CN108333360A - 胃泌素释放肽前体稀释液及其应用和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胃泌素释放肽前体稀释液及其应用和胃泌素释放肽前体检测试剂盒。本发明胃泌素释放肽前体稀释液包括柠檬酸‑柠檬酸钠和柠檬酸‑磷酸氢二钠中一种或两种缓冲液0.01‑0.5mol/L、无机盐50‑500mmol/L、防腐剂0.01‑0.5％w/w。本发明胃泌素释放肽前体稀释液用于配制胃泌素释放肽前体的校准品和质控品。本发明胃泌素释放肽前体检测试剂盒中含有用本发明胃泌素释放肽前体稀释液配制的胃泌素释放肽前体校准品和质控品。本发明胃泌素释放肽前体稀释液不仅能够保证胃泌素释放肽前体抗原在2‑8℃能实现长期液态保存，而且显著提升了胃泌素释放肽前体抗原在37℃液态保存的热稳定性。

Description

胃泌素释放肽前体稀释液及其应用和试剂盒
技术领域
本发明属于医疗试剂技术领域，具体涉及一种胃泌素释放肽前体稀释液、胃泌素释放肽前体校准品或质控品和胃泌素释放肽前体检测试剂盒。
背景技术
肺癌的发病率和病死率在世界上呈逐年升高的趋势，严重危害着人类的健康，肺癌按组织病理学分类分为两大类：小细胞肺癌(smallcelllungcancer，SCLC)和非小细胞肺癌non-smallcelllung cancer，NSCLC)，其中SCLC占总肺癌的人群比例约为15％-20％，且具有恶性程度较高、增殖快、易远处转移的特点。与NSCLC相比，SCLC对化疗、放疗较敏感，早期生存率较高，但SCLC患者确诊时多为中晚期，错过最佳治疗时机，故早期诊断SCLC显得尤为重要。因此.寻找对SCLC早期诊断有辅助作用的血清肿瘤标志物具有重要的意义。
近年来的实验研究表明SCLC的细胞株及肿瘤组织细胞质中的高尔基体内储存着分泌的胃泌素释放肽(GRP)，在适当时释放到组织中，与胞膜上的GRP受体相结合，促进肿瘤细胞的无限增长，低水平的GRP即可刺激SCLC肿瘤细胞的合成，因此GRP被认为是SCLC的自主生长因子。但GRP肽链端容易被分解酶裂解导致降解迅速，故其活性部分在血液中不稳定，临床上直接检测GRP较困难。GRP的前体结构ProGRP可分为3种含有共同片段为ProGRP31-98的分子亚型.可以在血浆中稳定表达，ProGRP是GRP的基因编码产物，广泛存在于非胃窦组织、神经纤维、脑和肺的神经内分泌细胞中，临床上通常检测ProGRP的表达水平来反映GRP在人体中的表达。
目前，临床上ProGRP作为SCLC的重要肿瘤标志物。建立一种快速，简便，灵敏，准确可靠的检测ProGRP水平的方法尤为重要。ProGRP的检测主要为免疫学诊断方法，包括放射性同位素免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附试验法(ELISA)、以及胶体金免疫层析法(ICA)等。
其中，放射性同位素免疫分析法法因其存在着操作繁琐、检测时间长、不适合大批量检测、结果重复性差、核素污染等问题。酶联免疫吸附试验法存在着操作繁琐、测定周期偏长、灵敏度相对较低、线型范围偏窄等诸多不足；尤其是，由于ProGRP血清含量偏低，采用ELISA法检测ProGRP表现出明显的灵敏度较差的问题，使临床无法在早期快速准确的诊断出SCLC的发作，因而限制了ELISA法在ProGRP临床检测方面的进一步应用。酶联免疫法一般都通过延长反应时间来提高试剂检测灵敏度，手工操作下，一般都需耗时2-3小时，且手工操作误差较大。
在上述现有的检测方法存在缺陷的基础上，化学发光免疫分析法具有灵敏度高、速度快、特异性强和操作简便等优势，现在成为ProGRP测定的重要方法。CLIA的主要优点是灵敏度高、线性范围宽、标记物的有效期长、无放射性危害、可实现全自动化等。化学发光法虽具有准确、特异性强、精密度好的优点，其灵敏度也远高于酶联免疫吸附试验法和胶体金免疫层析法；但是，现有的ProGRP商业检测试剂盒灵敏度依然不够高，分析灵敏度都在3pg/mL以上，因而不能够准确地检测超低浓度的ProGRP，故不能满足ProGRP早期诊断的高要求。
另外，上述化学发光免疫分析法由于使用两点定标的试剂，结果值受定标结果影响很大。试剂各组分的热稳定性，是试剂的一项关键指标。然而ProGRP抗原或ProGRP校准品、ProGRP质控品在常规稀释液中的热稳定性较差，从而影响了ProGRP检测的灵敏度和准确度。具体地，例如目前康乃格公司提供6点定标品和2水平质控品，均为冻干粉，复融后2-8℃仅能稳定保存3天。Roche公司提供的ProGRP检测试剂盒，可将其中的生物素化的抗ProGRP的单克隆抗体和钌(Ru)络合物标记的抗ProGRP单克隆抗体与抗原形成三明治夹心法结构，通过电化学发光免疫分析法(ECLIA)测定ProGRP。但其提供2点定标品和2水平质控品，均为冻干粉，复溶后20-25℃仅能稳定5个小时，2-8℃仅能稳定保存14天。
因此，目前关于ProGRP抗原抗体反应的体外诊断试剂的稳定性报道都是针对2-8℃保存条件下的长期稳定性才做稳定性评价。但在实际试剂的运输、流通、使用、保存等环节中，经常会出现10℃以上的环境。个别条件较差的地区或实验室，夏天温度可达到37℃-40℃。如果缓冲液缓冲体系、pH、离子强度、稳定剂、防腐剂等不适合在温度偏高的环境下会造成抗原活性下降，这种下降一般是不可逆的，从而影响试剂结果或使试剂失效。ProGRP抗原或ProGRP校准品、ProGRP质控品在常规稀释液中的热稳定性较差，2-8℃长期热稳定性也不太好，所以大多数厂家选择的是冻干方案。但冻干品容易受冻干工艺、赋形添加物的影响，常会出现瓶间差，尤其是复溶后稳定性差，实际有效的校准品、质控测试受限。因此研究一种能提高ProGRP抗原在液态保存热稳定性的稀释液很有必要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种胃泌素释放肽前体稀释液，以克服常规胃泌素释放肽前体稀释液对胃泌素释放肽前体热稳定性较差，2-8℃长期热稳定性也不理想的技术问题。
本发明的另一目的在于提供一种胃泌素释放肽前体校准品或质控品，以解决胃泌素释放肽前体校准品或质控品热稳定性或其冻干品复融后稳定性不理想的技术问题。
本发明的又一目的在于提供一种胃泌素释放肽前体待测样本处理液，以解决胃泌素释放肽前体待测样本处理过程中或之后所含的胃泌素释放肽前体由于热稳定性差而导致检测不准确的技术问题。
本发明的又一目的在于提供一种胃泌素释放肽前体检测试剂盒，以解决现有胃泌素释放肽前体检测试剂盒和灵敏度准确性不高的技术问题。
为了实现上述发明目的，本发明的一方面，提供了一种胃泌素释放肽前体稀释液。所述胃泌素释放肽前体稀释液包含如下组分：
柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-磷酸氢二钠中一种或两种缓冲液0.01-0.5mol/L
无机盐 50-500mmol/L
防腐剂 0.01-0.5％w/w。
本发明的另一方面，提供了一种胃泌素释放肽前体校准品或质控品，包括胃泌素释放肽前体抗原和用于稀释所述胃泌素释放肽前体抗原的稀释液。其中，所述稀释液为本发明胃泌素释放肽前体稀释液。
本发明的又一方面，提供了一种胃泌素释放肽前体待测样本处理液，所述处理液为本发明胃泌素释放肽前体稀释液。
本发明的又一方面，提供了一种胃泌素释放肽前体检测试剂盒。所述胃泌素释放肽前体检测试剂盒包括胃泌素释放肽前体质控品、胃泌素释放肽前体校准品；其中，所述胃泌素释放肽前体校准品和胃泌素释放肽前体质控品为本发明胃泌素释放肽前体校准品和质控品。
本发明的又一方面，提供了本发明胃泌素释放肽前体稀释液、本发明胃泌素释放肽前体校准品或质控品、本发明胃泌素释放肽前体待测样本处理液或本发明胃泌素释放肽前体检测试剂盒在检测胃泌素释放肽前体中的应用。
与现有技术相比，本发明胃泌素释放肽前体稀释液不仅能够保证胃泌素释放肽前体抗原在2-8℃能实现长期液态保存，而且显著提升了胃泌素释放肽前体抗原在37℃液态保存的热稳定性。
本发明胃泌素释放肽前体校准品或质控品由于是采用上述本发明胃泌素释放肽前体稀释液稀释胃泌素释放肽前体抗原，从而使得本发明胃泌素释放肽前体校准品和质控品不仅能够在2-8℃能实现长期液态保存，而且还在37℃液态稳定保存，克服了常规稀释液稀释的校准品或质控品仅仅能够在2-8℃保存或冻干品复融后稳定性差的不足。
本发明胃泌素释放肽前体待测样本处理液对待测样品进行稀释处理，从而保证待测样本中胃泌素释放肽前体抗原的稳定性，从而进一步提高胃泌素释放肽前体检测的结果准确性。
本发明胃泌素释放肽前体检测试剂盒包括采用本发明胃泌素释放肽前体稀释液配制的胃泌素释放肽前体校准品或质控品，从而使得胃泌素释放肽前体抗原能实现长期液态稳定保存，这有利于胃泌素释放肽前体检测结果更准确，更稳定，重现性好。
附图说明
图1是本发明实施例11与对比例1提供的ProGRP稀释液配制的校准品加速热稳定性测试结果图；
