CN112979810B - Tag-72抗体-hrp稀释液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫诊断领域，具体而言，提供了一种TAG‑72抗体‑HRP稀释液及其应用。本发明提供的TAG‑72抗体‑HRP的稀释液可以有效改善TAG‑72抗体‑HRP工作液的稳定性，且能提高免疫检测信噪比和分析灵敏度，同时降低检测背景。本发明提供的含有上述稀释液的免疫检测试剂盒，该试剂盒的检测结果更加准确，灵敏度更高，工作液有效期更长。
Description
技术领域
本发明涉及免疫诊断领域，具体而言，涉及一种TAG-72抗体-HRP稀释液及其应用。
背景技术
肿瘤相关抗原72(TAG-72)是一种能被两种单克隆抗体(CC49和B72.3)所检测的糖蛋白，CC49是抗高浓度的TAG-72，B72.3是抗人转移乳腺癌细胞膜。TAG-72是胃肠道肿瘤和卵巢癌的标志物。胃癌患者血清TAG-72检测阳性率为59％，高于CA19-9和CEA，若三项指标联合应用，阳性率可提高到70％以上。血清TAG-72对恶性病变性质的确定具有较高的特异性，正常人及良性病变患者少呈阳性，TAG-72水平升高见于：3.5％的正常人，6.7％的良性胃肠道疾病，40％胃肠道癌，36％的肺癌以及24％的卵巢癌。TAG-72对卵巢癌的诊断敏感性为47-80％，优于CA125，TAG-72和CA125联合检测可以提高卵巢癌的检出率。通过检测血清中TAG-72的水平可以了解原发性乳腺癌和胃癌、结肠癌、卵巢癌的清除情况；如果癌瘤完全切除，TAG-72在23.3天内降至正常，故认为TAG-72是疾病分期和判断胃、肠道癌症患者是否有残存肿瘤的良好指标。
目前，TAG-72的免疫诊断方法有放射免疫分析(RIA)、酶联免疫分析(ELISA)、化学发光免疫测定分析(CLIA)等。其中，标记端采用HRP偶联TAG-72抗体(简称TAG-72抗体-HRP)可以用于ELISA和CLIA检测。然而，现有TAG-72抗体-HRP工作液会存在背景较高、信噪比低和稳定性较差等问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种TAG-72抗体-HRP的稀释液。
本发明的第二目的在于提供酶水解明胶在制备TAG-72抗体-HRP的稀释液的用途。
本发明的第三目的在于提供上述稀释液在制备TAG-72检测试剂盒中的应用。
本发明的第四目的在于提供一种TAG-72检测试剂盒。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种TAG-72抗体-HRP的稀释液，包括酶水解明胶、缓冲液和氨基比林。
可选地，酶水解明胶的浓度为2-20w/v％，优选为5-20w/v％。
进一步地，所述缓冲液包括组氨酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、氨-氯化铵缓冲液、巴比妥钠缓冲液、ADA缓冲液、PIPES缓冲液、MOPSO缓冲液、BES缓冲液、MOPS缓冲液、TES缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、EPPS缓冲液、Tricine缓冲液、Bicine缓冲液、TAPS缓冲液、BIS-tris缓冲液或TEA缓冲液。
可选地，缓冲液的浓度为10-500mmol/L，优选为10-100mmol/L，进一步优选为25-80mmol/L。
进一步地，所述稀释液的pH为6.5-9，优选为7-9。
进一步地，所述稀释液还包括至少一种金属盐离子。
可选地，所述金属盐离子选自钠离子或钾离子。
可选地，金属盐离子的浓度为20-500mmol/L；优选为30-250mmol/L，进一步优选为150-250mmol/L。
进一步地，氨基比林的浓度为0.025-0.2w/v％。
进一步地，所述稀释液还包括至少一种粘度调节剂。
可选地，所述粘度调节剂选自甘油、甘露醇、蔗糖或海藻糖。
可选地，所述粘度调节剂的浓度为1-30w/v％，优选为2-20w/v％，进一步优选为2.5-10w/v％。
