WO2005064010A1 - Zusammensetzung zum binden von nukleinsäure an eine festphase - Google Patents

Zusammensetzung zum binden von nukleinsäure an eine festphase Download PDF

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WO2005064010A1
WO2005064010A1 PCT/EP2003/014634 EP0314634W WO2005064010A1 WO 2005064010 A1 WO2005064010 A1 WO 2005064010A1 EP 0314634 W EP0314634 W EP 0314634W WO 2005064010 A1 WO2005064010 A1 WO 2005064010A1
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WO
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nucleic acid
concentration
solution
blood
solid phase
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PCT/EP2003/014634
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English (en)
French (fr)
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Elke Helftenbein
Anja Eiblmaier
Original Assignee
Preanalytix Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to a composition for optimizing the binding of nucleic acid, preferably derived from blood, in aqueous solution to a solid phase, and to a kit for isolating nucleic acid.
  • WO 00/09746 describes a blood collection vessel which contains a solution which comprises, as constituents, a guanidiumium salt, a buffer substance, a reducing agent and / or a detergent.
  • the vessel is particularly suitable for. Removal of blood to be tested for nucleic acids.
  • WO 01/60517 describes a vessel for taking samples which contains a nucleic acid stabilizing solution and a nucleic acid binding solid phase.
  • the vessel is particularly suitable for withdrawing blood that is to be examined for nucleic acid.
  • nucleic acids e.g. mRNA or viral RNA and DNA should be analyzed.
  • nucleic acids contained in the sample should best be stabilized at the moment of acceptance, i.e. the degradation of the existing nucleic acids, but also the new synthesis of mRNA should be prevented.
  • RNA Ribonucleases
  • RNA Ribonucleic acid
  • DNA DNA
  • the effects of cellular and extracellular nucleases are usually under physiological control as long as the cells are in their normal environment. Taking blood leads to more or less severe changes in the nucleic acids contained in the cells. Nucleases are then released inside the cells and / or by cell lysis to the outside. In addition, nucleic acids are synthesized to a greater or lesser extent. Long-term storage of biological samples, such as blood, leads to cell aging and destruction.
  • nucleic acids from other biological samples e.g. Saliva and tissue samples, too.
  • nucleic acid analysis raises the question of how the entire process from sampling to nucleic acid measurement can be controlled and optimized under standardized conditions.
  • a standard nucleic acid defined in quantity and quality, should be added to the sample material as soon as it is removed, which is subjected to the entire process from sampling to determination.
  • the nucleic acid originally contained in the pobe should also be fed into the analysis as quantitatively as possible. This is particularly important for diagnostics, since depending on the findings, there are different consequences in the treatment of the sample donor can. This is also not possible with the conventional removal and insulation systems.
  • the literature describes a method in which a blood sample is mixed with guanidinium salt immediately after the patient has taken it (EP 0 818542 A1).
  • the guanidinium salt is in powder form in order to take advantage of the higher stability of the guanidinium salt.
  • this method has serious disadvantages, since the salt e.g. must first dissolve in the added blood. The dissolving process is particularly temperature-dependent and cannot be controlled due to the opaque sample material used. The use of a corresponding product for diagnostic medical purposes is therefore extremely problematic.
  • Nucleases are extremely active enzymes, which are found in high concentration in particular in body fluids / secretions, such as saliva or blood, and which can only be inhibited under extremely denaturing conditions. Denaturation depends on the concentration of the guanidinium salt in solution. An inhibiting concentration of guanidinium salt in solution is not given from the beginning in the process of EP 0 818 542. So there is an uncontrolled degradation of nucleic acids during the dissolution process. In this method, the addition of reducing agents is also dispensed with, without which an effective inhibition - in particular of RNases - is generally not guaranteed. Finally, EP 0 818 542 does not take any measures to isolate the nucleic acid of the sample material as quantitatively as possible.
  • the present invention was based on the technical problem of specifying means for optimizing the yield of nucleic acids from biological samples, in particular specifying means that optimize the binding of nucleic acid from the sample to a solid phase.
  • the agents are intended to enable an improved nucleic acid analysis method from biological samples with a lower detection limit, this being particularly desirable in the context of diagnostics.
  • compositions for optimizing the binding of nucleic acid in aqueous solution to a solid phase containing a guanidinium salt, a buffer substance and a detergent, characterized in that the pH of the solution> 7, 0, preferably> 7.5, very particularly preferably> 8.0.
  • kits for isolating nucleic acid containing the following components: a) an aqueous solution for stabilizing nucleic acid (also called N-sS or NAST) containing the following components: - a guanidinium salt, and / or - a buffer substance , and / or - a reducing agent, and / or - a detergent; b) a composition for optimizing the binding of nucleic acid in aqueous solution to a solid phase, containing a guanidinium salt, a buffer substance and a detergent, characterized in that the pH of the solution is> 7.0; and c) a solid phase that can bind nucleic acids.
