CN103344633A - 一种碱性磷酸酶的化学发光底物液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可应用于免疫检测领域的化学发光底物液，所述的发光底物液中含有9-（4-氯苯基硫代苯酰氧亚甲基）-10-甲基-9,10-二氢化吖啶-二钠盐和N，N二甲基吖啶硝酸盐、三羟甲基氨基甲烷、亚硫酸钠、十二烷基硫酸钠、TWEEN-20。本发明的化学发光底物液灵敏高、达到平台时间短、平台稳定期长、稳定性高。

Description

一种碱性磷酸酶的化学发光底物液

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，可应用于免疫检测领域的化学发光底物液。

背景技术

化学发光是物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象。一些物质在进行化学反应时，吸收了反应过程中的所产生的化学能，使反应产物分子激发到电子激发态。当电子从激发态的最低振动能级回到基态的各个振动能级时产生辐射，多余的能量以光子的形式释放出来，这一现象称为化学发光。化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。化学发光具有灵敏度高、特异性强、无放射危害等优点。

根据化学发光反应的不同体系和标记物及标记方法的不同，发光免疫分析大体可分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析及生物发光免疫分析三种类型。其中化学发光酶免疫技术是用与某一反应的酶来标记抗原或抗体，免疫反应后，加入发光试剂，测定发光体系的发光强度进行抗原或抗体测定。碱性磷酸酶-9,10-二氢吖啶（alkalinephosphatase，ALP）系统就是其中一个重要发展方向。

以碱性磷酸酶催化9-10-二氢吖啶的化学发光反应具有以下特点：

超高的灵敏度—可以检测到小于10-19mol的碱性磷酸酶。

能迅速达到峰值以减少检测时间，增加通过量。

持续发光—对测定时间要求并不高。发光强度可以在任何时间从产生的线性校准曲线上读取。

分析结果对温度在22℃--35℃范围内不敏感，降低控制温度所需的精度。

通常，把参与酶反应，被酶作用的物质称为底物，含有该底物的溶液，称为底物液。碱性磷酸酶发光底物液主要由发光剂（9,10-二氢吖啶或其衍生物）、N，N二甲基吖啶硝酸盐（增强剂）、缓冲液组成。

发明内容

本发明需要解决的技术问题在于提供一种稳定的，发光值高，进入平台期快，发光时间长、灵敏度高、成本低的化学发光底物液。

为了解决上述技术问题，本发明提供可一种化学发光底物液，其中发光液中含有9-（4-氯苯基硫代苯酰氧亚甲基）-10-甲基-9,10-二氢化吖啶-二钠盐和N，N二甲基吖啶硝酸盐以及缓冲液。

本发明的化学发光底物液成本低，发光强度与进口发光底物无明显差异，在免疫分析领域完全可以替代进口底物液，适用于半自动化学发光测定仪，也可用于全自动的测量系统。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

化学发光底物液的发光底物液中含有：9-（4-氯苯基硫代苯酰氧亚甲基）-10-甲基-9,10-二氢化吖啶-二钠盐 100～160mg/L，N，N二甲基吖啶硝酸盐  3.0～3.5mg/L，十二烷基硫酸钠  0.56-1.20g/L，亚硫酸钠  7-13mg/L，TWEEN-200.15-0.33g/L，0.26mol/L的Tris缓冲体系  PH8.9-9.6。

采用上述进一步的方案有益效果是发光强度增高，进入平台时间短，平台时间长，灵敏度强。

在上述进一步方案的基础上，所有化学发光底物液的发光底物液中各组分优选浓度为：

9-（4-氯苯基硫代苯酰氧亚甲基）-10-甲基-9,10-二氢化吖啶-二钠盐120mg/L，N，N二甲基吖啶硝酸盐3.4mg/L，十二烷基硫酸钠  1g/L，亚硫酸钠  10mg/L，TWEEN-20  0.31g/L，0.26mol/L的Tris缓冲体系  PH9.35

以上所述的发光液中，所有的缓冲液还可以采用其他常规的缓冲体系，例如硼酸-硼砂缓冲液等。

附图说明

图1为癌胚抗原（CEA）浓度-发光值校准曲线图（进口对照发光底物液）；

图2为癌胚抗原（CEA）浓度-发光值校准曲线图（本发明发光底物液）；

图3为进口对照发光底物液和本发明发光底物液发光平台期比较图；

具体实施方式

一下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

配制1000mL化学发光底物液，具体配方如下。化学发光底物发光底物液：

化学发光底物液的发光底物液1000mL配制采用以下方法：取Tris31.3g，亚硫酸钠10mg，十二烷基硫酸钠1g，N，N二甲基吖啶硝酸盐3.4mg，TWEEN-200.31g，用纯化水溶解定容至1000mL，pH9.35。

实施例2

比较上述实施例1中所述发光液与对照市售进口Lumigen公司生产的APS-5发光底物液在测定癌胚抗原（CEA）实验中的发光强度。

实验步骤：样本、校准品各加30ul于平底试管，加入60ul的抗试剂混匀，37℃温浴30min，加入30ul磁微粒试剂37摄氏度温浴5min。用洗液洗3遍，放入半自动发光仪中，每管加入200ul发光底物测试发光值。