进一步地，所述稀释液还包括至少一种螯合剂。
可选地，所述螯合剂选自EDTA、NTA或DTPA。
可选地，所述螯合剂的浓度为0.5-50mmol/L，优选为1-30mmol/L。
进一步地，所述稀释液还包括至少一种表面活性剂。
可选地，所述表面活性剂选自非离子表面活性剂。
优选地，所述表面活性剂选自吐温20、吐温80或Triton X-100。
可选地，表面活性剂的浓度为0.005-0.5w/v％，优选为0.005-0.1w/v％。
进一步地，所述稀释液还包括至少一种防腐剂。
可选地，所述防腐剂选自叠氮钠或Proclin-300。
可选地，防腐剂的浓度为0.005-0.5w/v％，优选为0.01-0.2w/v％。
本发明提供酶水解明胶在制备TAG-72抗体-HRP的稀释液的用途。
可选地，酶水解明胶在TAG-72抗体-HRP的稀释液中的浓度为2-20w/v％，优选为5-20w/v％。
本发明提供的上述稀释液在制备TAG-72检测试剂盒中的应用。
一种TAG-72检测试剂盒，包括本发明提供的上述TAG-72抗体-HRP的稀释液；
可选地，所述检测试剂盒还包括封闭液和/或样本稀释液，其中，封闭液和样本稀释液均独立地包括至少一种惰性蛋白，
可选地，惰性蛋白选自酶水解明胶、BSA、明胶或酪蛋白；
可选地，所述酶水解明胶的浓度为2-20w/v％；
可选地，所述BSA的浓度为0.1-5w/v％；
可选地，所述明胶的浓度为1-10w/v％；
可选地，所述酪蛋白的浓度为0.1-3w/v％。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供一种TAG-72抗体-HRP的稀释液，该稀释液包括酶水解明胶、缓冲液和氨基比林。发明人经研究发现在TAG-72抗体-HRP稀释液中加入酶水解明胶可以显著降低背景，提高P/N值，分析灵敏度和TAG-72抗体-HRP工作液稳定性，使得TAG-72检测结果更加准确和灵敏。此外，本发明提供的稀释液通用性较好，对封闭液和样本稀释液的种类并没有特定的限定，适用范围广。
本发明提供一种含有上述稀释液的TAG-72检测试剂盒，该试剂盒的检测结果更加准确，灵敏度更高，工作液有效期更长。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中TAG-72板式发光平台的标准曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
酶水解明胶在制备TAG-72抗体-HRP的稀释液的用途。
通常TAG-72抗体-HRP在首次检测前需要使用稀释液进行稀释，并且稀释后获得的工作液需要长时间保存，然而现有的TAG-72抗体-HRP工作液的稳定性较差，且易造成检测背景值高，信噪比较差，分析灵敏度低等问题，发明人经研究发现在稀释液中加入酶水解明胶可以有效解决上述问题，P/N值得到显著提高，分析灵敏度和稳定性也得到明显的改善，且背景值低，使得TAG-72检测结果更加准确和灵敏。此外，本发明提供的稀释液通用性较好，对封闭液和样本稀释液的种类并没有特定的限定，适用范围广。
需要说明的是，在本发明中，TAG-72抗体-HRP是指标记辣根过氧化物酶(HRP)的TAG-72抗体(例如CC49或B72.3)；酶水解明胶是指明胶经酶水解的产物，明胶水解的衍生物，通常分子量降至2000～10000；P/N值是指300U/mL孔发光值除以0U/mL孔发光值，反映整体线性情况，P/N值越大，表示试剂阴性阳性更分明；分析灵敏度是指10U/mL孔发光值除以0U/mL孔发光值，即10/0值，该值越大间接表明试剂的分析灵敏度越高。
一种TAG-72抗体-HRP工作液的稀释液，包括酶水解明胶、缓冲液和氨基比例。
在优选地实施方式中，稀释液中酶水解明胶的浓度为2-20w/v％，优选为5-20w/v％。其中，“w/v％”是指质量体积百分比，例如稀释液中包括2-20w/v％的酶水解明胶，是指每1L稀释液中含有酶水解明胶2-20g。此外，酶水解明胶的浓度典型但非限制性的为2w/v％、5w/v％、10w/v％、15w/v％或20w/v％。