  • aqueous solution for stabilizing nucleic acid also called N-sS or NAST
  • a composition for optimizing the binding of nucleic acid in aqueous solution to a solid phase containing a guanidinium salt, a buffer substance and a detergent, characterized in that the pH of the solution is>
  • the kit offers the following advantages: 1.
  • the sample, preferably blood, is lysed as soon as it is taken, since the sample container already contains a corresponding lysis solution, which is also a nucleic acid-stabilizing solution.
  • the nucleic acid stabilizing solution causes the sample material, in particular the nucleic acids contained therein, to be stabilized immediately after contact with the solution.
  • the nucleic acid stabilizing solution is also selected so that the sample material can be used directly in subsequent isolation processes. 4.
  • the nucleic acid-stabilizing solution can be separated off so efficiently in the subsequent isolation that inhibition, for example of the PCR, does not occur. 5.
  • An internal standard can be added to the nucleic acid stabilizing solution.
  • the solid phase contained in the vessel is particularly suitable for later isolation of the nucleic acid bound to it.
  • the subsequent isolation is simplified by the binding of the nucleic acids to the solid phase, since a first separation of nucleic acid and further sample components already takes place in the vessel.
  • the nucleic acid stabilizing solution can be chosen so that the nucleic acid binds to the corresponding surface immediately after cell lysis or only after the addition of further reagents.
  • the first case is given, for example, when a glass surface is specified in the presence of a guanidinium salt.
  • the second case can be done by adding the "binding solution" or e.g. achieve or optimize by presenting a biotin-coated surface and subsequently adding streptavidin with nucleic acid binding properties.
  • the kit can basically be used for processing any body fluids.
  • it is suitable for processing body fluids that contain cellular components, such as. B. bone marrow, but also for example Saliva samples.
  • it is preferably a kit for the direct withdrawal of whole blood from a donor.
  • the kit preferably contains a vessel, which preferably consists of a conventional blood collection vessel (for example a tube), in which a defined volume of a nucleic acid-stabilizing solution and a nucleic acid-binding solid phase are contained.
  • the tube is then preferably provided with a defined negative pressure, which enables only a certain volume of blood to be drawn.
  • the tube can be handled using conventional blood collection methods.
  • the stabilizing solution contained in the tube contains the following reagents: a guanidinium salt, e.g. B. guanidinium thiocyanate, a detergent, e.g. B. Triton-X-100, a reducing agent, e.g. B.
  • the solution is compatible with the vacuum tube.
  • the solution can easily be stored in the vacuum tube without affecting the desired stabilizing function.
  • the entire system is particularly easy and safe for the blood donor to take samples.
  • the nucleic acid-stabilizing solution containing the guanidinium salt, which serves as a lysis and stabilizing substance, the nucleic acid-binding solid phase, the buffer substance, the reducing agent and the detergent is stable in storage and converts the freshly removed material, such as blood, into a material, which is also storage stable and which can be used directly for further nucleic acid analysis or isolation.
  • Guanidinium thiocyanate and / or guanidinium chloride are preferred as guanidinium salt.
  • the guanidinium salt is preferably present in a concentration of 1 to 8.0 M.
  • Tris or citrate is preferred as the buffer substance, the exact pH preferably being adjusted with HCl.
  • other possible buffers are HEPES, MOPS, MES, citrate and phosphate buffers such as PBS.
  • All nucleic acid binding materials can be used as the solid phase. Glass particles, nucleic acid-binding polymers, particles coated with such particles, nucleic acid-binding coatings of the removal system or particles coated with silica are particularly suitable.
  • the surface of the nucleic acid-binding solid phase can alternatively be coated with specific binding molecules (eg streptavidi, oligonucleotides, peptide nucleic acids (PNAs), etc.) which interact directly with marker molecules on the nucleic acid or with the nucleic acid.
  • specific binding molecules eg streptavidi, oligonucleotides, peptide nucleic acids (PNAs), etc.
  • the shape of the materials only depends on the shape of the extraction system and the subsequent insulation method. Shapes which can subsequently be used directly in the further processing of the nucleic acid are particularly suitable, and surfaces which are compatible with conventional insulation processes, such as magnetic particles or nonwovens, are very particularly suitable.
  • Suitable solid phases are commercially available, e.g. B. Silica coated magnetic particles as they are contained in the mRNA Isolation Kit for Blood / Bone Marrow (Röche).
  • the buffer concentration in the nucleic acid stabilizing solution is preferably between 10 and 300 mM, particularly preferably between 10 and 100 mM.