图2是本发明实施例11与实施例12提供的ProGRP稀释液配制的校准品加速热稳定性测试结果图；
图3是本发明实施例13与实施例14提供的ProGRP稀释液配制的校准品加速热稳定性测试结果图；
图4是本发明实施例15与实施例16提供的ProGRP稀释液配制的校准品加速热稳定性测试结果图；
图5是本发明实施例17、实施例18与实施例19提供的ProGRP稀释液配制的校准品加速热稳定性测试结果图；
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一方面，本发明实施例提供了一种胃泌素释放肽前体(下文简称为ProGRP)稀释液。所述ProGRP稀释液包含如下组分：
柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-磷酸氢二钠中一种或两种缓冲液0.01-0.5mol/L
无机盐 50-500mmol/L
防腐剂 0.01-0.5％w/w。
这样，上述ProGRP稀释液采用柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-磷酸氢二钠中一种或两种作为缓冲液，并在无机盐等组分的协效作用下，赋予ProGRP抗原的热稳定性能，具体是使得ProGRP抗原不仅能够在2-8℃实现长期液态保存，而且显著提升了ProGRP抗原在37℃液态保存的热稳定性，也即是上述ProGRP稀释液还能保证ProGRP抗原在高达37℃的温度下的热稳定性。
其中，上述ProGRP稀释液中柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-磷酸氢二钠中一种或两种缓冲液能够为稀释液提供了酸碱稳定的体系，具体是提供弱酸、弱碱及其盐在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对上述ProGRP稀释液酸碱度的影响，保持上述ProGRP稀释液的pH值相对稳定，具有重要作用，该柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-磷酸氢二钠中一种或两种缓冲液在稀释液基础组分的基础上，提高ProGRP抗原液态保存的稳定性，具体的不仅使得ProGRP抗原能够在2-8℃实现长期液态保存，而且显著提升了ProGRP抗原在37℃液态保存的热稳定性。一实施例中，上述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，所述柠檬酸与柠檬酸钠的摩尔比为1:0.5-1:4。在另一实施例中，所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，所述柠檬酸与磷酸氢二钠的摩尔比为1:0.5-1:3。其中，上述柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-磷酸氢二钠中一种或两种缓冲液优选浓度为0.05-0.2M。
通过控制柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-磷酸氢二钠中一种或两种缓冲液的浓度，使得上述ProGRP稀释液的pH的范围为3.0-6.6，优选为5.0-6.0。通过控制两者的摩尔比和浓度的优化，一方面提高稀释液pH值的稳定性，更重要的是提高上述ProGRP稀释液对ProGRP抗原的热稳定性。
上述ProGRP稀释液所含的无机盐提供一定的离子强度，其与上述柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-磷酸氢二钠中一种或两种缓冲液中提供的离子一起作用，维持上述ProGRP稀释液的渗透压，以维持ProGRP抗原的构象稳定。在一实施例中，所述无机盐为NaCl、KCl、MgCl2中的任一种或两种以上的混合物，优选为NaCl。另外，在具体实施例中，上述无机盐的浓度可以是50mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L、300mmol/L、350mmol/L、400mmol/L、450mmol/L、500mmol/L等。该种类和含量的无机盐能够提供一定浓度的离子，与上述柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-磷酸氢二钠中一种或两种缓冲液中提供的离子一起作用，维持上述ProGRP稀释液的渗透压，以维持ProGRP抗原的构象稳定。
上述ProGRP稀释液所含的防腐剂能够起到抑制细菌生成和蛋白的聚合，起到防腐作用，保存抗原的活性。在一实施例中，所述防腐剂为叠氮钠、叠氮锂、对羟基苯甲酸酯类、苯甲酸、苯甲酸盐类、山梨酸盐类、亚硝酸钠、Proclin 300、Proclin 950中的任一种或两种以上的混合物。另外，在具体实施例中，上述防腐剂的浓度可以是0.01％、0.15％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％等。该种类和含量的防腐剂不仅起到防腐抑制细菌滋生，避免稀释液被污染；另一方面与上述柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-磷酸氢二钠中一种或两种缓冲液一起作用，抑制蛋白如ProGRP抗原的聚合，提高ProGRP抗原的构象稳定。
在进一步实施例中，上述ProGRP稀释液还包括0.01-10％w/w封闭剂、1-20％w/w多元醇渗透剂、0.01-2.00％v/v表面活性剂、20-200ug/mL酶抑制剂、0.01-5％络合物中的至少一种组分。
其中，上述封闭剂起封闭作用，其能够非特异性地将表面的抗原决定簇结合，这样特异性的抗体就不会跟这些非特异性的抗原决定簇结合，这样背景就会降低，从而提高ProGRP检测的准确性。因此，一实施例中，该封闭剂为BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶中的任一种或两种以上的混合物，优选为BSA。在具体实施例中，上述封闭剂的含量可以是0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、80％、10％等质量浓度。该种类和浓度的封闭剂是通过蛋白起作用，能够有效与抗原决定簇结合，同时由于蛋白在高浓度时更不容易降解(>1mg/ml)，在低浓度时(<0.1mg/ml)极易降解而失活，所以上述种类的蛋白类封闭剂还起到稳定剂的作用，稳定游离ProGRP抗原的作用。
上述多元醇渗透剂是具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列，并能使表面张力显著下降的物质，在溶液中起渗透作用，有利于ProGRP抗原等在液体中的保存，起到稳定ProGRP抗原的构象的作用，保持其与抗体结合的能力。在一实施例中，上述多元醇渗透剂为乙二醇、丙三醇、蔗糖、海藻糖、PEG 2000、PEG 4000、PEG 6000、PEG 8000中的任一种或两种以上的混合物。另外，可以根据该多元醇渗透剂所选的种类不同而灵活调整其含量浓度。如在具体实施例中，当多元醇渗透剂为蔗糖时，其质量浓度为5％-20％；当多元醇渗透剂为海藻糖时，其质量浓度为1％-5％；当多元醇渗透剂为乙二醇、丙三醇时，其质量浓度为5％-20％，当多元醇渗透剂为PEG时，其质量浓度为1-10mg/mL。在优选实施例中，多元醇渗透剂为2％w/w的海藻糖。
上述表面活性剂为非离子表面活性剂。该非离子表面活性剂在水中不电离，性质稳定，有良好的乳化、润湿、分散、助溶的性能。一实施例中，该非离子表面活性剂为Tween-20、Tween-80、Emulgen B-66(聚氧乙烯基衍生物)、Triton X-100(曲拉通x-100)中的任一种或两种以上的混合物，优选的表面活性剂为Tween-20。在具体实施例中，该表面活性剂的体积浓度为0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％等。该种类和浓度的非离子表面活性剂不仅具有良好的乳化、润湿、分散、助溶的性能，而且减少ProGRP抗原的非特异性结合。
上述酶抑制剂可抑制多种蛋白酶活性，以防止ProGRP抗原蛋白降解。在一实施例中，该酶抑制剂为抑肽酶、胃蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制、亮抑蛋白酶肽、苯甲基磺酰氟(PMSF)、乙二胺四乙酸(EDTA)、N-甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲基酮(TLCK)、苯丙胺酰氯甲酮(TPCK)、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(Roche Pefabloc SC)中的任一种或两种以上的混合物，优选PMSF。在具体实施例中，上述酶抑制剂的浓度可以是20ug/mL、30ug/mL、50ug/mL、80ug/mL、100ug/mL、120ug/mL、150ug/mL、180ug/mL、200ug/mL等。该种类和浓度的酶抑制剂能有效抑制蛋白酶活性，为防止ProGRP抗原蛋白降解。