缓冲液可以稳定工作液的pH，使抗体-HRP处于适合的pH条件下。在可选地实施方式中，缓冲液可包括组氨酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、氨-氯化铵缓冲液、巴比妥钠缓冲液、ADA缓冲液、PIPES缓冲液、MOPSO缓冲液、BES缓冲液、MOPS缓冲液、TES缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、EPPS缓冲液、Tricine缓冲液、Bicine缓冲液、TAPS缓冲液、BIS-tris缓冲液或TEA缓冲液，但不限于此。
在可选地实施方式中，缓冲剂应以足以实现其预期功能的量存在，即维持所需的pH，例如可选为10-500mmol/L的缓冲液。在一些可选的实施方式中，例如Tris缓冲液，优选为10-100mmol/L，进一步优选为25-80mmol/L。缓冲液的浓度典型但非限制性的为10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L、300mmol/L、350mmol/L、400mmol/L、450mmol/L或500mmol/L。
在可选地实施方式中，稀释液的pH为6.5-9，进一步为7-9。稀释液的pH典型但非限制性的为6.5、6.8、7、7.2、7.8、8、8.5或9。
氨基比林作为一种HRP体系的稳定剂。在可选地实施方式中，氨基比林的浓度为0.025-0.2w/v％。氨基比林的浓度典型但非限制性的为0.025w/v％、0.05w/v％、0.1w/v％、0.15w/v％或0.2w/v％。
在可选地实施方式中，稀释液还包括至少一种金属盐离子，金属盐离子作为阳性和阴性抗衡离子源，减少分析物因离子作用引起的非特异性结合。在可选地实施方式中，金属盐离子选自钠离子或钾离子，但不限于此。钠离子的来源可以为氯化钠或硫酸钠，钾离子的来源可以为氯化钾或硫酸钾。
在可选地实施方式中，例如可选为20-500mmol/L的金属盐离子。在一些可选的实施方式中，例如氯化钠，金属盐离子的浓度优选为30-250mmol/L，进一步优选为150-250mmol/L；金属盐离子的浓度典型但非限制性的为20mmol/L、30mmol/L、50mmol/L、70mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L、300mmol/L、350mmol/L、400mmol/L、450mmol/L或500mmol/L。
在可选地实施方式中，稀释液还包括至少一种粘度调节剂增加工作液的粘度，促使液相溶液稳定，保证抗体与分析物的稳定结合。在可选地实施方式中，粘度调节剂选自甘油、甘露醇、蔗糖或海藻糖，但不限于此。
在可选地实施方式中，粘度调节剂的浓度为1-30w/v％，在一些可选的实施方式中，例如甘油，优选为2-20w/v％，进一步优选为2.5-10w/v％。粘度调节剂的浓度典型但非限制性的为1w/v％、1.5w/v％、2w/v％、2.5w/v％、5w/v％、10w/v％、15w/v％、20w/v％、25w/v％或30w/v％。
在可选地实施方式中，稀释液还包括至少一种螯合剂，螯合剂能螯合金属离子，稳定HRP结构。螯合剂选自EDTA(乙二胺四乙酸)、NTA(氨基三乙酸)或DTPA(二乙烯三胺五乙酸)，但不限于此。
在可选地实施方式中，螯合剂的浓度为0.5-50mmol/L，在一些可选的实施方式中，例如EDTA，优选为1-30mmol/L。螯合剂的浓度典型但非限制性的为1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L或30mmol/L。
在可选地实施方式中，稀释液还包括至少一种表面活性剂，表面活性剂降低液体表面张力，促进抗体-HRP溶解。在可选地实施方式中，表面活性剂选自非离子表面活性剂，不引入电荷影响。在可选地实施方式中，表面活性剂选自吐温20、吐温80或Triton X-100，但不限于此。