  • Triton-X-100 is preferred as a detergent in the nucleic acid-stabilizing solution.
  • Other possible detergents are NP-40, Tween 20, polydocanol or other detergents.
  • the detergent concentration in the nucleic acid-stabilizing solution is preferably 5 to 30% (w / v), particularly preferably 10 to 20% (w / v).
  • DTT is preferred as the reducing agent, but ß-mercaptoethanol, TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine) or other reducing agents can also be used.
  • the preferred concentration of the reducing agent in the nucleic acid stabilizing solution is 0.1 to 10% (w / v); 0.5 to 2% (w / v) are particularly preferred.
  • the pH of the solution in the nucleic acid-stabilizing solution is preferably 3.0 to 9.0, particularly preferably 4.0 to 7.5.
  • the pH of the solution is chosen in particular such that a pH in the range from 5.0 to 7.5 is established in the nucleic acid-stabilizing solution after the sample material has been added. Since it is ensured by specifying the negative pressure which sample volume is removed, by presenting a desired buffer concentration or a corresponding volume of solution, it can be ensured that the desired pH is also achieved after the complete sample volume has been recorded. A pH between 6.3 and 6.9 after sample uptake is particularly preferred.
  • a particularly preferred nucleic acid stabilizing solution contains 3-4 M guanidinium thiocyanate, 40-80 mM Tris, 11-14% (w / v) Triton-X-100, 40-80 mM DTT, a solid phase made of glass particles or silica-coated magnetic particles, the pH being adjusted so that a pH of 6 to 7.5 results after blood has been added.
  • the volume for receiving the blood sample has a negative pressure which can be set in such a way that a predetermined blood volume is sucked into the collection vessel after a blood vessel has been pierced.
  • a predetermined blood volume is sucked into the collection vessel after a blood vessel has been pierced.
  • Correspondingly evacuated vessels are available on the market.
  • the vessel containing the withdrawn blood can then be immediately passed to the further steps for analysis or can be stored for a longer period (up to several days or weeks) without any disadvantages for the quality of the sample.
  • the freshly removed sample such as blood
  • the nucleic acid-stabilizing solution described above in the removal vessel so that all processes which can change the nucleic acid pattern of the sample are stopped immediately.
  • the nucleic acids can preferably already be bound to the solid phase in the vessel or be bound to the solid phase in a further reaction step, the The extent of the binding is optimized by the addition of the binding solution according to the invention.
  • the data relating to the detected nucleic acids determined later in the context of nucleic acid analysis therefore very precisely represent the actual state at the time of blood collection, both with regard to the amounts and the types of nucleic acids.
  • the amount of blood withdrawn preferably corresponds to 0.1 to 2 times the solution presented in the vessel.
  • the latter is preferably 0.5 to 5.0 ml.
  • the final concentration of guanidinium salt after sample addition is preferably 1.0 to 5 M, preferably 1.0 to 3.0 M, before the binding solution is added.
  • the solution in the vessel preferably contains: a guanidinium salt in a concentration of 1 to 8 M; - a detergent in a concentration of 5 to 25% (w / v); - a buffer in a concentration of 100 to 500 mM; - A reducing agent in a concentration of 5 to 50 mM; and has a pH of> 7.5, preferably> 8.0.
  • the vessel with the blood sample, stabilizing solution and binding solution contains the following components: a guanidinium salt in a concentration of 1.5 to 5, preferably 2.5 to 3.5 M; - a detergent in a concentration of 8 to 20, preferably 10 to 16% (w / v); a buffer in a concentration of 150 to 400, preferably 200 to 300 mM; a reducing agent in a concentration of 20 to 40 mM, preferably 25 to 35 mM; and with - a pH> 7.0, preferably> 7.5, particularly preferably> pH 8.0.
  • the above-mentioned solution of blood sample, NsS and PrIS has a pH 10 10, preferably ⁇ pH 9.0. This measure minimizes alkaline hydrolysis of the nucleic acid.
  • the kit according to the invention is preferably used for taking samples when the sample is to be used for nucleic acid analysis.
  • the use of the above Nucleic acid-stabilizing solution as part of the described collection system guarantees the immediate lysis of the cells and simultaneous stabilization of the sample through immediate inactivation of the nucleases. Surprisingly, the sample obtained in this way can be stored for several days even at room temperature.
  • the sampling system also ensures contamination-proof and non-infectious handling from sampling to nucleic acid isolation to analysis. In the conventional methods of nucleic acid isolation, additional handling steps (such as the transfer of the blood sample taken into the reagents for nucleic acid isolation, etc.) have always been necessary, which are associated with an additional risk of infection or contamination of the sample, as already described in detail at the beginning.
