WO2023201840A1 - 一种免疫层析检测通用的样本稀释液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种免疫层析检测通用的样本稀释液及其制备方法。该免疫层析检测通用的样本稀释液包括以下质量/体积比的组分：6％-12％酪蛋白、2％-20％表面活性剂、1％-20％防腐剂、5％-20％海藻糖、0.5％-1％氯化钠、1％-10％阻断剂和0.04mol/L-0.06mol/L HEPES缓冲溶液。该样本稀释液可通用于不同检测项目，其具有通用性强、检测灵敏度高的优点；该制备方法简易可行，可进行大规模工业化生产。
Description
本申请涉及免疫检测技术领域，更具体地说，它涉及一种免疫层析检测通用的样本稀释液及其制备方法。
目前动物疾病检测产品的样本稀释液呈现多样化，每个厂家的样本稀释液成分不同，而且同一个厂家的不同检测项目的样本稀释液成分也有所不同。这导致了使用一个样本进行多项目检测时需要增加稀释步骤，样本量需求增多。并且，不同试剂盒样本稀释液通常仅针对特定待检物来源样品有效，对其它来源的抗原未必有效，这导致实际检测使用其他类型的样本时灵敏度低、敏感性不好，甚至出现非特异反应，并且影响检测速度，严重时会使病情恶化或导致病毒肆意传播。
有鉴于此，在本领域中仍然需要提供一种免疫层析检测通用的样本稀释液。
发明内容
为此，本申请提供一种免疫层析检测通用的样本稀释液，使样本稀释液能够检测不同类型的样本，同时达到灵敏度高的效果。
第一方面，本申请提供的一种免疫层析检测通用的样本稀释液采用如下的技术方案：
一种免疫层析检测通用的样本稀释液，包括以下质量/体积比(g/ml)组分：6％-12％酪蛋白、2％-20％表面活性剂、1％-20％防腐剂、5％-20％海藻糖、0.5％-1％氯化钠、1％-10％阻断剂和 0.04mol/L-0.06mol/L HEPES缓冲溶液。
通过采用上述技术方案，HEPES缓冲溶液稳定性好，其浓度在0.04mol/L-0.06mol/L区间时，对细胞没有任何毒性，而且由该缓冲溶液制得的样本稀释液敏感性较强。酪蛋白作为封闭剂，抗原通过与酪蛋白封闭液一起孵育，表面自由空间被酪蛋白封闭液饱和，减少检测抗体与抗原表面的非特异性结合，实现较高的信噪比，使检测达到更佳的灵敏度。表面活性剂在该范围下能够保护蛋白质，协同HEPES缓冲溶液维持蛋白质的稳定性。防腐剂在具有广谱抗菌活性，能在较长的时间内抑制细菌、真菌和酵母菌等微生物的生长，当其与HEPES溶液复配时，能够减少体系的pH值波动幅度。海藻糖作为一种典型应激代谢物，能够在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏。氯化钠是HEPES缓冲溶液的最佳复配物，其能够最大程度的维持细胞的渗透压和酸碱平衡；阻断剂用于避免病毒与样本稀释液结合后出现假阳性的情况，保证结果的准确性。
可选的，所述样本稀释液包括：0.05mol/L HEPES缓冲溶液、10％酪蛋白、2.2％表面活性剂、1％防腐剂、5％海藻糖、0.9％氯化钠和1％阻断剂。
通过上述技术方案，各组分在该限值下，其混合复配后制得的样本稀释液灵敏度最高、敏感性最强，检测速度最快。
可选的，所述表面活性剂为吐温80、曲拉通、S24和十二烷基环酸钠中的其中一种；优选为S24。
通过上述技术方案，S24作为非离子型表面活性剂，在低温条件 下仍然具有流动性，渗透性能也优于其它产品。
可选的，所述防腐剂选自脱氢乙酸及其钠盐、柠檬酸钠中的一种，优选为柠檬酸钠。
通过上述技术方案，与硫汞撒、叠氮化钠和庆大霉素相比，柠檬酸钠在水中经过氧、微生物的作用后，极易进行生物降解，一部分降解生成柠檬酸，柠檬酸对人类健康不会产生危害，而且对环境友好，另一方面，柠檬酸钠还能保持缓冲溶液中酶的活性。
可选的，所述阻断剂选自乙二胺四乙酸二钠、月桂基磷酸单酯钾盐中的其中一种，优选为乙二胺四乙酸二钠。
可选的，所述样本稀释液的pH值为7-8，优选为7.4。
通过上述技术方案，当样本稀释液的pH值在7-8之间，尤其是7.4时，样品在样本稀释液中的活性最强。
可选的，所述样本稀释液所检测的样本来源来自于人/动物的血清、肛门分泌物、粪便、眼鼻分泌物、咽鼻分泌物。
第二方面，本申请提供一种样本稀释液的制备方法，采用如下的技术方案：
