CN103048465B - 一种il-6微孔板式化学发光检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明“一种IL-6微孔板式化学发光检测试剂盒及其制备方法”，属于免疫检测技术。采用经胃蛋白酶处理两株IL-6单抗获得的IL-6单抗F(ab’)₂片段包被微孔板，以HRP标记的两株IL-6单抗为酶联物，提供了一种新的微孔板式化学发光检测IL-6试剂盒，具有操作简便，灵敏度高，特异性好等优点，克服了现有免疫检测技术中存在的很多缺点。

Description

一种IL-6微孔板式化学发光检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析试剂，具体地，本发明提供了一种IL-6微孔板式化学发光检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

人白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是由单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞及内分泌组织如垂体、甲状腺等多种细胞分泌的一种多肽物质，曾被命名为B淋巴细胞刺激因子、杂交瘤或浆细胞瘤生长因子、肝细胞刺激因子和T细胞分化因子。IL-6由212个氨基酸组成，分子量为26KDa。

作为一种多效能细胞因子，IL-6与可溶性IL-6受体形成IL-6/IL-6R复合物，活化细胞膜表面的gpl30，诱导信号传导子及转录激活子3活化，即IL-6信号转导。作为细胞因子网络中的重要成员之一，IL-6不仅作用于神经、内分泌、免疫系统，也广泛作用于心血管等系统,在炎症反应中起核心调节作用，是炎症免疫反应的重要介质，而炎症反应是近年来倍受关注的一种引起心血管疾病的危险因素。

炎症作为动脉粥样硬化的回应性反应，最初起到保护性作用，当损伤持续存在时,则演变为过度的炎症，导致斑块形成。Seino Y等在冠脉粥样硬化斑块局部和粥样硬化损伤的动脉壁上均发现有IL-6的表达，且表达量是正常组织的10～40倍，Rus等报道IL-6在动脉粥样硬化壁中的浓度为其血清的200倍,可以反映隐藏的斑块炎症和破裂可能性的大小。

临床研究表明，IL-6在急性冠脉综合征患者中水平显著高于正常人群，而且血清IL-6水平对未来发生的冠脉事件具有预测价值，对动脉粥样硬化形成、斑块的不稳定性以及预后重要的意义。同时联合多种炎症因子（hs-CRP、IL-6、BNP、TNF-α）能够明显提高预测急性冠脉综合征患者心脏意外事件的能力，对于早期诊断急性冠脉综合征和评估斑块不稳定性，预测未来心血管事件发生具有重大意义。

目前对IL-6的实验室诊断方法主要有放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法等。放射免疫法虽然高灵敏、高特异但存在有效期短、放射性污染的缺点。酶联免疫法具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用，成为最广泛应用的检测方法之一，但存在底物大部分有毒或为致癌、检测范围窄等缺点。化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是近年来继放射免疫分析和酶免疫分析之后发展起来的一种高灵敏度的微量测定技术，具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速等优点， 作为放射性免疫分析、酶免疫分析的替代者，是当前最理想的免疫分析方法。

综上，目前的免疫检测试剂各自存在一定的缺陷，例如双抗体（小鼠单抗）夹心法由于HAMA抗体引起的假阳性，单一单抗为检测抗体灵敏度差，多抗为检测抗体的特异性差，放免试剂有效期短、放射性废弃物污染危害，酶免试剂检测范围窄、重复性差，进口发光试剂费用昂贵等。

发明内容

本发明根据上述领域存在的缺陷和需求，提供白介素-6化学发光检测试剂盒，经临床实验证明，操作简便，灵敏度高，特异性好，对于早期诊断急性冠脉综合征和评估斑块不稳定性，预测未来心血管事件发生具有重大意义。

一种用于检测白介素-6的化学发光试剂盒，包括用于进行检测反应的容器载体，其特征在于，在所述容器载体的反应孔中负载有经胃蛋白酶处理两株IL-6单抗获得IL-6单抗F(ab’)₂片段。

所述化学发光试剂盒，还包括酶标记抗体和/或酶标记抗体稀释液，其特征在于：所述酶标记抗体为HRP标记的两株IL-6单抗，所述酶标记抗体稀释液：每1000mL终溶液中含有1.212gTris，1mL Proclin300，5g牛血清白蛋白（BSA），0.5g氨基比林，0.1g2-氨基苯酚-4-磺酰胺，溶剂为双蒸水，pH值为7.4。