在可选地实施方式中，表面活性剂的浓度为0.005-0.5w/v％，在一些可选的实施方式中，例如吐温20，优选为0.005-0.1w/v％。表面活性剂的浓度典型但非限制性的为0.005w/v％、0.01w/v％、0.025w/v％、0.05w/v％或0.1w/v％。
在一些可选的实施方式中，稀释液包括2-20w/v％的酶水解明胶、10-100mmol/L的Tris缓冲液、30-250mmol/L的钠离子、0.025-0.2w/v％的氨基比林、2.5-30w/v％的甘油、1-30mmol/L的EDTA和0.005-0.1w/v％的吐温20，pH7-9。
在可选地实施方式中，稀释液还包括至少一种防腐剂，防腐剂用于抑制或减少组合物中的微生物生长。防腐剂选自叠氮钠或Proclin-300，但不限于此。
在可选地实施方式中，防腐剂的浓度为0.005-0.5w/v％，在一些可选的实施方式中，例如Proclin-300，优选为0.01-0.2w/v％。
本发明提供的上述稀释液在制备TAG-72检测试剂盒中的应用。
一种含有上述稀释液的TAG-72检测试剂盒。该试剂盒的检测结果更加准确，灵敏度更高，工作液有效期更长。
在可选地实施方式中，该检测试剂盒中还包括封闭液和/或样本稀释液，其中，封闭液和样本稀释液均独立地包括至少一种惰性蛋白。
在可选地实施方式中，惰性蛋白选自酶水解明胶、BSA、明胶或酪蛋白，但不限于此。在一些可选的实施方式中，酶水解明胶的浓度优选为2-20w/v％；在一些可选的实施方式中，BSA的浓度优选为0.1-5w/v％；在一些可选的实施方式中，明胶的浓度优选为1-10w/v％；在一些可选的实施方式中，酪蛋白的浓度优选为0.1-3w/v％。酶水解明胶的浓度典型但非限制性的为2w/v％、5w/v％、10w/v％、15w/v％或20w/v％；BSA的浓度典型但非限制性的为0.1w/v％、0.5w/v％、1w/v％、1.5w/v％、2w/v％、2.5w/v％、3w/v％、3.5w/v％、4w/v％、4.5w/v％或5w/v％；明胶的浓度典型但非限制性的为1w/v％、2w/v％、3w/v％、4w/v％、5w/v％、6w/v％、7w/v％、8w/v％、9w/v％或10w/v％；酪蛋白的浓度典型但非限制性的为0.1w/v％、0.5w/v％、1w/v％、1.5w/v％、2w/v％、2.5w/v％或3w/v％。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
1、微孔板的制备
取KH15发光板(厦门怡佳美实验器材有限公司)，将鼠单抗B72.3或鼠单抗CC49用包被液(1L纯化水中加入1.59g Na2CO3和2.94g NaHCO3)稀释至1μg/mL，每孔加100μL。4℃孵育18小时候后，弃余液，用清洗液(1L纯化水中加入8.5g NaCl，2.9g Na2HPO4.12H2O，0.3gNaH2PO4.2H2O和0.5mL吐温20)清洗一次。向每孔中加120μL封闭液(5％酶水解明胶)，37℃孵育2小时，弃余液，干燥后使用或保存。
2、二抗酶(试剂1)的制备
将5μL原倍CC49-HRP或B72.3-HRP加入20mL稀释液(50mmol/L Tris缓冲液，150mmol/L NaCl，10w/v％甘油，5w/v％酶水解明胶，0.1w/v％氨基比林，5mmol/L EDTA，0.05w/v％Tween20和0.1w/v％Proclin-300，PH7.2)中，混匀待用；其中，CC49或B72.3标记HRP采用NaIO4法。
3、标准品的制备
用标准品稀释液(20mM PB+5％酶水解明胶)将TAG-72抗原配制成300U/mL的标准品1，150U/mL标准品2，50U/mL的标准品3和10U/mL的标准品4。
4、检测步骤
向微孔板内添加50μL人血清样品、标准品溶液(外购
tumour makercontrol-level 2(货号TU5002)；Target 6.02U/mL；Low 4.52/mL；High 7.53U/mL)和校准品溶液，再加入50μL的试剂1，置于37℃孵育1小时后用清洗液(同步骤1中清洗液)洗涤5次。向每孔加100μL的HRP化学发光底物(购自华科泰)，延时60秒后测发光信号值，结果如下表1所示。检测仪器为北京中生百克科学仪器技术有限公司BK-L96C。