一种样本稀释液的制备方法，包括以下步骤：
配制HEPES缓冲溶液：称取HEPES，加入水进行溶解、定容、过滤和除菌；
配制样本稀释液：称取海藻糖、氯化钠、酪蛋白、表面活性剂、防腐剂和阻断剂，并将其与配制完毕的HEPES缓冲溶液混合，形成混合液，搅拌使混合液溶解，最后调节混合液pH值为7-8。
通过采用上述技术方案，上述工艺步骤简易可行，由其制得的样本稀释液检测灵敏度高、敏感性强，且不会出现非特异性反应。
可选的，制备所述HEPES缓冲溶液过程中用三蒸水进行定容。
通过采用上述技术方案，采用三蒸水取出水中的微粒物质、离子、胶体以及难溶性气体等杂质，以保证样本稀释液的纯度。
可选的，所述HEPES缓冲溶液制备完毕后，在4℃下低温储存。
通过采用上述技术方案，非现配现用的情况下，将制备完毕的HEPES在低温下储存，避免细菌、微生物等在净化后的三蒸水中生存，有效的控制样本稀释液的质量。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
1、相关技术中，样本稀释液包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠、吐温-20、曲拉通X-100、海藻糖以及叠氮化钠，其中吐温-20和曲拉通X-100作为表面活性剂，叠氮化钠作为防腐剂，磷酸二氢钠和磷酸氢二钠作为缓冲溶液，本申请中，采用HEPES作为缓冲溶液，其更容易调节pH值，同时，与氯化钠复配时，可使溶液的渗透压保持平衡。加入酪蛋白能够有效减少分析物或检测抗体与表面的非特异性结合，检测达到更佳的灵敏度。表面活性剂、阻断剂和防腐剂与HEPES复配能够进一步保护样本，保证检测结果的准确性。
2、表面活性剂S24为非离子型表面活性剂，其与离子型表面活性剂相比，具有保护样本中蛋白质的功能。防腐剂优选柠檬酸钠， 与叠氮化钠相比，其最终降解产物为二氧化碳和水，不会对环境有较大影响，而且其无毒且不会生成爆炸性产物，在使用时安全系数高。
3、本申请的方法，工艺流程简易，制得的样本稀释液的灵敏度高、敏感性强，且不会发生非特异性反应，能够对一个样本进行多项目的检测。
样品来源
试剂盒：选用本公司生产的犬细小病毒检测试剂盒(粪便样本)、猫冠状病毒抗体检测试剂盒(血清样本)和犬瘟热病毒检测试剂盒(眼鼻口分泌物样本)；以上每个检测试剂盒分别收集80例阳性样本、80例阴性样本(阳性、阴性分别经PCR鉴定结果)；
样本稀释液1：由本申请制备的稀释液；
样本稀释液2：犬细小病毒检测试剂盒中的样本稀释液；
样本稀释液3：猫冠状病毒抗体检测试剂盒中的样本稀释液；
样本稀释液4：犬瘟热病毒检测试剂盒中的样本稀释液。
目前，商品化试剂盒的说明书多标有“不能使用其它试剂盒的样品处理液或样本稀释液”的提示，意味着一个试剂盒样本稀释液通常仅针对特定待检物来源样品有效，而对其它来源的抗原无效。而且，在检测样品时还发现，试剂盒样本稀释液的灵敏度不高，敏感性较差，甚至出现了假阳性的情况。针对上述相关问题，本发明人进行了研究。首先，将磷酸二氢钠作为缓冲溶液，并加入其它助剂，但是在实验时 发现难以控制其pH值，极易出现过酸或者过碱的情况。发明人进一步尝试改用HEPES缓冲溶液，在实验中发现当其与氯化钠海藻糖以及其他助剂结合时，制得的样本稀释液能够被应用，但是灵敏度和敏感性等各方面均较差。为此，发明人继续进行大量的实验和研究。出乎意料地，在一些实验中，发现加入酪蛋白能够提高样本稀释液的灵敏度，重要的是采用S24作为表面活性剂，柠檬酸钠作为防腐剂，乙二胺四乙酸钠作为阻断剂时，制得的样本稀释液能够同时检测多个不同的项目，而且出现非特异性反应的概率很低。本申请正是基于上述发现做出的。
为了更方便理解本申请的技术方案，以下结合表格和实施例对本申请作进一步详细说明，但不作为本申请限定的保护范围。
实施例
实施例1
配制0.05mol/L HEPES缓冲溶液：称取HEPES 11.95g并置于1000ml容量瓶中，加入三蒸水定容至刻度线处，摇晃使其溶解之后，接着放置于真空抽滤机，设置抽气速率为30(L/min),真空度大于0.099Mpa 15mbar，采用0.22μm滤膜对定容完毕的HEPES缓冲溶液进行过滤除菌，之后置于4℃下存放。
