CN103868913A - 碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液，含有0.4mg/mL的9,10-二氢吖啶衍生物，0.05mol/L的三羟基甲烷和0.5%的十二烷基磺酸钠。本发明的酶促化学发光底物液发光快，强度高，持续时间长，可达30～60分钟，可完全满足临床检测的需要，其主要性能指标达到了国外产品水平，大大降低了发光底物的成本。本发明的酶促化学发光底物液本底值相对发光强度不高于3000，AP浓度在0.1U/mL时，发光强度RLU值可达315000±65000，信号强，灵敏度高，特异性强。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体地说，涉及碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液。
背景技术
酶促化学发光底物液属于免疫诊断技术领域。本世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术已成为临床医学的常规检测手段。化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫（RIA）和酶免疫（EIA）相似，不同之处是以发光物质代替放射性核素或酶作为标记物，并借助其自身的发光强度直接进行测定。
化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且测试中不使用有毒有害的试剂，试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。
化学发光系统的原理在于免疫反应中的酶作用于发光底物。发光底物在酶的作用下，底物发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。
与放射免疫试剂（RIA）相比，化学发光避免了放射性核素的污染以及对操作人员的伤害，大大缩短了反应时间，同时兼具高灵敏度的优势。
与酶免（ELISA）产品相比，灵敏度与可测范围远远高于酶免产品，兼具ELISA法简便的操作方法与较短的反应时间。
与进口全自动发光相比，试剂成本远远低于进口全自动发光试剂，为开放体系，也可适用其他发光检测仪器检测。
发明内容
本发明的目的是提供碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液。
为了实现本发明目的，本发明提供的碱性磷酸酶（AP）的酶促化学发光底物液，含有0.05-1.0mg/mL的9,10-二氢吖啶衍生物，0.01-0.2mol/L的三羟基甲烷（Tris）和5g/L的十二烷基磺酸钠（SDS）。
优选地，所述底物液中含有0.4mg/mL的9,10-二氢吖啶衍生物，0.05mol/L的三羟基甲烷和5g/L的十二烷基磺酸钠。
其中，所述9,10-二氢吖啶衍生物的分子式如下：
本发明还提供所述底物液的制备方法：先配制0.01-0.2mol/L的三羟基甲烷溶液，其中含有0.05-10g/L的十二烷基磺酸钠，调节pH值后，加入9,10-二氢吖啶衍生物，搅拌均匀，避光保存。
本发明进一步提供所述底物液在化学发光免疫分析中的应用：在18℃-26℃温度范围内pH值为9.3±0.2，相对发光强度RLU≤3000，碱性磷酸酶（AP）浓度为0.1U/mL时，发光强度RLU值可达315000±65000。
化学发光免疫分析技术作为一种非放射性免疫分析技术，除了具有灵敏、特异、标记物稳定等特点外，其检测程序亦简便、快速，只需微量标本，近年来临床上已应用于检测各种激素、肿瘤标志物、药物及其他微量生物活性物质，亦可用于细菌和病毒感染的快速诊断。
本发明提供的碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液发光快，强度高，持续时间长，可达30～60分钟，可完全满足临床检测的需要，其主要性能指标达到了国外产品水平，大大降低了发光底物的成本。本发明的酶促化学发光底物液本底值相对发光强度不高于3000，AP浓度在0.1U/mL时，发光强度RLU值可达315000±65000，信号强，灵敏度高，特异性强。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的碱性磷酸酶（AP）的酶促化学发光底物液，其发光平台期测定结果。
图2为本发明实施例2中对t-PSA临床样本浓度与发光强度RLU值做线性回归图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液及其制备