上述络合剂能够使金属离子生成性质完全不同的螯合物，能够降低和控制金属离子浓度。由于络合剂的成环作用使螯合物比组成和结构相近的非螯合配位化合物的稳定性高。另外金属离子在抗原的降解中常起作用，该络合剂可以减弱ProGRP抗原蛋白的降解过程。在一实施例中，该络合剂包括含有氨基二乙酸的络合剂，选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、硫代磷酸二乙酯(DETP)、二乙基三胺五乙酸(DTPA)及络合盐中的一种或几种，优选的络合剂为EDTA-2K。在具体实施例中，上述络合剂的浓度可以是0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％等。该种类和浓度的络合剂能够有效降低和控制金属离子浓度，以减弱ProGRP抗原蛋白的降解过程，从而提高ProGRP抗原的稳定性。
由此上述ProGRP稀释液在柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-磷酸氢二钠中一种或两种缓冲液与基础组分的作用下，或进一步在封闭剂、多元醇渗透剂、表面活性剂、酶抑制剂、络合物等组分的作用下，不仅能够保证ProGRP抗原在2-8℃能实现长期液态保存，而且显著提升了ProGRP抗原在37℃液态保存的热稳定性。
由于上述ProGRP稀释液能够有效保证ProGRP的稳定性，使用上述ProGRP稀释液稀释ProGRP抗原获得的校准品或质控品热稳定性好，避免了现有稀释液只能在2-8℃保存或冻干品复溶后稳定性差，从而提高ProGRP检测方法特别是化学发光免疫分析法检测ProGRP的准确性、灵敏性、稳定性和重现性。当然也可以用该稀释液稀释待测样本，保证待测样本中ProGRP抗原的热稳定性。
另外，上述ProGRP稀释液的制备方法可以是将各组分制剂进行混合均匀即可。
另一方面，在上述ProGRP稀释液的基础上，本发明实施例提供了一种用于检测ProGRP的ProGRP校准品或质控品。在本实施例ProGRP校准品和ProGRP质控品中，包括ProGRP抗原和用于稀释所述ProGRP的稀释液。其中所述稀释液为上文所述的ProGRP稀释液，当然在被稀释的ProGRP抗原也是液态存在。另外，本实施例ProGRP校准品和ProGRP质控品中ProGRP抗原的浓度可以根据检测方法和实际需要灵活控制，如在一实施例中，该ProGRP校准品的中ProGRP低点校准品浓度可以但不限于47.230pg/mL，ProGRP高点校准品浓度可以但不限于2298.851pg/mL。在另一实施例中，ProGRP质控品1浓度范围可以但不限于49.0-91.0pg/mL，ProGRP质控品2浓度范围可以但不限于350.0-650.0pg/mL。
因此，上述ProGRP校准品和ProGRP质控品由于采用上文所述的ProGRP稀释液稀释ProGRP抗原，从而使得上述ProGRP校准品和ProGRP质控品不仅能够在2-8℃能实现长期液态保存，而且还在37℃液态稳定保存，克服了常规稀释液稀释的校准品或质控品仅仅能够在2-8℃保存或者冻干品复融后稳定性差的不足。
又一方面，在上述ProGRP稀释液的基础上，本发明实施例提供的一种ProGRP待测样本处理液。所述处理液为上文所述ProGRP稀释液。这样采用本实施例ProGRP待测样本处理液对待测样品进行稀释处理，从而保证待测样本中ProGRP抗原的稳定性，从而进一步提高ProGRP检测的结果准确性。特别是针对批量检查待测样本的情况，通过采用本实施例ProGRP待测样本处理液稀释处理待测样本，从而保证待测样本中如ProGRP抗原的稳定性，从而进一步保证检测结果的准确性。
又一方面，本发明实施例提供了一种ProGRP检测试剂盒。所述ProGRP检测试剂盒包括的试剂有：上文所述的ProGRP校准品和ProGRP质控品试剂，其中，ProGRP校准品可以包括上文所述的ProGRP低点校准品和ProGRP高点校准品；ProGRP质控品可以包括上文所述的ProGRP质控品1和ProGRP质控品2。这样，ProGRP校准品和ProGRP质控品试剂不仅能够在2-8℃能实现长期液态保存，而且还在37℃液态稳定保存，从而有效保证了本实施例试剂盒检测ProGRP的结果更准确，更稳定，重现性好。
当然，本实施例ProGRP检测试剂盒还可以配置用于ProGRP检测的其他试剂，以提高上述ProGRP检测试剂盒使用的便捷性，避免另外或者临时配制用于ProGRP检测的其他试剂。
如在一实施例中，上述ProGRP检测试剂盒还包括如下第一至第三任一组试剂：
第一组试剂：
包括抗ProGRP抗体标记的示踪标记物试剂、包被抗胃泌素释放肽前体抗体的磁性微球试剂。
其中，抗ProGRP抗体标记的示踪标记物试剂中的示踪标记物可以但不限于为金刚烷、鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶中的至少一种，优选为ABEI(N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺)。抗ProGRP抗体工作浓度为50ng/mL-5000ng/mL，示踪标记物工作浓度为5ng/mL-500ng/mL。其制备方法可以下文实施例21的制备方法制备获得。
包被抗胃泌素释放肽前体抗体的磁性微球试剂中抗ProGRP抗体工作浓度：1ug/mL-20ug/mL，磁性微球工作浓度：0.1mg/mL-2mg/mL。其制备方法可以下文实施例21的制备方法制备获得。
因此，在上述ProGRP检测试剂盒配置有上述第一组试剂时，该ProGRP检测试剂盒配置有如下试剂：
a.抗ProGRP抗体标记的示踪标记物：
抗ProGRP抗体工作浓度：50ng/mL-5000ng/mL；
示踪标记物工作浓度：5ng/mL-500ng/mL；
b.包被抗ProGRP抗体的磁性微球：
抗ProGRP抗体工作浓度：1ug/mL-20ug/mL；
磁性微球工作浓度：0.1mg/mL-2mg/mL；
c.ProGRP校准品：
ProGRP低点校准品的浓度为：47.230pg/mL；
高点校准品的浓度：2298.851pg/mL；
d.ProGRP质控品：
ProGRP质控品1的浓度：49.0-91.0pg/mL；
ProGRP质控品2的浓度：350.0-650.0pg/mL。
第二组试剂：
包括抗ProGRP抗体标记的示踪标记物试剂、生物素化的抗胃泌素释放肽前体抗体试剂、包被有链霉亲和素的磁性微球试剂；
其中，抗ProGRP抗体标记的示踪标记物试剂如上述第一组试剂中抗ProGRP抗体标记的示踪标记物试剂，其工作浓度和所含的示踪标记物可以相同或不同。
生物素化的抗胃泌素释放肽前体抗体试剂中生物素可以是常规的生物素。抗ProGRP抗体工作浓度为：50ng/mL-5000ng/mL，生物素的工作浓度为：5ng/mL-500ng/mL。其制备方法可以下文实施例210的制备方法制备获得。
包被有链霉亲和素的磁性微球试剂中的链霉亲和素的浓度为1ug/mL-20ug/mL，磁性微球的浓度为0.1mg/mL-2mg/mL。其制备方法可以下文实施例210的制备方法制备获得。
因此，在上述ProGRP检测试剂盒配置有上述第二组试剂时，该ProGRP检测试剂盒配置有如下试剂：
a.抗ProGRP抗体标记的示踪标记物：
抗ProGRP抗体工作浓度：50ng/mL-5000ng/mL；
示踪标记物工作浓度：5ng/mL-500ng/mL；
b.生物素化的抗ProGRP抗体：
抗ProGRP抗体工作浓度为：50ng/mL-5000ng/mL；
生物素的工作浓度为：5ng/mL-500ng/mL；
c.包被有链霉亲和素的磁性微球：
链霉亲和素的浓度为1ug/mL-20ug/mL；
磁性微球的浓度为0.1mg/mL-2mg/mL；
d.ProGRP校准品：
ProGRP低点校准品的浓度为：47.230pg/mL；
高点校准品的浓度：2298.851pg/mL；
e.ProGRP质控品：
ProGRP质控品1的浓度：49.0-91.0pg/mL；
ProGRP质控品2的浓度：350.0-650.0pg/mL。
第三组试剂：
包括抗ProGRP抗体标记的示踪标记物试剂、标记FITC的抗ProGRP抗体试剂、包被有FITC单抗或多抗的磁性微球试剂。
其中，抗ProGRP抗体标记的示踪标记物试剂如上述第一组试剂、第二组试剂中抗ProGRP抗体标记的示踪标记物试剂，其工作浓度和所含的示踪标记物可以相同或不同。