配制样本稀释液800ml：取配制好的0.05mol/L HEPES缓冲溶液500ml至800ml容量瓶中，准确量取8g酪蛋白，5g海藻糖，7.2g氯化钠，8g S24，8ml柠檬酸钠，8ml乙二胺四乙酸钠，加入到500ml 0.05mol/L HEPES缓冲溶液中，形成混合液，用玻璃棒搅拌混合液， 当混合液溶解后再用0.05mol/L HEPES缓冲溶液将混合液定容至刻度线处，接着用pH试纸检测混合液的pH值，若pH值为酸性，则加入碳酸氢钠进行滴定，直至pH值为7.4，若pH值为碱性，则加入稀盐酸进行滴定，直至pH值为7.4，制得的样本稀释液编号为样本稀释液1。
性能检测和数据分析：
样本稀释液的通用性：
对每个检测试剂盒的80份样品阳性样品和80份阴性样品，均分成四等份，每份包括20个阳性样品/阴性样品，并分别用样本稀释液1、样本稀释液2、样本稀释液3和样本稀释液4进行相应稀释，然后进行测试，检测结果如下表：
表1:不同检测项目在不同样本稀释液下能够准确反映阴性/阳性的份数
结果分析：当三个检测项目的样本稀释液为样本稀释液1时，检测临床样本与PCR检测结果一致；当样本稀释液为样本稀释液2/样本稀释液3/样本稀释液4时，只有在检测相对应检测项目的临床样本结果与PCR检测结果一致，在检测其他检测项目上的临床样本结果检出率比较低。其中，20份阴性的猫冠状病毒抗体样品中，样本稀 释液2只能检测出5份，准确率仅为25％，样本稀释液4只能检测出7份。准确率仅为35％；在20份阴性的犬瘟热病毒样品中，样本稀释液2只能检测出16份，准确率为80％；样本稀释液3只能准确检测出4份，准确率仅为20％；在20份阴性的犬细小病毒样品中，样本稀释液3只能检测出6份，准确率为30％，样本稀释液4能检测出18份，准确率为90％；所有未检出阴性的样品，都呈假阳性；说明样本稀释液2/样本稀释液3/样本稀释液4应用在其他检测项目上的样本检出率低，并且存在非特异性反应的情况。
样本稀释液的灵敏度：
选择经鉴定为猫冠状病毒抗体阳性的宠物狗，采集狗的血液，将血液置于离心管中，并利用离心机对血液进行离心，离心结束后取上层血清，即制备得到样本原液。
分别采用样本稀释液1和样本稀释液3进行比较，同时对采样的样品原液分别采用相应样本稀释液进行稀释，分别是样品原液(1倍稀释)、2倍稀释、4倍稀释、8倍稀释、16倍稀释、32倍稀释、64倍稀释、128倍稀释，最后采用犬狂犬病毒抗体检测试剂盒进行检测，检测结果如下表所示：(+为阳性、±为弱阳性、-为阴性)
表2:稀释液1和稀释液3在不同稀释倍数下的检测结果
| 稀释倍数 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 |
| 稀释液1 | ++++ | ++++ | +++ | +++ | ++ | + | + | - |
| 稀释液3 | ++++ | +++ | ++ | ++ | + | ± | - | - |
结果分析：从检测结果可以看出，使用样本稀释液1能够检测到64倍稀释下的阳性样本，使用稀释液3能够检测到16倍稀释下的阳性样本，而在32倍稀释下的阳性样本检测结果已经呈现弱阳性，在 64倍稀释下的阳性样本完全检测不出来，说明本发明的样本稀释液灵敏度比普通的样本稀释液灵敏度高。
实施例2
配制0.04mol/L HEPES缓冲溶液：称取HEPES 9.56g并置于1000ml容量瓶中，加入三蒸水定容至刻度线处，摇晃使其溶解之后，接着放置于真空抽滤机，设置抽气速率为30(L/min),真空度大于0.099Mpa 15mbar，采用0.22μm滤膜对定容完毕的HEPES缓冲溶液进行过滤除菌，之后置于4℃下存放。
配制样本稀释液800ml：取配制好的0.04mol/L HEPES缓冲溶液500ml至800ml容量瓶中，准确量取4.8g酪蛋白，4g海藻糖，4g氯化钠，1.6g S24，0.8ml柠檬酸钠，0.8ml乙二胺四乙酸钠，加入到500ml 0.04mol/L HEPES缓冲溶液中，形成混合液，用玻璃棒搅拌混合液，当混合液溶解后再用0.04mol/L HEPES缓冲溶液将混合液定容至刻度线处，接着用pH试纸检测混合液的pH值，若pH值为酸性，则加入碳酸氢钠进行滴定，直至pH值为7.4，若pH值为碱性，则加入稀盐酸进行滴定，直至pH值为7.4，制得的样本稀释液编号为样本稀释液1。