所述化学发光试剂盒，还包括化学发光底物A液和B液各1瓶，

其中A液为：含10mM过氧化脲、1.0%(V/V)吐温-20、5mM氯化亚铁、2%(W/V)维生素C、0.1%(V/V)Proclin300、50mM pH8.5的Tris-HCl缓冲液；

B液为50mM pH8.5的Tris-HCI缓冲液，其中含终浓度为0.1%(V/V)的Proclin300，2mM的4-碘苯酚，5mM的2-氨基-4-氟苯酚，0.1%(W/V)的牛血清白蛋白（BSA），10mM鲁米诺溶液。

所述化学发光试剂盒，还包括白介素-6校准品和/或20倍洗涤液,所述20倍洗涤液：每1000mL终溶液中含有24.24g Tris，160g NaCl，1mL Tween-20，1mL TX-100，1mL Proclin300，溶剂为双蒸水，pH7.2-7.4。

所述用于进行检测反应的容器载体指96孔白色微孔板。

上述化学发光试剂盒的制备方法，包被步骤如下：

（1）制备包被液：将经胃蛋白酶处理两株IL-6单抗获得的IL-6单抗F(ab’)₂片段溶于0.1MpH6.0的MES缓冲液中配制成包被浓度为1ug/mL的包被液。

（2）将包被液置入用于进行检测反应的容器载体的反应区域进行包被，

（3）封闭。

所述包被的条件为2-8℃，18-24小时。

所述封闭采用的封闭液配方为：pH值为7.0-7.5，浓度为10mM的Tris缓冲液中加入终浓度2%(W/V)的苏氨酸、1%(W/V)的蔗糖、0.5%(W/V)的β-巯基乙醇;或

pH值为7.0-7.5，浓度为10mM的Tris缓冲液中加入终浓度5%(W/V)苏氨酸、3%(W/V)蔗糖、2%(W/V)β-巯基乙醇。

所述制备方法，还包括配制化学发光底物，化学发光底物包括A液和B液各1瓶，

其中A液为：含10mM过氧化脲、1.0%(V/V)吐温-20、5mM氯化亚铁、2%(W/V)维生素C、0.1%(V/V)Proclin300、50mM pH8.5的Tris-HCl缓冲液；

B液为50mM pH8.5的Tris-HCI缓冲液，其中含终浓度为0.1%(V/V)的Proclin300，2mM的4-碘苯酚，5mM的2-氨基-4-氟苯酚，0.1%(W/V)的牛血清白蛋白（BSA），10mM鲁米诺溶液。还包括制备酶联物，所述酶联物为HRP标记的两株IL-6单抗。

本发明采用经胃蛋白酶处理两株IL-6单抗获得IL-6单抗F(ab’)₂包被微孔板，以HRP标记的两株IL-6单抗为酶联物，建立了微孔板式化学发光检测IL-6试剂盒。本发明以经胃蛋白酶处理两株IL-6单抗获得IL-6单抗F(ab’)₂为包被物，避免了传统双抗体（小鼠单抗）夹心法由于HAMA抗体与单抗Fc结合引起的假阳性，而HRP标记的两株IL-6单抗，不仅克服了使用单一IL-6单抗为检测抗体灵敏度差的缺陷，同时较IL-6多抗为检测抗体具有较高的特异性，解决了目前临床上放免试剂有效期短、放射性废弃物污染危害，酶免试剂检测范围窄、重复性差，进口发光试剂费用昂贵等缺点。本发明的白介素-6化学发光检测试剂盒，经临床实验证明，操作简便，灵敏度高，特异性好，提供了一种高效、灵敏、稳定、特异的白介素-6检测技术，联合其他炎症因子（hs-CRP、TNF-α）对于提高预测急性冠脉综合征患者心脏意外事件的能力。

基于本发明的上述发明构思，本发明提供了试剂盒以及该试剂盒的制备方法。所述试剂盒中，提供了相应的化学发光底物液，酶标记抗体稀释液等。

附图说明

图1：IL-6抗体F(ab’)₂片段纯化液相色谱图。

图2：白介素-6检测试剂与其他检测试剂相关性。

具体实施方式

以下通过具体实验操作及结果说明本发明的技术方案和效果

试剂规格及来源：

IL-6单抗源自Abnova Corporation和Thermo Scientifc Pierce Antibodies公司，白介素-6校准品源自Thermo Scientifc Pierce Antibodies公司，HRP、胃蛋白酶均源自sigma公司。