标记FITC的抗ProGRP抗体试剂中抗ProGRP抗体工作浓度为：50ng/mL-5000ng/mL，FITC的工作浓度为：5ng/mL-500ng/mL。其制备方法可以下文实施例211的制备方法制备获得。
包被有FITC单抗或多抗的磁性微球试剂中FITC单抗或多抗的浓度为1ug/mL-20ug/mL，磁性微球的浓度为0.1mg/mL-2mg/mL。其制备方法可以下文实施例211的制备方法制备获得。
因此，在上述ProGRP检测试剂盒配置有上述第三组试剂时，该ProGRP检测试剂盒配置有如下试剂：
a.抗ProGRP抗体标记的示踪标记物：
抗ProGRP抗体工作浓度：50ng/mL-5000ng/mL；
示踪标记物工作浓度：5ng/mL-500ng/mL；
b.标记FITC的抗ProGRP抗体：
抗ProGRP抗体工作浓度为：50ng/mL-5000ng/mL；
FITC的工作浓度为：5ng/mL-500ng/mL；
c.包被有FITC单抗或多抗的磁性微球：
FITC单抗或多抗的浓度为1ug/mL-20ug/mL；
磁性微球的浓度为0.1mg/mL-2mg/mL；
d.ProGRP校准品：
ProGRP低点校准品的浓度为：47.230pg/mL；
高点校准品的浓度：2298.851pg/mL；
e.ProGRP质控品：
ProGRP质控品1的浓度：49.0-91.0pg/mL；
ProGRP质控品2的浓度：350.0-650.0pg/mL。
在上述各实施例的基础上，上述抗胃泌素释放肽前体抗体包括但不限于是单克隆抗体或多克隆抗体，优选为单克隆抗体。
在上述各实施例的基础上，作为本发明的一实施例中，ProGRP检测试剂盒还可以配置稀释待测样本的稀释液，且所述稀释液为上文所述的ProGRP稀释液。这样，通过在本ProGRP检测试剂盒中配制上文所述的ProGRP稀释液，对待测样品进行稀释处理，从而保证待测样本中ProGRP抗原的稳定性，从而进一步提高上述各实施例中试剂盒检测ProGRP的结果准确性。特别是针对批量检查待测样本的情况，通过采用上述ProGRP稀释液稀释样本，从而保证待测样本中如ProGRP抗原的稳定性，从而进一步保证检测结果的准确性。
因此，上述ProGRP检测试剂盒检测ProGRP的结果更准确，更稳定，重现性好。
由上文所述可知，基于上文实施例中ProGRP稀释液、ProGRP校准品或质控品、ProGRP待测样本处理液和ProGRP检测试剂盒均能够保证的ProGRP的热稳定性，因此，其可以均可以在检测胃泌素释放肽前体中的应用，以提高ProGRP的稳定性和提高ProGRP检测的准确性。
现结合具体实例，对本发明实施例ProGRP稀释液及其应用和ProGRP检测试剂盒进行进一步详细说明。下述相应实施例中涉及到的材料来源如下：
磁性微球：新产业生物医学工程股份有限公司生产；80％粒径分布为1-5um，磁化强度为4000高斯时，沉淀时间为10-15s，BSA为30mg时蛋白吸附浓度为0.8mg-1.2mg；
ABEI：新产业生物医学工程股份有限公司生产；
Anti-ProGRP antibody：Meridian；
第一抗ProGRP抗体、第二抗ProGRP抗体：Meridian；
ProGRP抗原：Medix Biochemica；
BSA、链霉亲和素：BBI；
生物素、FITC：Sigma公司生产；
羊抗FITC多克隆抗体：美国Fitzgerald。
ProGRP稀释液实施例
实施例11
本实施例提供了一种ProGRP稀释液。所述ProGRP稀释液包含下表11中浓度的组分，测得pH值为5.5。其可以按照如下方法配制：
以1000mL抗原稀释液为例，组分的用量如下：
A液：0.1M柠檬酸稀释液(21.01g)
B液：0.1M柠檬酸钠稀释液(29.41g)
表11
配制浓度 用量
柠檬酸 297.5mL
柠檬酸钠 702.5mL
150mM NaCl 8.776g
0.15％Proclin 300 1.5mL
实施例12
本实施例提供了一种ProGRP稀释液。所述ProGRP稀释液包含下表12中中浓度的组分，测得pH值为4.5。其可以按照如下方法配制：
以1000mL抗原稀释液为例，组分的用量如下：
A液：0.1M柠檬酸稀释液(21.01g)
B液：0.1M柠檬酸钠稀释液(29.41g)
表12
配制浓度 用量
柠檬酸 542.5mL
柠檬酸钠 457.5mL
150mM NaCl 8.776g
0.15％Proclin 300 1.5mL
实施例13
本实施例提供了一种ProGRP稀释液。所述ProGRP稀释液包含下表13中浓度的组分，测得pH值为5.5。其可以按照如下方法配制：
以1000mL抗原稀释液为例，组分的用量如下：
A液：0.1M柠檬酸稀释液(21.01g)
B液：0.1M柠檬酸钠稀释液(29.41g)
表13
配制浓度 用量
柠檬酸 297.5mL
柠檬酸钠 702.5mL
150mM NaCl 8.776g
0.15％Proclin 300 1.5mL
0.1mg/mLPMSF 0.1g
实施例14
本实施例提供了一种ProGRP稀释液。所述ProGRP稀释液包含下表14中浓度的组分，测得pH值为5.5。其可以按照如下方法配制：
以1000mL抗原稀释液为例，组分的用量如下：
A液：0.1M柠檬酸稀释液(21.01g)
B液：0.1M柠檬酸钠稀释液(29.41g)
表14
配制浓度 用量
柠檬酸 297.5mL
柠檬酸钠 702.5mL
150mM NaCl 8.776g
0.15％Proclin 300 1.5mL
0.1mg/mL亮抑蛋白酶肽(leupeptin) 0.1g
实施例15
本实施例提供了一种ProGRP稀释液。所述ProGRP稀释液包含下表15中浓度的组分，测得pH值为5.5。其可以按照如下方法配制：
以1000mL抗原稀释液为例，组分的用量如下：
A液：0.1M柠檬酸稀释液(21.01g)
B液：0.1M柠檬酸钠稀释液(29.41g)
表15
配制浓度 用量
柠檬酸 297.5mL
柠檬酸钠 702.5mL
150mM NaCl 8.776g
0.15％Proclin 300 1.5mL
0.1mg/mLPMSF 0.1g
2％海藻糖 20.0g
实施例16
本实施例提供了一种ProGRP稀释液。所述ProGRP稀释液包含下表16中浓度的组分，测得pH值为5.5。其可以按照如下方法配制：
以1000mL抗原稀释液为例，组分的用量如下：
A液：0.1M柠檬酸稀释液(21.01g)
B液：0.1M柠檬酸钠稀释液(29.41g)
表16
配制浓度 用量
柠檬酸 297.5mL
柠檬酸钠 702.5mL
150mM NaCl 8.776g
0.15％Proclin 300 1.5mL
0.1mg/mLPMSF 0.1g
2％蔗糖 20.0g
实施例17
本实施例提供了一种ProGRP稀释液。所述ProGRP稀释液包含下表17中浓度的组分，测得pH值为5.5。其可以按照如下方法配制：
以1000mL抗原稀释液为例，组分的用量如下：
A液：0.1M柠檬酸稀释液(21.01g)
B液：0.1M柠檬酸钠稀释液(29.41g)
表17
配制浓度 用量
柠檬酸 297.5mL
柠檬酸钠 702.5mL
150mM NaCl 8.776g
0.15％Proclin 300 1.5mL
0.1mg/mLPMSF 0.1g
2％海藻糖 20.0g
0.1％EDTA-2K 1.0g
实施例18
本实施例提供了一种ProGRP稀释液。所述ProGRP稀释液包含下表18中浓度的组分，测得pH值为5.5。其可以按照如下方法配制：
以1000mL抗原稀释液为例，组分的用量如下：
A液：0.1M柠檬酸稀释液(21.01g)
B液：0.1M柠檬酸钠稀释液(29.41g)
表18
实施例19
本实施例提供了一种ProGRP稀释液。所述ProGRP稀释液包含下表19中浓度的组分，测得pH值为5.5。其可以按照如下方法配制：
以1000mL抗原稀释液为例，组分的用量如下：
A液：0.1M柠檬酸稀释液(21.01g)
B液：0.1M柠檬酸钠稀释液(29.41g)
表19
配制浓度 用量
柠檬酸 297.5mL
柠檬酸钠 702.5mL
150mM NaCl 8.776g
0.15％Proclin 300 1.5mL
0.1mg/mLPMSF 0.1g
2％海藻糖 20.0g
0.1％EDTA-2K 1.0g
1％BSA 10.0g
0.05％Tween-20 0.5mL
实施例110
本实施例提供了一种ProGRP稀释液。所述ProGRP稀释液包含下表110中浓度的组分，测得pH值为5.5。其可以按照如下方法配制：
以1000mL抗原稀释液为例，组分的用量如下：
A液：0.1M柠檬酸稀释液(21.01g)
B液：0.1M磷酸氢二钠稀释液(15.60g)
具体如下表110。
表110
配制浓度 用量
柠檬酸 587ml
磷酸氢二钠 413mL
150mM NaCl 8.776g
0.15％Proclin 300 1.5mL