  • additional handling steps such as the transfer of the blood sample taken into the reagents for nucleic acid isolation, etc.
  • the kit has been described essentially in connection with a blood collection vessel, what has been said also applies to other systems for receiving biological samples, such as smears.
  • the nucleic acid which is partly bound to the solid phase, can be isolated from the sample material even after prolonged storage.
  • precipitates consisting of blood components, such as porphyrin salts of hemoglobin, to which nucleic acid partially binds can increasingly form with increasing storage time.
  • the presence of the binding solid phase during sample lysis and stabilization leads to the immediate binding of some nucleic acids, mainly DNA, to the surface.
  • Only by adding the binding solution is a complete release of the nucleic acid from the possibly formed precipitates and an optimal binding of the latter to the solid phase achieved.
  • the addition should take place immediately before the actual isolation step, since adding the binding solution does not optimally stabilize the Nucleic acid is more guaranteed.
  • the binding solution is preferably added immediately before the actual sample preparation in order to isolate the nucleic acid.
  • the sample obtained with the kit can be supplied to common nucleic acid isolation methods; When using silica-coated magnetic particles or silica fleeces in columns, it is possible to fall back on standard nucleic acid isolation methods (magnetic separation or centrifugation or negative pressure, washing, elution of the nucleic acid).
  • the present invention thus consists of a sample collection system which is designed in such a way that the following conditions are met: 1. Controlled sample removal and simultaneous stabilization of the nucleic acids (DNA, RNA) contained in the sample material. 2. Sampling, in which the use of anticoagulants can be completely dispensed with. 3. Optimized binding of the nucleic acids to a solid phase contained in the system. 4. The sample obtained with the described system can easily be integrated into existing nucleic acid isolation systems. 5. The system, including the sample it contains, is stable in storage.
  • the sample obtained with the sampling system described is stable in storage in the vessel over a long period of time without degradation of the nucleic acids.
  • Fig. 1 Sampling vessel with nucleic acid stabilizing substance (N-sS), defined vacuum, mixed with solid phase and sealed with septum.
  • N-sS nucleic acid stabilizing substance
  • Fig. 2 Graphical representation of a gel analysis (1% agarose) of 28S and 18S rRNA, which was stored in the sampling vessel for different lengths of time.
  • Column 1 Isolation and separation of the RNA immediately after sampling (no storage),
  • Column 2 Storage for one month at -20 ° C,
  • Column 3 Storage for 6 days at 4 ° C.
  • the amount of RNA applied corresponded to a blood volume of 120 ⁇ l.
  • Fig. 3 Graphical representation of a gel analysis (1% agarose) of DNA that was stored in the sampling vessel for different lengths of time.
  • Column 1 Isolation immediately after sampling (no storage),
  • Column 2 Storage for one month at -20 ° C,
  • Column 3 Storage for 6 days at 4 ° C.
  • the amount of DNA applied corresponded to a blood volume of 10 ⁇ l.
  • Fig. 6 Graphical representation of a gel analysis of the PCR amplificates of MS2-RNA, which was isolated after 1 or 8 days incubation at 40 ° C in serum / stabilizing solution.
  • Column 1 amplificate of the RNA isolated after one day
  • column 2 amplificate of the RNA isolated after 8 days.
  • Column 3 DNA marker
  • column 4 MS2-RNA positive control: 0.8 ⁇ g diluted 1:50 in 10 ⁇ l RT, 1 ⁇ l amplified.
  • Fig. 7 Graphical representation of a gel analysis of isolated MS2-RNA after 6 (columns 2-12) or 13 (columns 14-19) days of incubation at room temperature in serum / stabilizing solution. Behind the relevant columns is the pH value that was reached after mixing the serum and stabilizing solution.
  • RNA and DNA in the standard agarose gel (1% agarose).
  • Column 1 Molecular weight markers
  • Columns 2 to 4 Isolated nucleic acids;
  • Column 2 nucleic acid from whole blood lysate mixed with MS2 RNA (7 days)
  • column 3 nucleic acid: from whole blood lysate mixed with MS2 RNA (0 days, control)
  • column 4 nucleic acid from whole blood lysate (7 days)
  • column 5 nucleic acid from whole blood lysate (0 days, control).
  • the upper bands show chromosomal DNA (clearly recognizable in all 4 samples), the lower bands in columns 2 and 3 show the added and isolated MS2 RNA.
  • Example 1 Example 1:
  • the blood collection system can be composed as follows (see Fig. 1): A tube is filled with a defined volume of the nucleic acid-stabilizing solution, provided with a nucleic acid-binding solid phase and with a defined vacuum, then closed with a septum , The septum is designed to be compatible with common sampling accessories (cannula, etc.).
  • common sampling accessories cannula, etc.