表1
根据吸光值绘制标准曲线(见图1)，通过标准曲线计算人血清样品中的TAG-72的浓度。例如，人血清发光信号值720033，通过公式计算得血清中TAG-72蛋白的浓度为144.21U/mL。
实施例2不同稀释液对TAG-72检测试剂P/N值的影响
参照实施例1中的检测方法，用包被液稀释B72.3/CC49至1μg/ml，每孔加100μL。4℃孵育18小时候后，弃余液，用清洗液清洗一次。向每孔中加120μL封闭液，37℃孵育2小时，弃余液干燥备用。
将5μL原倍CC49-HRP或B72.3-HRP加入20mL稀释液中，混匀获得试剂1，其中，试剂1的稀释液分别采用如下稀释液1-稀释液8：
稀释液1：
50mmol/L Tris缓冲液，150mmol/L NaCl，10w/v％甘油，0.5w/v％casein(酪蛋白)，0.1w/v％氨基比林，5mmol/L EDTA，0.05w/v％Tween20和0.1w/v％Proclin-300，PH7.2。
稀释液2：
50mmol/L Tris缓冲液，150mmol/L NaCl，10w/v％甘油，1w/v％BSA，0.1w/v％氨基比林，5mmol/L EDTA，0.05w/v％Tween20和0.1w/v％Proclin-300，PH7.2。
稀释液3：
50mmol/L Tris缓冲液，150mmol/L NaCl，10w/v％甘油，5w/v％gelatin(明胶)，0.1w/v％氨基比林，5mmol/L EDTA，0.05w/v％Tween20和0.1w/v％Proclin-300，PH7.2。
稀释液4：
50mmol/L Tris缓冲液，150mmol/L NaCl，10w/v％甘油，5w/v％酶水解明胶，0.1w/v％氨基比林，5mmol/L EDTA，0.05w/v％Tween20和0.1w/v％Proclin-300，PH7.2。
稀释液5：
50mmol/L Tris缓冲液，150mmol/L NaCl，10w/v％甘油，5w/v％NBS(新生小牛血清)，0.1w/v％氨基比林，5mmol/L EDTA，0.05w/v％Tween20和0.1w/v％Proclin-300，PH7.2。
稀释液6：
50mmol/L PB缓冲液，10w/v％甘露醇，5w/v％酶水解明胶，0.1w/v％氨基比林，0.05w/v％TritonX-100和0.1w/v％Proclin-300，PH7.2。
稀释液7：
50mmol/L硼酸盐缓冲液，10w/v％海藻糖，5w/v％酶水解明胶，0.1w/v％氨基比林，5mmol/L EDTA，0.05w/v％Tween80和0.1w/v％Proclin-300，PH7.2。
稀释液8：
50mmol/L Tris缓冲液，150mmol/L NaCl，10w/v％甘油，0.1w/v％氨基比林，5mmol/L EDTA，0.05w/v％Tween20和0.1w/v％Proclin-300，PH7.2。
向微孔板内添加50μL标准品溶液，再加入50μL的试剂1，置于37℃孵育1小时后用清洗液洗涤5次。向每孔加100μL的化学发光底物，延时60秒后测发光值。结果如下表2所示：
表2
从上表结果可以看出，使用稀释液2、3、4、6、7具有较佳的P/N值和分析灵敏度，且背景值低。
实施例3不同稀释液对TAG-72检测试剂稳定性的影响
参照实施例2中的检测方法，用包被液稀释B72.3或CC49至1μg/ml，每孔加100μL。4℃孵育18小时候后，弃余液，用清洗液清洗一次。向每孔中加120μL封闭液，37℃孵育2小时，弃余液干燥备用。其中，分别采用稀释液1-稀释液8稀释CC49/B72.3-HRP至4000倍，将稀释好的工作液分装成三支，一支37℃加速7天，一支37℃加速3天，另外一支4℃放置7天。