0.1mg/mLPMSF 0.1g
2％海藻糖 20.0g
0.1％EDTA-2K 1.0g
1％BSA 10.0g
0.05％Tween-20 0.5mL
ProGRP检测试剂盒
实施例21
本实施例提供了一种ProGRP检测试剂盒。ProGRP检测试剂盒配置如下：
a.抗ProGRP单克隆抗体标记的ABEI：抗ProGRP单克隆抗体工作浓度:1250ng/mL；ABEI工作浓度:125ng/mL；
b.包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球：抗ProGRP单克隆抗体浓度:10ug/mL；磁性微球浓度:1mg/mL；
c.ProGRP校准品：低点校准品，浓度:47.230pg/mL；高点校准品，浓度:2298.851pg/mL；
d.ProGRP质控品：ProGRP质控品1，浓度：70.0pg/mL；ProGRP质控品2，浓度：500.0pg/mL。
其中，a试剂中的抗ProGRP单克隆抗体标记的ABEI按照如下方法制备：
透析液(F溶液)的配制：在5000mL烧杯中加入Na2CO314.31g，NaHCO326.46g，加水定容至4500mL；配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。选用截留量为14000的透析袋，量取合适的尺寸，取1mg ProGRP单抗或多抗用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1mL，放入透析液中，透析2小时，搅拌速度400rpm。将透析好的溶液装入西林瓶中(每瓶1mL)，加入300μg ABEI-半琥珀酰胺酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯，37℃反应2小时，得到标记ABEI的ProGRP抗体溶液；安装好G-25凝胶柱，用纯化水洗脱干净后，再用pH值7.4的PBS缓冲液对反应溶液进行平衡洗脱；凝胶柱平衡洗脱完毕后，将标记好ABEI的ProGRP抗体溶液过柱纯化，然后收集出现峰值的溶液。将收集好的蛋白溶液，加入等体积的含0.5g/mL的BSA的保护液，可得到中间品。
b试剂中的抗ProGRP抗体包被磁性微球按照如下方法制备：
此制备步骤使用的免疫磁性微球选择Snibe公司生产的浓度为100mg/mL，羟基为95mgKOH/g的纳米磁性微球悬浮液。
A溶液的配制(pH3.6醋酸缓冲液)：称取2.55g三水合乙酸钠，用4500mL纯化水溶解，再加入14mL乙酸，混匀后，用纯化水定容至5000mL(pH3.6)；
将磁性微球中悬浮于5倍于包被体积的上述pH3.6醋酸缓冲液，使磁球浓度为20mg/mL；再加入1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(CMC)，使其浓度为10mg/mL；按所得溶液与ProGRP单克隆抗体的重量比为1mg：8μg的比例加入纯化的ProGRP单克隆抗体，放入恒温震荡水浴箱中37℃反应12小时；以0.1mol/l的PBS缓冲液:纯化水＝1:9的体积比配制pH为7.4的PBS缓冲液500mL，加入2.5g BSA混匀溶解，即为磁珠清洗液。将温浴好的磁性微球倒入烧杯中，然后置于磁铁上沉淀后，倒掉上清，加入5倍体积的磁性微球清洗液搅拌清洗，然后放置在磁铁上，待上清液清亮后倒掉上清液，重复该清洗步骤四次。磁性微球的悬浮：将清洗后的磁性微球加入包被体积的BSA水溶液(5g/L，含1g/L叠氮钠)，得到磁性微球悬浮液中，悬浮浓度为20mg/mL，此悬浮液体积即为此制备步骤所述的包被体积。
c试剂中的ProGRP校准品按照如下方法制备：
用上述实施例11提供的ProGRP稀释液将ProGRP抗原分别稀释到2298.851pg/mL和47.230pg/mL，分别配制成为ProGRP高点校准品和ProGRP低点校准品。
d试剂中的ProGRP质控品按照如下方法制备：
用上述实施例11提供的ProGRP稀释液将ProGRP抗原分别稀释到70pg/mL和500pg/mL，分别配制成为ProGRP质控品1和ProGRP质控品2。
实施例22
本实施例提供了一种ProGRP检测试剂盒。ProGRP检测试剂盒配置如下：
a.抗ProGRP单克隆抗体标记的ABEI：抗ProGRP单克隆抗体工作浓度:1250ng/mL；ABEI工作浓度:125ng/mL；
b.包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球：抗ProGRP单克隆抗体浓度:10ug/mL；磁性微球浓度:1mg/mL；
c.ProGRP校准品：低点校准品，浓度:47.230pg/mL；高点校准品，浓度:2298.851pg/mL；
d.ProGRP质控品：ProGRP质控品1，浓度：70.0pg/mL；ProGRP质控品2，浓度：500.0pg/mL。
其中，包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球、包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球均如实施例21试剂盒中试剂a、b；c试剂ProGRP校准品和d试剂ProGRP质控品的稀释剂均为上述实施例12提供的稀释液。
实施例23
本实施例提供了一种ProGRP检测试剂盒。ProGRP检测试剂盒配置如下：
a.抗ProGRP单克隆抗体标记的ABEI：抗ProGRP单克隆抗体工作浓度:1250ng/mL；ABEI工作浓度:125ng/mL；
b.包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球：抗ProGRP单克隆抗体浓度:10ug/mL；磁性微球浓度:1mg/mL；
c.ProGRP校准品：低点校准品，浓度:47.230pg/mL；高点校准品，浓度:2298.851pg/mL；
d.ProGRP质控品：ProGRP质控品1，浓度：70.0pg/mL；ProGRP质控品2，浓度：500.0pg/mL。
其中，包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球、包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球均如实施例21试剂盒中试剂a、b；c试剂ProGRP校准品和d试剂ProGRP质控品的稀释剂均为上述实施例13提供的稀释液。
实施例24
本实施例提供了一种ProGRP检测试剂盒。ProGRP检测试剂盒配置如下：
a.抗ProGRP单克隆抗体标记的ABEI：抗ProGRP单克隆抗体工作浓度:1250ng/mL；ABEI工作浓度:125ng/mL；
b.包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球：抗ProGRP单克隆抗体浓度:10ug/mL；磁性微球浓度:1mg/mL；
c.ProGRP校准品：低点校准品，浓度:47.230pg/mL；高点校准品，浓度:2298.851pg/mL；
d.ProGRP质控品：ProGRP质控品1，浓度：70.0pg/mL；ProGRP质控品2，浓度：500.0pg/mL。
其中，包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球、包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球均如实施例21试剂盒中试剂a、b；c试剂ProGRP校准品和d试剂ProGRP质控品的稀释剂均为上述实施例14提供的稀释液。
实施例25
本实施例提供了一种ProGRP检测试剂盒。ProGRP检测试剂盒配置如下：
a.抗ProGRP单克隆抗体标记的ABEI：抗ProGRP单克隆抗体工作浓度:1250ng/mL；ABEI工作浓度:125ng/mL；
b.包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球：抗ProGRP单克隆抗体浓度:10ug/mL；磁性微球浓度:1mg/mL；
c.ProGRP校准品：低点校准品，浓度:47.230pg/mL；高点校准品，浓度:2298.851pg/mL；
d.ProGRP质控品：ProGRP质控品1，浓度：70.0pg/mL；ProGRP质控品2，浓度：500.0pg/mL。
其中，包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球、包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球均如实施例21试剂盒中试剂a、b；c试剂ProGRP校准品和d试剂ProGRP质控品的稀释剂均为上述实施例15提供的稀释液。
实施例26