性能检测和数据分析：
样本稀释液的通用性：
对每个检测试剂盒的80份样品阳性样品和80份阴性样品，均分成四等份，每份包括20个阳性样品/阴性样品，并分别用样本稀释液1、样本稀释液2、样本稀释液3和样本稀释液4进行相应稀释，然 后进行测试，检测结果如下表：
表3:不同检测项目在不同样本稀释液下能够准确反映阴性/阳性的份数
结果分析：当三个检测项目的样本稀释液为样本稀释液1时，检测临床样本与PCR检测结果一致；当样本稀释液为样本稀释液2/样本稀释液3/样本稀释液4时，只有在检测相对应检测项目的临床样本结果与PCR检测结果一致，在检测其他检测项目上的临床样本结果检出率比较低。其中，20份阴性的猫冠状病毒抗体样品中，样本稀释液2只能检测出7份，准确率仅为35％，样本稀释液4只能检测出5份。准确率仅为25％；在20份阴性的犬瘟热病毒样品中，样本稀释液2只能检测出14份，准确率为70％；样本稀释液3只能准确检测出8份，准确率仅为40％；在20份阴性的犬细小病毒样品中，样本稀释液3只能检测出6份，准确率为30％，样本稀释液4能检测出12份，准确率为60％；所有未检出阴性的样品，都呈假阳性；说明样本稀释液2/样本稀释液3/样本稀释液4应用在其他检测项目上的样本检出率低，并且存在非特异性反应的情况。
样本稀释液的灵敏度：
选择经鉴定为猫冠状病毒抗体阳性的宠物狗，采集狗的血液，将 血液置于离心管中，并利用离心机对血液进行离心，离心结束后取上层血清，即制备得到样本原液。
分别采用样本稀释液1和样本稀释液2进行比较，同时对采样的样品原液分别采用相应样本稀释液进行稀释，分别是样品原液(1倍稀释)、2倍稀释、4倍稀释、8倍稀释、16倍稀释、32倍稀释、64倍稀释、128倍稀释，最后采用犬狂犬病毒抗体检测试剂盒进行检测，检测结果如下表所示：(+为阳性、±为弱阳性、-为阴性)
表2:稀释液1和稀释液2在不同稀释倍数下的检测结果
| 稀释倍数 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 |
| 稀释液1 | ++++ | ++++ | +++ | +++ | ++ | + | + | - |
| 稀释液2 | ++++ | +++ | ++ | + | ± | - | - | - |
结果分析：从检测结果可以看出，使用样本稀释液1能够检测到64倍稀释下的阳性样本，使用稀释液2能够检测到16倍稀释下的阳性样本，而在16倍稀释下的阳性样本检测结果已经呈现弱阳性，在32倍稀释下的阳性样本完全检测不出来，说明本发明的样本稀释液灵敏度比普通的样本稀释液灵敏度高。
实施例3
配制0.06mol/L HEPES缓冲溶液：称取HEPES 14.34g并置于1000ml容量瓶中，加入三蒸水定容至刻度线处，摇晃使其溶解之后，接着放置于真空抽滤机，设置抽气速率为30(L/min),真空度大于0.099Mpa 15mbar，采用0.22μm滤膜对定容完毕的HEPES缓冲溶液进行过滤除菌，之后置于4℃下存放。
配制样本稀释液800ml：取配制好的0.06mol/L HEPES缓冲溶液500ml至800ml容量瓶中，准确量取9.6g酪蛋白，12g海藻糖，8g 氯化钠，16g S24，16ml柠檬酸钠，8ml乙二胺四乙酸钠，加入到500ml0.06mol/L HEPES缓冲溶液中，形成混合液，用玻璃棒搅拌混合液，当混合液溶解后再用0.06mol/L HEPES缓冲溶液将混合液定容至刻度线处，接着用pH试纸检测混合液的pH值，若pH值为酸性，则加入碳酸氢钠进行滴定，直至pH值为7.4，若pH值为碱性，则加入稀盐酸进行滴定，直至pH值为7.4，制得的样本稀释液编号为样本稀释液1。
性能检测和数据分析：
样本稀释液的通用性：
对每个检测试剂盒的80份样品阳性样品和80份阴性样品，均分成四等份，每份包括20个阳性样品/阴性样品，并分别用样本稀释液1、样本稀释液2、样本稀释液3和样本稀释液4进行相应稀释，然后进行测试，检测结果如下表：
表3:不同检测项目在不同样本稀释液下能够准确反映阴性/阳性的份数