向微孔板内添加50μL标准品溶液，再加入50μL的试剂1，置于37℃孵育1小时后用清洗液洗涤5次。向每孔加100μL的化学发光底物，延时60秒后测发光值，计算P/N值、分析灵敏度。结果如下表3-6所示：
表3
表4
表5
表6
从上述结果看，使用含有酶水解明胶的稀释液4、6和7具有稳定的低背景值，高P/N值、高分析灵敏度性，可见酶水解明胶能够有效提高工作液的稳定性、且具有低背景、高P/N、高灵敏度的优点。
实施例4稀释液组分浓度的优选
参照实施例1的检测方法，用包被液稀释B72.3/CC49至1μg/ml，每孔加100μL。4℃孵育18小时候后，弃余液，用清洗液清洗一次。向每孔中加120μL封闭液，37℃孵育2小时，弃余液干燥备用。其中，试剂1的稀释液采用如下组1-组8的稀释液：
组1：Xmmol/L Tris缓冲液，150mmol/L NaCl，10w/v％甘油，10w/v％酶水解明胶，0.1w/v％氨基比林，5mmol/L EDTA，0.05w/v％Tween20和0.1w/v％Proclin-300，pH7.2(X为10/25/50/80/100)。
组2：50mmol/L Tris缓冲液，Xmmol/L NaCl，10w/v％甘油，10w/v％酶水解明胶，0.1w/v％氨基比林，5mmol/L EDTA，0.05w/v％Tween20和0.1w/v％Proclin-300，pH7.2(X为30/90/150/200/250)。
组3：50mmol/L Tris缓冲液，150mmol/L NaCl，Xw/v％甘油，10w/v％酶水解明胶，0.1w/v％氨基比林，5mmol/L EDTA，0.05w/v％Tween20和0.1w/v％Proclin-300，pH7.2(X为2.5/5/10/20/30)。
组4:50mmol/L Tris缓冲液，150mmol/L NaCl，10w/v％甘油，Xw/v％酶水解明胶，0.1w/v％氨基比林，5mmol/L EDTA，0.05w/v％Tween20和0.1w/v％Proclin-300，pH7.2(X为2/5/10/15/20)。
组5：50mmol/L Tris缓冲液，150mmol/L NaCl，10w/v％甘油，10w/v％酶水解明胶，Xw/v％氨基比林，5mmol/L EDTA，0.05w/v％Tween20和0.1w/v％Proclin-300，pH7.2(X为0.025/0.05/0.1/0.15/0.2)。
组6：50mmol/L Tris缓冲液，150mmol/L NaCl，10w/v％甘油，10w/v％酶水解明胶，0.1w/v％氨基比林，Xmmol/L EDTA，0.05w/v％Tween20和0.1w/v％Proclin-300，pH7.2(X为1/2.5/5/10/30)。
组7：50mmol/L Tris缓冲液，150mmol/L NaCl，10w/v％甘油，10w/v％酶水解明胶，0.1w/v％氨基比林，5mmol/L EDTA，Xw/v％Tween20和0.1w/v％Proclin-300，pH7.2(X为0.005/0.01/0.025/0.05/0.1)。
组8：50mmol/L Tris缓冲液，150mmol/L NaCl，10w/v％甘油，10w/v％酶水解明胶，0.1w/v％氨基比林，5mmol/L EDTA，0.05w/v％Tween20和0.1w/v％Proclin-300，pHX(X为7/7.2/7.8/8.5/9)。
向微孔板内添加50μL标准品溶液，再加入50μL的试剂1，置于37℃孵育1小时后用清洗液洗涤5次。向每孔加100μL的化学发光底物，延时60秒后测发光值。结果如下表7所示：
表7
从上表可以看出，稀释液中7个组分浓度及pH值可在以上范围中进行调试，对稀释液使用效果影响较小。
实施例5
本实施例检测本发明提供的TAG-72抗体-HRP的稀释液在使用不同封闭液情况下TAG-72检测试剂的检测结果。
参照实施例1中的检测方法，用包被液稀释B72.3/CC49至1μg/ml，每孔加100μL。4℃孵育18小时候后，弃余液，用清洗液清洗一次。向每孔中加120μL封闭液，37℃孵育2小时，弃余液干燥备用。其中，封闭液分别采用如下组1-组4：