实施例1、本发明的试剂盒I制备方法

1、本发明的试剂盒I包括：

1）白介素-6校准品；2）包被IL-6单抗F(ab’)₂片段的微孔板；3）HRP标记的IL-6单抗（2株）；4）20倍浓缩洗涤液；以及5）化学发光底物液。

2、本发明试剂盒I的制备方法： 

以重组人白介素-6配制校准品，以经胃蛋白酶处理两株IL-6单抗获得IL-6单抗F(ab’)₂片段包被微孔板，HRP标记IL-6单抗（2株），配制化学发光底物，分装上述组份，以及组装为成品。

2.1IL-6抗体F(ab’)₂片段包被板： 

2.1.1IL-6抗体F(ab’)₂片段制备

（1）将IL-6单抗1mg，溶于2mL100mM pH4.0醋酸缓冲液30℃，温育10min；

（2）取胃蛋白酶1.50mg，溶于1.5mL100mM pH4.0醋酸缓冲液，加入上述溶液中，于30℃作用24hr；

（3）用10mM pH8.0PBS透析过夜；

（4）加入硫醇终浓度为50mM，在室温下搅拌30min；

（5）上清经高效液相色谱分离纯化，收集获得IL-6抗体F(ab’)₂片段（图1）；

（6）浓缩上述F(ab’)₂片段，低温冻存。

2.1.2包被

用0.1M pH值为6.0的MES缓冲液配制成包被浓度为1ug/mL的IL-6抗体F(ab’)₂片段包被液，并将包被液负载于微孔板，2-8℃包被18-24小时。

2.1.3封闭用含2%苏氨酸、1%蔗糖、0.5%β-巯基乙醇，pH值为7.0-7.5，浓度为10mM的Tris缓冲液作为封闭液封闭上述洗涤后的固相载体。

2.2酶标抗人白介素-6抗体的制备采用改良的过碘酸钠法。具体步骤参见《生物化学与生物物理学报》16卷1984年第6期，骆加里等“过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶（HRP）中的若干问题及高效果的标记方法”。

2.3酶标记抗体稀释液的配制

2.4HRP标记抗人白介素-6抗体工作液的配制

将制备HRP标记抗人白介素-6抗体用稀释液分别稀释成不同浓度，使用棋盘滴定法选择出最佳的稀释度标记抗原、标记抗体工作浓度分别为（V/V）1:10000、1:5000。

2.520倍洗涤液的配制

2.6HRP化学发光底物的配制

A液和B液各1瓶，A液和B液各1瓶，

其中A液为：含10mM过氧化脲、1.0%(V/V)吐温-20、5mM氯化亚铁、2%(W/V)维生素C、0.1%(V/V)Proclin300、50mM pH8.5的Tris-HCl缓冲液；

B液为50mM pH8.5的Tris-HCI缓冲液，其中含终浓度为0.1%(V/V)的Proclin300，2mM的4-碘苯酚，5mM的2-氨基-4-氟苯酚，0.1%(W/V)的牛血清白蛋白（BSA），10mM鲁米诺溶液。

3、本发明的试剂盒I的使用方法 

1）自2-8℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡30分钟。

2）取出包被板条，插入板架上。

3）每次试验设校准品A-F各2孔每孔50ul，待测样本50ul，然后每孔加入50ul HRP标记抗体，振荡混匀后37℃温育60分钟。

4）甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。

5）各孔加化学发光底物液A、B各50μL，用微量震荡器充分振荡混合均匀，室温（20～25℃）避光反应5分钟。

6）必须于加化学发光底物液后的第5～30分钟内测量，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度（RLU），测量时间1秒/孔。

7）采用双对数法线性拟合建立标准曲线，根据待测样品的发光强度（RLU）计算出样品的IL-6浓度。

实施例2本发明的试剂盒I与酶联免疫试剂的平行对比试验

对正常对照样本60例，稳定性心绞痛样本48例，不稳定性心绞痛样本30例，急性心梗样本30例，采用本发明的试剂盒I（化学发光法）与白介素-6检测试剂(酶联免疫法)（试剂盒购自R&D）进行平行检测，检测程序和结果判断严格按照各试剂说明书进行。

表1.白介素-6检测试剂测定结果

表2白介素-6检测试剂测定结果

表1-2所述数据表明，本发明试剂盒I与对比酶联免疫检测试剂盒的检测正常对照、稳定性心绞痛和急性冠脉综合征患者（不稳定性心绞痛、急性心梗），ACS组（不稳定性心绞 痛、急性心梗）和非ACS组（稳定性心绞痛、正常对照）差异显著，ACS组IL-6阳性率显著高于非ACS组。本发明试剂盒I比对比试剂盒检测ACS具有更高的敏感性。

