与磁微粒包被区之间的毛细管微通道的出口直径依次缩小。

8.根据权利要求1所述的基于磁微粒的微流控化学发光检测系统，其特征在于，所述上层芯片与所述底盘为形状相同的圆形，所述加样区位于上层芯片的圆心，所述微流控反应检测通道沿所述上层芯片的半径方向形成；底盘的中心设有通孔；所述底盘上的磁铁为圆环形，对应位于磁微粒包被区的下方。

9.权利要求1~8任一项所述的基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）在芯片基板上开设所述加样区和所述微流控反应检测通道；

2）将发光物质标记的待测抗原溶液覆于所述竞争法微流控反应检测通道的抗原包被区，将具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的抗待测抗原抗体溶液覆于所述竞争法微流控反应检测通道的抗体包被区；将发光物质标记的待测抗原的一株抗体溶液覆于所述夹心法微流控反应检测通道的第一抗体包被区，将具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测抗原的另一株抗体溶液覆于所述夹心法微流控反应检测通道的第二抗体包被区；

3）将表面标记有具有特异亲和性的一对物质中的另一个的磁微粒的溶液覆于磁微粒包被区，干燥；

4）底盘对应所述磁微粒包被区的位置设置磁铁。

10.权利要求1~8任一项所述的基于磁微粒的微流控化学发光检测系统的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）上层芯片固定在检测仪器的自转轴上部；当底盘上的磁铁为永磁铁时，将底盘套设在自转轴的下部远离上层芯片底面；当底盘上的磁铁为电磁铁时，底盘贴附在上层芯片底面，电磁铁对应位于上层芯片的磁微粒包被区下方，电磁铁不通电；从加样区加入全血样本，启动仪器，自转轴自转，在离心力的作用下，全血经设置在加样区的抗红细胞滤血膜过滤，进入各微流控反应检测通道的样本分离区；

2）待全血样本流动稳定后，通过增加自转轴自转转速以加大离心作用使样本分离区的血样样本冲破毛细管微通道的毛细管微阀作用而流向各微流控通道的抗原包被区或第一抗体包被区：

在竞争法微流控反应检测通道中，在抗原包被区，血样样本中的待测抗原不与发光物质标记的待测抗原反应；在夹心法微流控反应检测通道中，在第一抗体包被区，血液样本中的待测抗原与发光物质标记的待测抗原的一株抗体发生反应形成一抗免疫复合物；

3)随后加大离心力使抗原或一抗免疫复合物进入各微流控通道的抗体包被区或第二抗体包被区：

在竞争法微流控反应检测通道中，在抗体包被区，血样样本中的待测抗原与发光物质标记的待测抗原构成竞争关系，分别与具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的抗待测抗原的抗体发生反应形成免疫复合物；

在夹心法微流控反应检测通道中，在第二抗体包被区，一抗免疫复合物与具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测抗原的另一株抗体反应，形成二抗免疫复合物；

4）通过再次加大离心力使各微流控反应检测通道中的免疫复合物或二抗免疫复合物冲破毛细管微通道的毛细管微阀作用进入到磁微粒包被区，标记在磁微粒表面的具有特异亲和性的一对物质中的另一个与免疫复合物或二抗免疫复合物中的具有特异亲和性的一对物质中的一个快速发生反应形成结合磁微粒的免疫复合物，然后，将带永磁铁的底盘向上移动至贴合上层芯片的底面，永磁铁对应位于上层芯片的磁微粒包被区下方；或者对带电磁铁的底盘的电磁铁通电使其富有磁性；由于磁铁的磁吸力，结合磁微粒的免疫复合物或二抗免疫复合物在磁场的作用下富集到磁微粒包被区的底端，然后通过再次加大离心力使未参加反应的样本经毛细管微通道流向废液收集区；

5）从加样区加入清洗液洗涤结合磁微粒的免疫复合物或二抗免疫复合物，清洗液移动到磁微粒包被区时，将带永磁铁的底盘向下移动远离上层芯片，或者断开通电装置使电磁铁失去磁性，超声振荡，结合磁微粒的免疫复合物或二抗免疫复合物得到充分洗涤，然后将带永磁铁的底盘向上层芯片处运动，或者对带电磁铁的底盘的电磁铁通电使其富有磁性，将结合磁微粒的免疫复合物或二抗免疫复合物富集到磁微粒包被区的底端，通过加大离心力使清洗液流入废液收集区；

6）从加样区加入发光基底液，通过离心将发光基底液转移至磁微粒包被区，将带磁铁的底盘向下移动远离上层芯片，或者断开通电装置使电磁铁失去磁性，超声振荡后，仪器检测系统检测发光信号的强度，从而实现待测物的定量检测。