  • 2.2 ml of reagent were introduced and the vacuum was set so that exactly 1.3 ml of blood could flow in during the sampling.
  • the nucleic acids contained in the inflowing blood stream were immediately converted into a stable form.
  • nucleic acid stabilizing substance had the following composition in all the examples described below: 45 mM Tris, 5 M guanidinium thiocyanate, 0.8 (w / v) dithiothreitol, 18% (w / v) tritone X-100, pH 6.0.
  • the nucleic acid-stabilizing substance was mixed with the sample in a ratio of 1 to 0.59 (1 volume of N-sS plus 0.59 volume of sample material).
  • sample material for DNA and RNA isolation was used immediately after removal, after storage for 6 days at 4 ° C and after storage for 1 month at -20 ° C.
  • RNA Isolation Kit (Röche, Cat. No. 1 828665) was used to isolate RNA (Fig. 2).
  • the instruction leaflet was modified as follows: A volume of 2.4 ml of sample lysate was applied to the column in 4 aliquots with 600 ⁇ l each, so that a total of sample material from 2.4 ml of lysate was applied. All other steps were carried out according to the package insert. The RNA was finally eluted with 100 ul elution buffer.
  • the QiaAmp Blood Kit (Qiagen Cat. No. 29104) was used to isolate DNA (Fig. 3).
  • the standard procedure described in the package insert was modified in various ways: 400 ⁇ l sample volume was added directly to the column, the binding reagent contained in the kit not being used. 25 ⁇ l proteinase K stock solution were added and the sample was incubated for 10 minutes at room temperature. The column was then placed in a collecting vessel and centrifuged as described in the package insert. With the exception of the use of ethanol, all further steps were carried out as described in the package insert. The elution volume was 200 ⁇ l.
  • Stabilizing solution used 4.0 M GTC; 13.5% Triton X100; 45 mM Tris / HCl; with 120 mM or without DTT 700 ⁇ l serum were mixed with 700 ⁇ l stabilizing solution. After 2 min incubation, 20 ⁇ l MS2-RNA (0.8 ⁇ g / ⁇ l from Röche Diagnostics) were added. The samples were incubated for 180 min at 40 ° C. and then processed in aliquots of 400 ⁇ l with the High Pure total RNA kit from Röche in accordance with Experiment 1. The samples were eluted in 50 ⁇ l and frozen at - 20 ° C. The analysis was carried out using an agarose gel (see Fig. 4).
  • Stabilization solutions used 3 - 5 M GTC; 13.5% Triton X100; 50mM DTT; 42 mM Tris / HCl; pH of the solutions: approx. 5.0; pH of the solutions after addition of approx. 6.7.
  • the PCR was carried out on the Lightcycler at an annealing temperature of 61 ° C using SYBR-Green as a detection system. All samples with a threshold cycle greater than 20 are considered negative because the detected signal is exclusively due to the formation of primer dimers. This can be clearly demonstrated by analyzing the melting curves on the LightCycler (Röche).
  • the RT product was 1:50 with bidest. Diluted water and 1 ⁇ l of it used for a 10 ⁇ l PCR according to the following scheme:
  • Fig. 5 shows the eluted MS2-RNA after 3 days incubation at 40 ° C detected in an agarose gel. Although all RNA samples can still be amplified and clearly detected after 8 days at 40 ° C (Fig. 6), clear differences in RNA integrity depending on the GTC content can be seen after only 3 days. Accordingly, a salt content of less than 2 M in the serum / stabilizing solution is advantageous for the integrity of the RNA, in particular higher temperatures, e.g. 40 degrees Celsius.
  • MS2-RNA is completely degraded by RNases just 2 minutes after being added to serum and therefore no more RNA can be detected.
  • This example was able to demonstrate that the degradation of the RNA can be significantly delayed by adding stabilizing solution to the serum. After 8 days at 40 ° C in serum / stabilizing solution, MS2-RNA can be detected by PCR without problems (Fig. 6), although the RNA integrity was partially impaired.
  • RNA was extracted from 500 ⁇ l sample using the Röche viral RNA kit worked up according to Example 4 and isolated in 50 ⁇ l elution buffer. 20 ⁇ l of the eluate was analyzed using an agarose gel (see Fig. 7).
  • the pH of the serum / stabilizing solution and thus also the pH and buffer range of the stabilizing solution is crucial for the long-term stabilization of RNA. While at a pH of 8.0 no intact RNA could be detected after only 2 days, intact RNA can still be detected in a pH range between 6.6 and 7.0 after 13 days of incubation at room temperature.
  • an optimally set GTC concentration is also important for the long-term stabilization of RNA (see Example 4). The example shown illustrates that for long-term stabilization of RNA, a final GTC concentration in the stabilized sample of 2.2 M GTC is better than 2.8 M.