本实施例提供了一种ProGRP检测试剂盒。ProGRP检测试剂盒配置如下：
a.抗ProGRP单克隆抗体标记的ABEI：抗ProGRP单克隆抗体工作浓度:1250ng/mL；ABEI工作浓度:125ng/mL；
b.包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球：抗ProGRP单克隆抗体浓度:10ug/mL；磁性微球浓度:1mg/mL；
c.ProGRP校准品：低点校准品，浓度:47.230pg/mL；高点校准品，浓度:2298.851pg/mL；
d.ProGRP质控品：ProGRP质控品1，浓度：70.0pg/mL；ProGRP质控品2，浓度：500.0pg/mL。
其中，包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球、包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球均如实施例21试剂盒中试剂a、b；c试剂ProGRP校准品和d试剂ProGRP质控品的稀释剂均为上述实施例16提供的稀释液。
实施例27
本实施例提供了一种ProGRP检测试剂盒。ProGRP检测试剂盒配置如下：
a.抗ProGRP单克隆抗体标记的ABEI：抗ProGRP单克隆抗体工作浓度:1250ng/mL；ABEI工作浓度:125ng/mL；
b.包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球：抗ProGRP单克隆抗体浓度:10ug/mL；磁性微球浓度:1mg/mL；
c.ProGRP校准品：低点校准品，浓度:47.230pg/mL；高点校准品，浓度:2298.851pg/mL；
d.ProGRP质控品：ProGRP质控品1，浓度：70.0pg/mL；ProGRP质控品2，浓度：500.0pg/mL。
其中，包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球、包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球均如实施例21试剂盒中试剂a、b；c试剂ProGRP校准品和d试剂ProGRP质控品的稀释剂均为上述实施例17提供的稀释液。
实施例28
本实施例提供了一种ProGRP检测试剂盒。ProGRP检测试剂盒配置如下：
a.抗ProGRP单克隆抗体标记的ABEI：抗ProGRP单克隆抗体工作浓度:1250ng/mL；ABEI工作浓度:125ng/mL；
b.包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球：抗ProGRP单克隆抗体浓度:10ug/mL；磁性微球浓度:1mg/mL；
c.ProGRP校准品：低点校准品，浓度:47.230pg/mL；高点校准品，浓度:2298.851pg/mL；
d.ProGRP质控品：ProGRP质控品1，浓度：70.0pg/mL；ProGRP质控品2，浓度：500.0pg/mL。
其中，包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球、包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球均如实施例21试剂盒中试剂a、b；c试剂ProGRP校准品和d试剂ProGRP质控品的稀释剂均为上述实施例18提供的稀释液。
实施例29
本实施例提供了一种ProGRP检测试剂盒。ProGRP检测试剂盒配置如下：
a.抗ProGRP单克隆抗体标记的ABEI：抗ProGRP单克隆抗体工作浓度:1250ng/mL；ABEI工作浓度:125ng/mL；
b.包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球：抗ProGRP单克隆抗体浓度:10ug/mL；磁性微球浓度:1mg/mL；
c.ProGRP校准品：低点校准品，浓度:47.230pg/mL；高点校准品，浓度:2298.851pg/mL；
d.ProGRP质控品：ProGRP质控品1，浓度：70.0pg/mL；ProGRP质控品2，浓度：500.0pg/mL。
其中，包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球、包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球均如实施例21试剂盒中试剂a、b；c试剂ProGRP校准品和d试剂ProGRP质控品的稀释剂均为上述实施例19提供的稀释液。
实施例210
本实施例提供了一种ProGRP检测试剂盒。ProGRP检测试剂盒配置如下：
a.抗ProGRP单克隆抗体标记的ABEI：抗ProGRP单克隆抗体工作浓度:1250ng/mL；ABEI工作浓度:125ng/mL；
b.生物素标记的抗ProGRP单克隆抗体：抗ProGRP单克隆抗体浓度:1ug/mL，生物素浓度:100ng/mL；
c.链霉亲和素包被的磁性微球：链霉亲和素工作浓度10ug/mL，磁球浓度:1ug/mL；
d.ProGRP校准品：低点校准品，浓度:47.230pg/mL；高点校准品，浓度:2298.851pg/mL；
e.ProGRP质控品：ProGRP质控品1，浓度：70.0pg/mL；ProGRP质控品2，浓度：500.0pg/mL。
其中，包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球如实施例21试剂盒中试剂a的制备，d试剂ProGRP校准品和e试剂ProGRP质控品的稀释剂均为上述实施例19提供的稀释液。
b试剂生物素标记的抗ProGRP单克隆抗体按照如下方法制备：
透析液(F溶液)的配制：在5000mL烧杯中加入Na2CO314.31g，NaHCO3126.46g，加纯化水定容至4500mL，配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。选用截留量为14000的透析袋，量取合适的尺寸，去1mg抗ProGRP单克隆抗体用0.1M pH9.5的碳酸盐缓冲液(F溶液)调整到1mL，倒入透析袋中，扎紧透析袋的另一端，放入透析液中，透析2h，搅拌速度400rpm；将活化的生物素溶于DMF中，按照生物素与抗ProGRP单克隆抗体的摩尔比为20:1的比例将二者混合反应2h。将反应后的液体用0.1M PBS于4℃透析24h，即制成生物素标记的抗ProGRP抗体中间品。
c试剂链霉亲和素包被的磁性微球按照如下方法制备:
此制备步骤使用的免疫磁性微球选择Snibe公司生产的浓度为100mg/mL，羟基为95mg KOH/g的纳米磁性微球悬浮液。
A溶液的配制(pH3.6醋酸缓冲液)：称取2.55g三水合乙酸钠，用4500mL纯化水溶解，再加入14mL乙酸，混匀后，用纯化水定容至5000mL(pH3.6)；将磁性微球加入与包被体积等量的上述pH3.6醋酸缓冲液悬浮，使磁性微球浓度为20mg/mL，再加入CMC(使其浓度为10mg/mL)，按所得溶液与链霉亲和素的重量比为1mg：12μg的比例加入链霉亲和素，放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时；磁性微球清洗液的配制：以0.1mol/l的PBS缓冲液:纯化水＝1:9的体积比配制pH为7.4的PBS缓冲液500mL，加入2.5g BSA混匀溶解，即为磁珠清洗液；将温浴好的磁性微球倒入烧杯中，然后置于磁铁上沉淀后，倒掉上清，加入5倍体积的磁性微球清洗液搅拌清洗，然后放置在磁铁上，待上清液清亮后倒掉上清液，重复该清洗步骤四次；磁性微球的悬浮：将清洗后的磁性微球加入包被体积的BSA水溶液(5g/L，含1g/L叠氮钠)，得到磁性微球悬浮液中，悬浮浓度为20mg/mL，即为包被有链霉亲和素的磁球的悬溶液。
实施例211
本实施例提供了一种ProGRP检测试剂盒。ProGRP检测试剂盒配置如下：
a.抗ProGRP单克隆抗体标记的ABEI：抗ProGRP单克隆抗体工作浓度:1250ng/mL；ABEI工作浓度:125ng/mL；
b.FITC标记的抗ProGRP单克隆抗体：抗ProGRP单克隆抗体浓度:1ug/mL，FITC工作浓度:100ng/mL；
c.抗FITC抗体包被的磁性微球：抗FITC抗体浓度10ug/mL，磁球浓度:1ug/mL；
d.ProGRP校准品：低点校准品，浓度:47.230pg/mL；高点校准品，浓度:2298.851pg/mL；
e.ProGRP质控品：ProGRP质控品1，浓度：70.0pg/mL；ProGRP质控品2，浓度：500.0pg/mL。
其中，包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球如实施例21试剂盒中试剂a的制备，d试剂ProGRP校准品和e试剂ProGRP质控品的稀释剂均为上述实施例19提供的稀释液。