分别用Lumigen公司生产的APS-5发光底物液和实施例1中的发光底物液分别对校准品进行实验，结果如下：

表1进口对照发光底物液与本发明发光底物液不同校准品浓度发光值表

以上述进口对照发光底物测定癌胚抗原（CEA）浓度-发光值进行线性拟合：

四参数Logistic方程（新）

拟合方程：

Y=66100.8677+(2289796.8575-66100.8677)(1+(X/126.5474)～1.2478)

相关系数：0.999766。

绘制图1，进口对照发光底物液癌胚抗原（CEA）浓度-发光值校准曲线图。

以上述进本发明发光底物胚抗原（CEA）浓度-发光值进行线性拟合：

四参数Logistic方程（新）

拟合方程：

Y=67512.5872+(2870339.4817-67512.5872)(1+(X/174.6378)～1.0773)

相关系数：0.999539。

绘制图2，进口对照发光底物液癌胚抗原（CEA）浓度-发光值校准曲线图。

参见图1和图2可看出，本发明化学发光底物液发光强度与进口对照发光底物液比较差别不大。

分别用Lumigen公司生产的APS-5发光底物液和实施例1中的发光底物液分别对校准品进行实验，结果如下：

表2进口发光底物液与本发明底物液对比样本检测浓度和发光值

实施例3

比较上述实施例1中所述发光底物液与市售进口Lumigen公司生产的APS-5发光底物液测定癌胚抗原（CEA）实验中的发光平台期。

样本、校准品各加30ul于平底试管，加入60ul的抗试剂混匀，37℃温浴30min，加入30ul磁微粒试剂37摄氏度温浴5min。用洗液洗3遍，放入半自动发光仪中，每管加入200ul发光底物后，每30秒测量1次，连续测试10分钟，统计相同样本的发光值在10分钟内的变化情况。

分别使用进口发光底物与实施例1所述发光底物液进行实验。

结果如下：

表3进口对照发光底物液与本发明发光底物液发光平台测定实验相对发光值表

以上表数据绘制反应时间-发光计数值图，见图3。

参见图3，从实验结果可看出，本发明化学发光底物液与进口对照发光底物液发光平台期数据对照，差别不大。

实施例4

配制1000mL化学发光底物液，具体配方如下。化学发光底物发光底物液：

化学发光底物液的发光底物液1000mL配制采用以下方法：取Tris31.3g，亚硫酸钠 10mg，十二烷基硫酸钠 1g，N，N二甲基吖啶硝酸盐 3.4mg，TWEEN-200.15g，用纯化水溶解定容至1000mL，pH9.35。

实施例5

配制1000mL化学发光底物液，具体配方如下。化学发光底物发光底物液：

化学发光底物液的发光底物液1000mL配制采用以下方法：取硼酸11.4g，硼砂4.9g，亚硫酸钠10mg，十二烷基硫酸钠1g，N，N二甲基吖啶硝酸盐3.268mg，TWEEN-200.15g，用纯化水溶解定容至1000mL，pH9.35。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种化学发光底物液，包含9-（4-氯苯基硫代苯酰氧亚甲基）-10-甲基-9,10-二氢化吖啶-二钠盐和N，N二甲基吖啶硝酸盐以及缓冲液。

2.根据权利要求1所述的化学发光底物液，其特征在于，其中的发光底物液中含有：

9-（4-氯苯基硫代苯酰氧亚甲基）-10-甲基-9,10-二氢化吖啶-二钠盐    100～160mg/L

N，N二甲基吖啶硝酸盐     3.0~3.5 mg/L

十二烷基硫酸钠             0.56-1.20g/L

亚硫酸钠                   7-13mg/L

TWEEN-20                  0.15-0.33g/L

0.26mol/L的Tris缓冲体系       PH 8.9-9.6。

3.根据权利要求1所述的化学发光底物液，其特征在于，其中的发光底物液中含有：

9-（4-氯苯基硫代苯酰氧亚甲基）-10-甲基-9,10-二氢化吖啶-二钠盐    120mg/L

N，N二甲基吖啶硝酸盐     3.4mg/L

十二烷基硫酸钠             1g/L

亚硫酸钠                   10mg/L

TWEEN-20                  0.31g/L

0.26mol/L的Tris缓冲体系       PH 9.35。

4.根据权利要求1所述的化学发光底物液，其特征在于，其中的发光底物液中含有：

9-（4-氯苯基硫代苯酰氧亚甲基）-10-甲基-9,10-二氢化吖啶-二钠盐    120mg/L

N，N二甲基吖啶硝酸盐     3.4mg/L

十二烷基硫酸钠             1g/L

亚硫酸钠                   10mg/L

TWEEN-20                  0.15g/L

0.26mol/L的Tris缓冲体系       PH 9.10。

5.根据权利要求1所述的化学发光底物液，其特征在于，其中的发光底物液中含有：

9-（4-氯苯基硫代苯酰氧亚甲基）-10-甲基-9,10-二氢化吖啶-二钠盐    120mg/L

N，N二甲基吖啶硝酸盐     3.4mg/L

十二烷基硫酸钠             1g/L

亚硫酸钠                   10mg/L

TWEEN-20                  0.15g/L

0.2mol/L的硼酸-硼砂缓冲体系  PH 9.35。

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