本发明的碱性磷酸酶（AP）的酶促化学发光底物液，含有0.4mg/mL的9,10-二氢吖啶衍生物，0.05mol/L的三羟基甲烷（Tris）和5g/L的十二烷基磺酸钠（SDS）。
其中，所述9,10-二氢吖啶衍生物的分子式如下：
所述底物液的制备方法：先配制0.05mol/L的三羟基甲烷溶液，其中含有5g/L的十二烷基磺酸钠，调节pH值后，加入9,10-二氢吖啶衍生物，搅拌均匀，避光保存。
该底物液发光快，强度高，发光平台期长，可达30～60分钟，因此，可完全满足临床检测的需要，其发光平台期测定结果如图1所示。
实施例2 酶促化学发光底物液在促甲状腺激素（TSH）定量测定试剂盒（磁微粒化学发光法）中的应用
应用双抗体夹心法检测人血清中TSH的含量，试验步骤如下：
1、在反应管中分别加入生物素标记的TSH抗体50μL、碱性磷酸酶标记的TSH抗体50μL、人血清样本30μL或TSH标准品，混匀；37℃反应20分钟；
2、加入300μL洗液清洗，清洗5次；
3、加入链霉亲和素标记的磁微粒50μL；37℃反应15分钟；
4、加入300μL洗液清洗，清洗5次；
5、加入实施例1中制备的化学发光底物液200μL；
6、化学发光检测仪检测发光强度RLU值。
TSH标准品的浓度及对应的发光值见表1：
表1 TSH标准品的浓度及对应的发光值
| TSH标准品浓度μIU/mL | 发光强度RLU值 |
| 0.00 | 1179 |
| 0.50 | 4996 |
| 6.00 | 61427 |
| 12.00 | 125006 |
| 25.00 | 259103 |
| 50.00 | 470393 |
对TSH标准品浓度与发光强度RLU值做线性回归图，得TSH标准品浓度与相应发光值间的相关系数R2=0.9974。
实施例3 酶促化学发光底物液在总前列腺特异性抗原（t-PSA）定量测定试剂盒（磁微粒化学发光法）中的应用
应用双抗体夹心法检测人血清中t-PSA的含量，试验步骤如下：
1、在反应管中分别加入生物素标记的t-PSA抗体50μL、碱性磷酸酶标记的t-PSA抗体50μL、人血清样本30μL，混匀；37℃反应20分钟；
2、加入300μL洗液清洗，清洗5次；
3、加入链霉亲和素标记的磁微粒50μL；37℃反应15分钟；
4、加入300μL洗液清洗，清洗5次；
5、加入实施例1中制备的化学发光底物液200μL；
6、化学发光检测仪检测发光强度RLU值。
t-PSA临床样本的浓度及对应的发光值见表2：
表2 t-PSA临床样本的浓度及对应的发光值
| t-PSA临床样本的浓度μIU/mL | 发光强度RLU值 |
| 0.00 | 2105 |
| 0.01 | 5692 |
| 0.02 | 8883 |
| 0.04 | 7396 |
| 0.08 | 9530 |
| 0.16 | 10504 |
| 0.32 | 16522 |
| 0.64 | 30460 |
| 1.28 | 59235 |
| 2.56 | 109546 |
| 5.12 | 193769 |
| 10 | 328232 |
| 15 | 429475 |
| 20 | 561153 |
| 30 | 658695 |
| 38 | 703231 |
| 77 | 878994 |
| 154 | 958174 |
| 205 | 908497 |
| 308 | 774883 |
对t-PSA临床样本浓度与发光强度RLU值做线性回归图，如图2所示。t-PSA的浓度线性范围为0.01-150μIU/mL，对低值的分辨率高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液，其特征在于，含有0.05-1.0mg/mL的9,10-二氢吖啶衍生物，0.01-0.2mol/L的三羟基甲烷和0.05-10g/L的十二烷基磺酸钠；
其中，所述9,10-二氢吖啶衍生物的分子式如下：
2.根据权利要求1所述的底物液，其特征在于，含有0.4mg/mL的9,10-二氢吖啶衍生物，0.05mol/L的三羟基甲烷和5g/L的十二烷基磺酸钠。
3.权利要求1所述底物液的制备方法，其特征在于，先配制0.01-0.2mol/L的三羟基甲烷溶液，其中含有0.05-10g/L的十二烷基磺酸钠，调节pH值后，加入9,10-二氢吖啶衍生物，搅拌均匀，避光保存。
4.权利要求1或2所述底物液在化学发光免疫分析中的应用，其特征在于，在18℃-26℃温度范围内pH值为9.3±0.2，相对发光强度RLU≤3000，碱性磷酸酶浓度为0.1U/mL时，发光强度RLU值达315000±65000。
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