b FITC标记的抗ProGRP单克隆抗体按照如下方法制备：
透析液(F溶液)的配制：在5000mL烧杯中加入Na2CO314.31g，NaHCO326.46g，加水定容至4500mL。配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。选用截留量为14000的透析袋，量取合适的尺寸，取1mg的ProGRP单抗或多抗用0.1mol/LpH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1mL，倒入透析袋中，扎紧透析袋另一端，放入透析液中，透析2小时(搅拌速度400rpm)；透析好的溶液装入西林瓶中(每瓶1mL)，加入100μgFITC，室温反应2.5小时，得到标记ProGRP单抗或多抗的FITC溶液；配制pH7.4PBS缓冲液作为层析柱的平衡液；层析柱用纯化水冲洗24小时后，连接平衡液与层析柱平衡30分钟；放干上表面液体，加入上述标记ProGRP单抗或多抗的FITC溶液，再次放干表面液体。加入适量平衡液，连通上下管道，下方连接核酸蛋白检测仪(纯化前预热2小时)调整光亮和精确度。调零，收集峰值时间段的液体，即为所需要的标记ProGRP单抗或多抗的FITC溶液。
c试剂抗FITC抗体包被的磁性微球按照如下方法制备：
此制备步骤使用的免疫磁性微球选择Snibe公司生产的浓度为100mg/mL，羟基数为95mg KOH/g的纳米磁性微球悬浮液。
A溶液的配制(pH3.6醋酸缓冲液)：称取2.55g三水合乙酸钠，用4500mL纯化水溶解，再加入14mL乙酸，混匀后，用纯化水定容至5000mL(pH3.6)；将磁性微球加入与包被体积等量的pH3.6醋酸缓冲液悬浮，使磁性微球浓度为20mg/mL，再加入CMC，使其浓度为10mg/mL，按所得溶液与FITC单抗或多抗的重量比为1mg：8μg的比例加入FITC单抗或多抗，放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时；磁性微球清洗液的配制：以0.1mol/l的PBS缓冲液:纯化水＝1:9的体积比配制pH为7.4的PBS缓冲液500mL，加入2.5g BSA混匀溶解，即为磁珠清洗液；将温浴好的磁性微球倒入烧杯中，然后置于磁铁上沉淀后，倒掉上清，加入5倍体积的磁性微球清洗液搅拌清洗，然后放置在磁铁上，待上清液清亮后倒掉上清液，重复该清洗步骤四次；磁性微球的悬浮：将清洗后的磁性微球加入包被体积的BSA水溶液(5g/L，含1g/L叠氮钠)，得到磁性微球悬浮液，悬浮浓度为20mg/mL，即为包被有FITC单抗或多抗的磁球的悬溶液。
实施例212
本实施例提供了一种ProGRP检测试剂盒。ProGRP检测试剂盒配置如下：
a.抗ProGRP单克隆抗体标记的ABEI：抗ProGRP单克隆抗体工作浓度:1250ng/mL；ABEI工作浓度:125ng/mL；
b.包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球：抗ProGRP单克隆抗体浓度:10ug/mL；磁性微球浓度:1mg/mL；
c.ProGRP校准品：低点校准品，浓度:47.230pg/mL；高点校准品，浓度:2298.851pg/mL；
d.ProGRP质控品：ProGRP质控品1，浓度：70.0pg/mL；ProGRP质控品2，浓度：500.0pg/mL。
其中，包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球、包被抗ProGRP单克隆抗体的磁性微球均如实施例21试剂盒中试剂a、b；c试剂ProGRP校准品和d试剂ProGRP质控品的稀释剂均为上述实施例110提供的稀释液。
对比例1
本对比例1提供了一种ProGRP检测试剂盒。ProGRP检测试剂盒配置的试剂如同上述实施例21提供的ProGRP检测试剂盒所配置的试剂。不同之处在于，本对比例1配置的ProGRP校准品和ProGRP质控品的稀释液如下述表20所示的稀释液。
以1000mL抗原稀释液为例，对比例1’所示的稀释液各组分的用量如下：
A液：0.1mol/LNaH2PO4
B液：0.1mol/LNa2HPO4
表20
配制浓度 用量
NaH2PO4 200mL
Na2HPO4 800mL
150mM NaCl 8.776g
0.15％Proclin 300 1.5mL
对比例2
本对比例2提供了一种ProGRP检测试剂盒。ProGRP检测试剂盒配置的试剂如同上述实施例21提供的ProGRP检测试剂盒所配置的试剂。不同之处在于，本对比例2配置的ProGRP校准品和ProGRP质控品的稀释液如下述表21所示的稀释液。
以1000mL抗原稀释液为例，对比例2’所示的稀释液各组分的用量如下：
A液：0.1mol/LNaH2PO4
B液：0.1mol/LNa2HPO4
具体如下表21。
表21
配制浓度 用量
NaH2PO4 200mL
Na2HPO4 800mL
1％BSA 10.0g
2％海藻糖 20.0g
0.05％Tween-20 0.5mL
100ug/mL PMSF 0.1g
0.1％EDTA-2K 1.0g
150mM NaCl 8.776g
0.15％Proclin 300 1.5mL
实验方法、数据和结果分析
1.实验内容：
以上实施例11-110和对比例1-2提供的ProGRP稀释液将ProGRP抗原校准品配制到相同的浓度。分别在37℃条件下保存，连续监测7天测定每天的光强度RLU，评价ProGRP抗原在各种稀释液中的37℃加速热稳定性。
为了验证上述实施例21-212提供的ProGRP检测试剂盒和对比例1、对比例2提供的ProGRP检测试剂盒与临床阳性样本检测结果的情况，在合作医院收集了340例已确诊为小细胞肺癌的样本，采用上述实施例21-212提供的ProGRP检测试剂盒和对比例1、对比例2提供的ProGRP检测试剂盒和ProGRP检测方法分别定量检测样本中ProGRP的含量。
ProGRP的检测方法：利用新产业生物医学工程股份有限公司的Maglumi系列全自动化学发光测定仪测量；100uL样本(或校准品/质控品)、15uL磁性微球、50uL缓冲液混合，温育10分钟，通过磁分离清洗去除未结合的物质；再加入200uL的抗ProGRP抗体标记的ABEI，温育10min；通过磁分离，去除上清液，加入400uL清洗液清洗三次；加入化学发光激发物，监测3秒钟内发出的相对光强度(RLU)；可通过建立的标准曲线计算样本测定值。
分析灵敏度的检验：分析灵敏度的测定方法参考美国临床实验室标准化协会(CLSI)颁发的《EP17-A2—检测能力评估指导原则》，以所配制的稀释液(空白样本)作为待测样本，重复测定20次，根据测量结果的均值和标准差计算分析灵敏度(M+2SD)。分析灵敏度为测试结果的均值加上两倍的标准差，即为M+2SD。
2.检测结果和分析
37℃加速热稳定实验结果测得结果如下述表22所示。
表22 37℃加速热稳定实验结果
天数 1 2 3 4 5 6 7
实验 RLU RLU RLU RLU RLU RLU RLU
实施例11 515623 492652 457802 442736 425589 411996 388846
实施例12 518297 468198 423822 396401 348397 302604 269656
实施例13 515777 505461 475538 463231 439439 397921 359935
实施例14 520368 469929 442156 412165 384208 345849 343525
实施例15 517668 486447 464776 462382 439506 412999 390125
实施例16 515445 505146 472753 443365 414499 386292 378573
实施例17 515361 517861 511657 493370 478668 465825 453327
实施例18 516161 494623 495573 494558 493055 492045 485668
实施例19 515295 502977 488951 487479 490862 467895 448330
实施例110 512571 497973 487137 451284 415037 388076 354670
对比例1 517452 477008 425682 377920 330997 303604 266746
对比例2 516613 489579 458496 417020 383950 341362 306038
由表22可知，对比实施例11与对比例1，ProGRP抗原在实施例11的稀释液中加速热稳定性比对比例1好，具体如图1所示。由图1和表22表明柠檬酸盐的缓冲液比单一种磷酸盐的缓冲液能提高ProGRP抗原的热稳定性，更适合保存ProGRP抗原。