结果分析：当三个检测项目的样本稀释液为样本稀释液1时，检测临床样本与PCR检测结果一致；当样本稀释液为样本稀释液2/样本稀释液3/样本稀释液4时，只有在检测相对应检测项目的临床样 本结果与PCR检测结果一致，在检测其他检测项目上的临床样本结果检出率比较低。其中，20份阴性的猫冠状病毒抗体样品中，样本稀释液2只能检测出6份，准确率仅为30％，样本稀释液4只能检测出10份。准确率仅为50％；在20份阴性的犬瘟热病毒样品中，样本稀释液2只能检测出13份，准确率为65％；样本稀释液3只能准确检测出2份，准确率仅为10％；在20份阴性的犬细小病毒样品中，样本稀释液3只能检测出7份，准确率为35％，样本稀释液4能检测出17份，准确率为85％；所有未检出阴性的样品，都呈假阳性；说明样本稀释液2/样本稀释液3/样本稀释液4应用在其他检测项目上的样本检出率低，并且存在非特异性反应的情况。
样本稀释液的灵敏度：
选择经鉴定为猫冠状病毒抗体阳性的宠物狗，采集狗的血液，将血液置于离心管中，并利用离心机对血液进行离心，离心结束后取上层血清，即制备得到样本原液。
分别采用样本稀释液1和样本稀释液4进行比较，同时对采样的样品原液分别采用相应样本稀释液进行稀释，分别是样品原液(1倍稀释)、2倍稀释、4倍稀释、8倍稀释、16倍稀释、32倍稀释、64倍稀释、128倍稀释，最后采用犬狂犬病毒抗体检测试剂盒进行检测，检测结果如下表所示：(+为阳性、±为弱阳性、-为阴性)
表2:稀释液1和稀释液4在不同稀释倍数下的检测结果
| 稀释倍数 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 |
| 稀释液1 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++ | + | + | - |
| 稀释液4 | ++++ | +++ | ++ | + | + | ± | - | - |
结果分析：从检测结果可以看出，使用样本稀释液1能够检测到 64倍稀释下的阳性样本，使用稀释液4能够检测到16倍稀释下的阳性样本，而在32倍稀释下的阳性样本检测结果已经呈现弱阳性，在64倍稀释下的阳性样本完全检测不出来，说明本发明的样本稀释液灵敏度比普通的样本稀释液灵敏度高。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (8)
- 一种免疫层析检测通用的样本稀释液，其特征在于，包括以下质量/体积比(g/ml)的组分：6％-12％酪蛋白、2％-20％表面活性剂、1％-20％防腐剂、5％-20％海藻糖、0.5％-1％氯化钠、1％-10％阻断剂和0.04mol/L-0.06mol/L HEPES缓冲溶液。
- 根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于：所述样本稀释液包含：0.05mol/L HEPES缓冲溶液、10％酪蛋白、2.2％表面活性剂、1％防腐剂、5％海藻糖、0.9％氯化钠和1％阻断剂。
- 根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于：所述表面活性剂为吐温80、曲拉通、S24和十二烷基环酸钠中的其中一种。
- 根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于：所述防腐剂选自脱氢乙酸及其钠盐、柠檬酸钠中的一种。
- 根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于：所述阻断剂选自乙二胺四乙酸二钠、月桂基磷酸单酯钾盐中的其中一种。
- 根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于：所述样本稀释液的pH值为7-8。
- 一种如权利要求1-6任一项所述的样本稀释液的制备方法：其特征在于，包括以下步骤：配制HEPES缓冲溶液：称取HEPES，加入水进行溶解、定容、过滤和除菌；配制样本稀释液：称取海藻糖、氯化钠、酪蛋白、表面活性 剂、防腐剂和阻断剂，并将其与配制完毕的HEPES缓冲溶液混合，形成混合液，搅拌使混合液溶解，最后调节混合液pH值为7-8。
- 根据权利要求7所述的样本稀释液的制备方法，其特征在于：制备所述HEPES缓冲溶液过程中用三蒸水进行定容。
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