  • the solution and blood were used in a ratio of 1: 1.
  • the silica-coated magnetic particles were taken from the mRNA Isolation Kit for Blood / Bone Marrow (Röche Molecular Biochemicals). The amount of particles used per ml was approx. 35 mg.
  • the blood collection system consisting of the collection tube, the stabilizing solution and the magnetic particles, was stored for 14 days at room temperature. Whole blood was then withdrawn using this system. As a control, a freshly prepared sampling system (tubes, Stabilizing solution, magnetic particles) used. The nucleic acids contained in the sample material were isolated from both approaches. The magnetic particles were separated with a magnet, the supernatant was discarded.
  • the particles were resuspended in 50% ethanol, 10mM Tris, pH 7.0 and washed several times with the same solution. Finally, the particles were heated to 70 ° C. in 10 mM Tris / HCl pH 7.0, the nucleic acid detaching from the magnetic particles. The particles were separated magnetically and the supernatant containing nucleic acid was analyzed in a standard agarose gel.
  • Suspension used 4.5 M GTC 15% Triton-X-100 100 mM DTT 50 mM MES 35 mg / ml particles 4 blood collection systems (tubes) containing 1.0 ml of the suspension described above were mixed with 1 ml of whole blood. Two of the tubes (whole blood lysate) were additionally treated with 25 ⁇ g MS2 RNA. One tube each of the two batches (whole blood lysate +/- MS2 RNA) was used immediately afterwards for nucleic acid isolation (implementation see example 6). The other two tubes were stored at room temperature for 7 days: after this period the nucleic acid isolation was carried out. The elution volume was 200 ⁇ l per 200 ⁇ l whole blood volume. The nucleic acids were analyzed in the standard agarose gel.
  • Example 8 Extraction of mRNA and cellular and viral DNA by binding to magnetic polymer beads based on polyvinyl alcohol and to magnetic silica beads
  • CMV cytomegaloviruses
  • Magnetic-Beads a) 120 ⁇ l bead suspension from MagNA Pure LC total Nucleic Acid Isolation Kit (KaL No. 3038 505, Röche Molecular Biochemicals) b) 30 ⁇ l bead suspension of carboxyl-polyvinyl alcohol Magnetic Beads (M-PVA C12 Cat.No. 01-01.204) from Chemagen Biopolymer-Technologie AG, Baesweiler, GER Nucleic acid extratons protocol for a) and b):
  • 2nd washing step repeat the same washing step with 500 ⁇ l washing buffer I.
  • 3rd washing step add 900 ⁇ l washing buffer II (containing ethanol) from the same kit as above per sample and mix completely remove magnetic separation and supernatant Elution in 100 ⁇ l elution buffer from the same kit as above incubate for 10 min at 80 ° C and complete eluate after magnetic separation Remove g and freeze at -70 ° C until analysis
  • Nucleic acid analysis agarose gel analysis: 20 ⁇ l of the eluate are analyzed on a 1% native agarose gel
  • PrIS composition binding solution in the above Experiment: 3.5 M GTC; 10% Triton X 100; 350 mM Tris / HCl; pH 8.0; NsS composition (stabilizing solution) in the above Experiment: 3.5 M GTC; 12.5% Triton X 100; 60 mM Tris / HCl; 60mM DTT;
  • Example 9 Detection of the binding efficiency of nucleic acid on silica surfaces by adding the binding solution ..PrIS "to the NAST-blood mixture
  • PrIS composition 3.5 M GTC; 10% Triton X 100; 350 mM Tris / HCl; pH 8.0; NAST composition: 3.5 M GTC; 12.5% Triton X 100; 60 mM Tris / HCl; 60mM DTT;
  • Blood sampling The blood is drawn in a NAST Vacuette® tube from Greiner BIO-ONE.
  • This vacuum blood collection tube has a total volume of 5 ml and contains 2.3 ml of NsS (Nucleic Acid Stabilization) solution.
  • the vacuum is set so that when the blood is drawn, 1.2 - 1.25 ml of blood flow into the tube and mix with the solution.
  • 200 ⁇ l of blood correspond to 560 ⁇ l of the blood-NAS mixture.
  • HCV 5.7 x 10 5 IU / ml blood NAS mixture
  • CMV 2.0 x 10 6 copies / ml blood NAS mixture Storage: The blood collection tubes are stored at 20 - 24 ° C for 1 day
  • Nucleic acids from 200 ⁇ l blood are present in 100 ⁇ l eluate and are stored in 10 ⁇ l aliquots at -70 ° C until analysis.