由表22可知，对比实施例11和实施例19，ProGRP抗原在实施例19的稀释液中加速热稳定性比实施例11好。表明了酶抑制剂、渗透剂、络合剂、封闭剂、表面活性剂的加入对基础的只含有缓冲对、无机盐、防腐剂的稀释液更有效的保存胃泌素释放肽前体抗原。
由表22可知，对比实施例11与实施例12，ProGRP抗原在实施例11的稀释液中加速热稳定性比实施例12好，具体如图2所示。表明pH5.5的柠檬酸的缓冲液比pH4.5的柠檬酸缓冲液能提高ProGRP抗原的热稳定性，更适合保存ProGRP抗原。
由表22可知，对比实施例13与实施例14，ProGRP抗原在实施例13的稀释液中加速热稳定性比实施例14好，具体如图3所示。表明含PMSF的柠檬酸缓冲液比含亮抑蛋白酶肽的柠檬酸缓冲液能提高ProGRP抗原的热稳定性，更适合保存ProGRP抗原。
由表22可知，对比实施例15与实施例16，ProGRP抗原在实施例15的稀释液中加速热稳定性比实施例16好，具体如图4所示。表明含海藻糖的柠檬酸缓冲液比含蔗糖的柠檬酸缓冲液能提高ProGRP抗原的热稳定性，更适合保存ProGRP抗原。
由表22可知，对比实施例17至实施例19，添加更多保护组分的缓冲液能进一步优化ProGRP抗原的稳定性，如图5所示。
由表22和图1至图5可知，本实施例ProGRP抗原的稀释液，包括柠檬酸缓冲对、无机盐、防腐剂、酶抑制剂、渗透剂、络合剂、封闭剂、表面活性剂，可有效提高抗原保存稳定性，用于稀释配制试剂盒校准品和质控品，保证试剂盒的有效和准确应用。
对在合作医院收集的340例已确诊为小细胞肺癌样本的ProGRP的含量检测结果如下表23所示。
表23诊断灵敏度结果
由表23可知，实施例21至实施例212和与对比例1、2对比结果表明，本实施例提供的含有柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-磷酸氢二钠中一种或两种缓冲液的稀释液比单一磷酸盐稀释液用于胃泌素释放肽前体的检测，诊断分析灵敏度要好。进一步对比实施例21和实施例29对比结果表明，实施例19提供的稀释液比实施例11提供的稀释液能进一步提高胃泌素释放肽前体试剂盒检测的诊断灵敏度。
分析灵敏度的检验结果如下表24所示。
表24分析灵敏度结果
由表24可知，实施例21和实施例29与对比例1和比例2对比结果表明，本实施例提供的含有柠檬酸-柠檬酸钠的稀释液比单一磷酸盐稀释液用于胃泌素释放肽前体的检测，分析灵敏度要好。实施例21和实施例29对比结果表明，实施例19提供的稀释液比实施例表11提供的稀释液能进一步提高胃泌素释放肽前体试剂盒检测的灵敏度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种胃泌素释放肽前体稀释液，其特征在于，包含如下组分：
柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-磷酸氢二钠中一种或两种缓冲液0.01-0.5mol/L
无机盐 50-500mmol/L
防腐剂 0.01-0.5％w/w。
2.根据权利要求1所述的胃泌素释放肽前体稀释液，其特征在于：所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，所述柠檬酸与柠檬酸钠的摩尔比为1:0.5-1:4；
所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，所述柠檬酸与磷酸氢二钠的摩尔比为1:0.5-1:3。
3.根据权利要求1或2所述的胃泌素释放肽前体稀释液，其特征在于：所述无机盐为NaCl、KCl、MgCl2中的任一种或两种以上的混合物；
所述防腐剂为叠氮钠、叠氮锂、对羟基苯甲酸酯类、苯甲酸、苯甲酸盐类、山梨酸盐类、亚硝酸钠、Proclin 300、Proclin 950中的任一种或两种以上的混合物。
4.根据权利要求1或2所述的胃泌素释放肽前体稀释液，其特征在于：还包括0.01-10％w/w封闭剂、1-20％w/w多元醇渗透剂、0.01-2.00％v/v表面活性剂、20-200ug/mL酶抑制剂、0.01-5％w/w络合物中的至少一种组分。
5.根据权利要求4所述的胃泌素释放肽前体稀释液，其特征在于：所述封闭剂为BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶中的任一种或两种以上的混合物；
所述多元醇渗透剂为乙二醇、丙三醇、蔗糖、海藻糖、PEG 2000、PEG 4000、PEG 6000、PEG 8000中的任一种或两种以上的混合物；
所述表面活性剂为非离子表面活性剂；
所述酶抑制剂为抑肽酶、胃蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制、亮抑蛋白酶肽、苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸、N-甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲基酮、苯丙胺酰氯甲酮、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐中的任一种或两种以上的混合物；
所述络合物为含氨基二乙酸络合剂。
6.一种胃泌素释放肽前体校准品或质控品，包括胃泌素释放肽前体抗原和用于稀释所述胃泌素释放肽前体抗原的稀释液，其特征在于：所述稀释液为权利要求1-5任一所述的胃泌素释放肽前体稀释液。
7.一种胃泌素释放肽前体待测样本处理液，其特征在于：所述处理液为权利要求1-5任一所述的胃泌素释放肽前体稀释液。
8.一种胃泌素释放肽前体检测试剂盒，包括胃泌素释放肽前体校准品、胃泌素释放肽前体质控品，其特征在于：所述胃泌素释放肽前体校准品和胃泌素释放肽前体质控品为权利要求6所述的胃泌素释放肽前体校准品和质控品。
9.根据权利要求8所述的胃泌素释放肽前体检测试剂盒，其特征在于，还包括如下第一至第三任一组试剂：
第一组试剂，包括抗胃泌素释放肽前体抗体标记的示踪标记物试剂、包被抗胃泌素释放肽前体抗体的磁性微球试剂；
第二组试剂，包括抗胃泌素释放肽前体抗体标记的示踪标记物试剂、生物素化的抗胃泌素释放肽前体抗体试剂、包被有链霉亲和素的磁性微球试剂；
第三组试剂，包括抗胃泌素释放肽前体抗体标记的示踪标记物试剂、标记FITC的抗胃泌素释放肽前体抗体试剂、包被有FITC单抗或多抗的磁性微球试剂。
10.根据权利要求9所述的胃泌素释放肽前体检测试剂盒，其特征在于：所述胃泌素释放肽前体质控品包括第一胃泌素释放肽前体质控品和第二胃泌素释放肽前体质控品，且所述第一胃泌素释放肽前体质控品的浓度为49.0-91.0pg/mL，所述第二胃泌素释放肽前体质控品的浓度为350.0-650.0pg/mL；
所述抗胃泌素释放肽前体抗体标记的示踪标记物试剂中的抗胃泌素释放肽前体抗体浓度为50ng/mL-5000ng/mL，示踪标记物浓度为5ng/mL-500ng/mL；
所述包被抗胃泌素释放肽前体抗体的磁性微球试剂中的抗胃泌素释放肽前体抗体的浓度为1ug/mL-20ug/mL，磁性微球的浓度为0.1mg/mL-2mg/mL；
所述生物素化的抗胃泌素释放肽前体抗体试剂中的抗胃泌素释放肽前体抗体浓度为50ng/mL-5000ng/mL，生物素浓度为5ng/mL-500ng/mL；
所述包被有链霉亲和素的磁性微球试剂中的链霉亲和素浓度为1ug/mL-20ug/mL，磁性微球浓度为0.1mg/mL-2mg/mL；
所述标记FITC的抗胃泌素释放肽前体抗体试剂中的抗胃泌素释放肽前体抗体浓度为50ng/mL-5000ng/mL，所述FITC浓度为5ng/mL-500ng/mL；
所述包被有FITC单抗或多抗的磁性微球试剂中的FITC单抗或多抗浓度为1ug/mL-20ug/mL，磁性微球的浓度为0.1mg/mL-2mg/mL。
11.根据权利要求9或10所述的胃泌素释放肽前体检测试剂盒，其特征在于：所述示踪标记物为金刚烷、鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶中的至少一种。
12.根据权利要求8-11任一所述的胃泌素释放肽前体检测试剂盒，其特征在于：还包括用于稀释待测样本的稀释液，所述稀释液为权利要求1-5任一所述的胃泌素释放肽前体稀释液或权利要求7所述的胃泌素释放肽前体待测样本处理液。
13.一种权利要求1-5任一所述的胃泌素释放肽前体稀释液、权利要求6所述的胃泌素释放肽前体校准品或质控品、权利要求7所述的胃泌素释放肽前体待测样本处理液或权利要求8-12所述的胃泌素释放肽前体检测试剂盒在检测胃泌素释放肽前体中的应用。
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