组1：5w/v％酶水解明胶。
组2：1w/v％BSA。
组3：0.5w/v％casein。
组4：5w/v％明胶。
向微孔板内添加50μL标准品溶液，再加入50μL的试剂1，置于37℃孵育1小时后用清洗液洗涤5次。向每孔加100μL的化学发光底物，延时60秒后测发光值。结果如下表8所示：
表8
| 蛋白组分： | 5w/v％酶水解明胶 | 1w/v％BSA | 0.5w/v％casein | 5w/v％明胶 |
| 0 | 2378 | 2210 | 2362 | 2421 |
| 10 | 21325 | 20352 | 22139 | 21980 |
| 50 | 88650 | 83309 | 86577 | 88411 |
| 150 | 272449 | 257341 | 274967 | 274967 |
| 300 | 651171 | 621117 | 641153 | 638206 |
| P/N | 273.9 | 281.1 | 271.4 | 263.6 |
| 分析灵敏度： | 9.0 | 9.2 | 9.4 | 9.1 |
从上表可以看出酶水解明胶/BSA/casein/明胶均可用于TAG-72项目的封闭液，不影响封闭效果。
实施例6
本实施例检测本发明提供的TAG-72抗体-HRP的稀释液在使用不同标准品稀释液的情况下TAG-72检测试剂的检测结果。
参照实施例1中的检测方法，用包被液稀释B72.3/CC49至1μg/ml，每孔加100μL。4℃孵育18小时候后，弃余液，用清洗液清洗一次。向每孔中加120μL封闭液，37℃孵育2小时，弃余液干燥备用。其中，标准品稀释液分别采用如下组1-组4：
组1：20mmol/L PB+5w/v％酶水解明胶。
组2：20mmol/L PB+1w/v％BSA。
组3：20mmol/L PB+0.5w/v％casein。
组4：20mmol/L PB+5w/v％明胶。
向微孔板内添加50μL标准品溶液，再加入50μL的试剂1，置于37℃孵育1小时后用清洗液洗涤5次。向每孔加100μL的化学发光底物，延时60秒后测发光值。结果如下表9所示：
表9
| 蛋白组分： | 5w/v％酶水解明胶 | 1w/v％BSA | 0.5w/v％casein | 5w/v％明胶 |
| 0 | 2256 | 2343 | 2164 | 2321 |
| 10 | 20690 | 21166 | 20491 | 21027 |
| 50 | 84186 | 83946 | 80678 | 85461 |
| 150 | 265147 | 269176 | 258097 | 268420 |
| 300 | 615224 | 621706 | 615813 | 623474 |
| P/N | 272.8 | 265.4 | 284.6 | 268.6 |
| 分析灵敏度： | 9.2 | 9.0 | 9.5 | 9.1 |
从上表可以看出酶水解明胶、BSA、casein或明胶均可用于TAG-72项目的标准品稀释液(即为样本稀释液)，不影响封闭效果。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (24)
1. 一种TAG-72抗体-HRP的稀释液，其特征在于，所述稀释液包括酶水解明胶 2-20w/v%、缓冲液 10-100mmol/L、金属钠离子 30-250mmol/L、粘度调节剂 2.5-30w/v%、螯合剂1-30 mmol/L、表面活性剂 0.005-0.1w/v%和氨基比林 0.025-0.2w/v%，所述稀释液的pH为7-9。
2.根据权利要求1所述的稀释液，其特征在于，酶水解明胶的浓度为5-20w/v%。