  • NAST-PRIS The extracted nucleic acids consist of 90-95% from cellular RNA (ribosomal RNA, mRNA) while the chromosomal DNA as a thin band is in the range of approx. 5 -10%.
  • NAST-PRIS the NAST-PRIS according to the invention, approximately 3 times more total nucleic acids and 4-13 times more total cellular RNA, which mainly consists of rRNA, are isolated.
  • PAXgenes HCV concentrations of 0.6 - 1.0 x 10 4 lU / ml were measured, corresponding to a recovery of 1 - 1.75% of the spiked 5.7 x 10 5 HCV lU / ml.
  • the PAXgene system achieves a 40 - 70 times worse yield for HCV compared to the NAST-PRIS system.
  • NAST-PRIS A CMV concentration of approx. 8 x 10 5 copies / ml was measured, which corresponds to 40% recovery of the spiked concentration of 2 x 10 6 copies / ml.
  • Paxgene CMV concentrations of 0.8 - 1, 6 x 10 5 copies / ml were measured, which represents a recovery of 4 - 8% of the spiked 2 x 10 6 CMV copies / ml.
  • NAST-PRIS 8-12 ng G6P-DH mRNA were measured in 200 ⁇ l blood.
  • PAXgenes 0.1-0.25 ng G6P-DH mRNA was measured in 200 ⁇ l blood. With the NAST-PRIS system according to the invention, 50-100 times more mRNA is isolated
  • NAST-PRIS 190 - 430 ng G6P-DH genes were measured in 200 ⁇ l blood.
  • PAXgenes 544 - 1200 ng G6P-DH genes were measured in 200 ⁇ l blood.
  • RNA such as mRNA and viral RNA and DNA (e.g. HCV, CMV)
  • NAST and NsS were used synonymously.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zum Binden von Nukleinsäuren in wässriger Lösung an eine Festphase, enhaltend ein Guanidiniumsalz, eine Puffersubstanz und ein Detergenz, gekennzeichnet dadurch, dass der pH-Wert der Lösung ≥ 7.0 ist. Weiterhin betrifft die Erfindung einen Kit zum Isolieren von Nukleinsäure, enthaltend folgende Bestandteile: a) eine wässrige Nukleinsäure-stabilisierende Lösung, enhaltend folgende Bestandteile: ein Guanidiniumsalz, eine Puffersubstanz, ein Reduktionsmittel, und/oder ein Detergenz; b) eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9; und c) eine Festphase, die Nukleinsäuren binden kann; und Verfahren zum Isolieren einer Nukleinsäure.

Description

Zusammensetzung zum Binden von Nukleinsaure an eine Festphase
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zum Optimieren des Bindens von Nukleinsaure, vorzugsweise aus Blut stammend, in wässriger Lösung an eine Festphase, sowie einen Kit zum Isolieren von Nukleinsaure.
In der WO 00/09746 wird ein Gefäß zur Blutentnahme beschrieben, das eine Lösung enthält, die als Bestandteile ein Guanidiumiumsalz, eine Puffersubstanz, ein Reduktionsmittel und/oder ein Detergenz umfasst. Das Gefäß ist besonders geeignet zur. Entname von Blut, das auf Nukleinsäuren hin untersucht werden soll.
Die WO 01/60517 beschreibt ein Gefäß zur Probenentnahme, das eine Nukleinsäure- stabilisierende Lösung und eine Nukleinsäure-bindende Festphase enthält. Das Gefäß ist besonders geeignet zur Entnahme von Blut, das auf Nukleinsaure hin untersucht werden soll.
Während der Abnahme von z.B. Blut wird dieses herkömmlicherweise in Gefäßen aufgefangen, die bereits Antikoagulantien wie z.B. Heparin, Citrat oder EDTA enthalten. So wird verhindert, dass das Blut gerinnt. So gewonnene Blutproben lassen sich längere Zeit bei geeigneten Temperaturen lagern. Diese Art der Blutgewinnung hat jedoch erhebliche Nachteile, wenn Nukleinsäuren, wie z.B. mRNA oder virale RNA und DNA analysiert werden sollen. Für solche Zwecke sollten die Nukleinsäuren, die in der Probe enthalten sind, am besten bereits im Moment der Abnahme stabilisiert werden, d.h. es sollte der Abbau der vorhandenen Nukleinsäuren, aber auch die Neusynthese von mRNA verhindert werden.