实施例3本发明试剂盒II的制备方法 

本发明试剂盒II的封闭液为含5%苏氨酸、3%蔗糖、2%β-巯基乙醇的浓度为10mM的Tris缓冲液，其他制备条件同试剂盒I制备方法一致，临床检测结果与本发明试剂盒I一致。

Claims (2)

1.一种用于检测白介素-6的化学发光试剂盒，包括用于进行检测反应的容器载体，酶标记抗体、酶标记抗体稀释液，化学发光底物A液和B液各1瓶；

其特征在于，在所述容器载体的反应孔中负载有经胃蛋白酶处理两株IL-6单抗获得的IL-6单抗F(ab’)₂片段；

所述酶标记抗体为HRP标记的两株IL-6单抗，所述酶标记抗体稀释液：每1000ml终溶液中含有1.212g Tris，1mL Proclin 300，5g牛血清白蛋白，0.5g 氨基比林，0.1g 2-氨基苯酚-4-磺酰胺，溶剂为双蒸水，pH值为7.4；

所述化学发光底物A液为：含10mM过氧化脲、1.0%(V/V)吐温-20、5mM氯化亚铁、2%(W/V)维生素C、0.1%(V/V)Proclin300、50mM pH8.5的Tris-HCl缓冲液；所述化学发光底物B液为50mM pH8.5的Tris-HCl缓冲液，其中含终浓度为0.1%(V/V)的Proclin300，2mM的4-碘苯酚，5mM的2-氨基-4-氟苯酚，0.1%(W/V)的牛血清白蛋白，10mM鲁米诺溶液。

2.根据权利要求1所述化学发光试剂盒，还包括白介素-6校准品和/或20倍洗涤液，所述20倍洗涤液：每1000ml终溶液中含有24.24g Tris，160g NaCl，1mL Tween-20，1mL TX-100，1mL Proclin 300，溶剂为双蒸水，pH7.2-7.4。

3.根据权利要求1或2所述化学发光试剂盒，所述用于进行检测反应的容器载体指微孔板。

4.权利要求1-3任一所述化学发光试剂盒的制备方法，包被步骤如下：

（1）制备包被液：将经胃蛋白酶处理两株IL-6单抗获得的IL-6单抗F(ab’)₂片段溶于0.1M pH6.0的MES缓冲液中，配制成包被浓度为1μg/ml的包被液；

（2）将包被液置入用于进行检测反应的容器载体的反应区域进行包被；

（3）封闭。

5.根据权利要求4所述的制备方法，所述包被的条件为2-8℃，18-24小时。

6.根据权利要求4所述的制备方法，所述封闭采用的封闭液配方为：

pH值为7.0-7.5，浓度为10mM的Tris缓冲液中加入终浓度2%(W/V)的苏氨酸、1%(W/V)的蔗糖、0.5%(W/V)的β-巯基乙醇；或

pH值为7.0-7.5，浓度为10mM的Tris缓冲液中加入终浓度5%(W/V)苏氨酸、3%(W/V)蔗糖、2%(W/V)β-巯基乙醇。

7.根据权利要求4所述的制备方法，还包括配制化学发光底物，化学发光底物包括A液和B液各1瓶，

其中A液为：含10mM过氧化脲、1.0%(V/V)吐温-20、5mM氯化亚铁、2%(W/V)维生素C、0.1%(V/V)Proclin300、50mM pH8.5的Tris-HCl缓冲液；

B液为50mM pH8.5的Tris-HCl缓冲液，其中含终浓度为0.1%(V/V)的Proclin300，2mM的4-碘苯酚，5mM的2-氨基-4-氟苯酚，0.1%(W/V)的牛血清白蛋白（BSA），10mM鲁米诺溶液。

8.根据权利要求4所述的制备方法，还包括制备酶标记抗体和/或酶标记抗体稀释液，其特征在于：所述酶标记抗体为HRP标记的两株IL-6单抗，所述酶标记抗体稀释液：每1000ml终溶液中含有1.212g Tris，1mL Proclin 300，5g 牛血清白蛋白（BSA），0.5g 氨基比林，0.1g 2-氨基苯酚-4-磺酰胺，溶剂为双蒸水，pH 7.4。