3.根据权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述缓冲液包括组氨酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、氨-氯化铵缓冲液、巴比妥钠缓冲液、ADA缓冲液、PIPES缓冲液、MOPSO缓冲液、BES缓冲液、MOPS缓冲液、TES缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、EPPS缓冲液、Tricine缓冲液、Bicine缓冲液、TAPS缓冲液、BIS-tris缓冲液或TEA缓冲液。
4.根据权利要求1所述的稀释液，其特征在于，缓冲液的浓度为25-80mmol/L。
5.根据权利要求1所述的稀释液，其特征在于，金属钠离子的浓度为150-250mmol/L。
6.根据权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述粘度调节剂选自甘油、甘露醇、蔗糖或海藻糖。
7.根据权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述粘度调节剂的浓度为2.5-10w/v%。
8.根据权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述螯合剂选自EDTA、NTA或DTPA。
9.根据权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述表面活性剂选自非离子表面活性剂。
10. 根据权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述表面活性剂选自吐温20、吐温80或Triton X-100。
11.根据权利要求1-10任一项所述的稀释液，其特征在于，所述稀释液还包括至少一种防腐剂。
12.根据权利要求11所述的稀释液，其特征在于，所述防腐剂选自叠氮钠或Proclin-300。
13. 根据权利要求11所述的稀释液，其特征在于，防腐剂的浓度为0.005-0.5 w/v%。
14.根据权利要求13所述的稀释液，其特征在于，防腐剂的浓度为0.01-0.2w/v%。
15. 酶水解明胶在制备TAG-72抗体-HRP的稀释液的用途；所述稀释液包括酶水解明胶2-20w/v%、缓冲液 10-100mmol/L、金属钠离子 30-250mmol/L、粘度调节剂 2.5-30w/v%、螯合剂 1-30 mmol/L、表面活性剂 0.005-0.1w/v%和氨基比林 0.025-0.2w/v%，所述稀释液的pH为7-9；
所述酶水解明胶用于提高稀释液的稳定性和/或灵敏度。
16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，酶水解明胶在TAG-72抗体-HRP的稀释液中的浓度为5-20w/v%。
17.权利要求1-14任一项所述的稀释液在制备TAG-72检测试剂盒中的应用。
18.一种TAG-72检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-14任一项所述的TAG-72抗体-HRP的稀释液。
19.根据权利要求18所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括封闭液和/或样本稀释液，其中，封闭液和样本稀释液均独立地包括至少一种惰性蛋白。
20.根据权利要求19所述的检测试剂盒，其特征在于，惰性蛋白选自酶水解明胶、BSA、明胶或酪蛋白。
21.根据权利要求20所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酶水解明胶的浓度为2-20w/v%。
22.根据权利要求20所述的检测试剂盒，其特征在于，所述BSA的浓度为0.1-5w/v%。
23.根据权利要求20所述的检测试剂盒，其特征在于，所述明胶的浓度为1-10w/v%。
24.根据权利要求20所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酪蛋白的浓度为0.1-3w/v%。
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