Dieses Ziel der stabilen Lagerung der im Probenmaterial enthaltenen Nukleinsäuren vom Moment der Abnahme an ist bei der Lagerung, insbesondere von Blut, aus folgenden Gründen bis jetzt praktisch nicht zu bewerkstelligen:
Zellen enthalten Nukleasen, d. h. Enzyme, die Nukleinsäuren zerstören, sobald sie mit ihren Substraten (RNA, DNA) in Kontakt kommen. Die Wirkung zellulärer und extrazellulärer Nukleasen ist normalerweise unter physiologischer Kontrolle, solange die Zellen in ihrer normalen Umgebung sind. Die Entnahme von Blut führt zu mehr oder weniger starken Veränderungen der in den Zellen enthaltenen Nukleinsäuren. Nukleasen werden dann innerhalb der Zellen und/oder durch die Lyse von Zellen nach außen freigesetzt. Außerdem werden Nukleinsäuren mehr oder weniger stark synthetisiert. Gerade die Langzeitlagerung von biologischen Proben, wie Blut, führt zur Alterung und Zerstörung der Zellen.
Die oben geschilderten Probleme der Stabilität von Nukleinsaure in Blutproben trifft in ähnlicher Art und Weise auch auf Nukleinsäuren aus anderen biologischen Proben, wie z.B. Speichel und Gewebeproben, zu.
Ein weiteres Problem bei der Langzeitlagerung von biologischen Proben (z.B. Blut), die nach herkömmlichen Abnahmeverfahren gewonnen wurden, ist die starke Veränderung des Probenmaterials. Solche Veränderungen, wie z.B. starke Lyse von Zellen, können dazu führen, dass die Standardverfahren der Nukleinsäureisolierung nicht mehr mit befriedigender Effizienz und Reproduzierbarkeit funktionieren.
Abgesehen von den Problemen einer stabilen Lagerung von Nukleinsäuren, die im Probenmaterial enthalten sind, ergeben sich beim herkömmlichen Verfahren der Probenentnahme (z.B. Blut) weitere Schwierigkeiten. Z.B. werden die herkömmlichen Antikoagulantien oft bei der Nukleinsäureisolierung nicht mit genügender Effizienz abgetrennt und stören bei der nachfolgenden Nukleinsäureanalytik, wie z.B. bei der Amplifikation mittels PCR (Polymerase Chain Reaction). Heparin ist z.B. ein allgemein bekannter Inhibitor der PCR.
Schließlich ergibt sich bei der quantitativen Nukleinsäureanalytik die Frage, wie das gesamte Verfahren von der Probennahme bis hin zur Nukleinsäuremessung unter standardisierten Bedingungen kontrolliert und optimiert werden kann. Idealerweise sollte dem Probenmaterial bereits bei der Entnahme eine in Menge und Qualität definierte Standardnukleinsäure zugesetzt werden, die dem gesamten Prozeß der Probennahme bis hin zur Bestimmung unterzogen wird. Die ursprünglich in der Pobe enthaltenen Nukleinsaure sollte auch möglichst quantitativ der Analytik zugeführt werden. Dies ist insbesondere von Bedeutung bei der Diagnostik, da sich hierbei, je nach Befund, unterschiedliche Konsequenzen in der Behandlung des Probenspenders ergeben können. Auch dies ist mit den herkömmlichen Abnahme- und Isoliersystemen nicht zu bewerkstelligen.
Ein weiterer Nachteil der konventionellen Probenentnahme, wie Blutentnahme, ist die Gefahr der Übertragung von infektiösem Material, da bisher für die Nukleinsäureisolierung manuelle Verfahrensschritte notwendig sind. Ein Kontakt mit potentiell infektiösen Erregern kann nicht ausgeschlossen werden.
In der Literatur ist ein Verfahren beschrieben, bei dem eine Blutprobe unmittelbar nach der Abnahme vom Patienten mit Guanidiniumsalz vermischt wird (EP 0 818542 A1). Bei diesem Verfahren liegt das Guanidiniumsalz in Pulverform vor, um somit die höhere Stabilität des Guanidiniumsalzes zu nutzen. Dieses Verfahren besitzt jedoch gravierende Nachteile, da sich das Salz z.B. zunächst in dem zugegebenen Blut lösen muss. Der Lösungsvorgang ist insbesondere temperaturabhängig und aufgrund des verwendeten, undurchsichtigen Probenmaterials nicht zu kontrollieren. Die Verwendung eines entspechenden Produktes für diagnostisch-medizinische Zwecke ist somit äußerst problematisch.
Nukleasen sind äußerst aktive Enzyme, die insbesondere in Körperflüssigkeiten/- sekreten, wie Speichel oder Blut, in hoher Konzentration vorkommen, und die nur unter extrem denaturierenden Bedingungen zu inhibieren sind. Die Denaturierung ist abhängig von der Konzentration des Guanidiniumsalzes in Lösung. Eine inhibierende Konzentration von Guanidiniumsalz in Lösung ist bei dem Verfahren der EP 0 818 542 nicht von Anfang an gegeben. Es kommt also zum unkontrollierten Abbau von Nukleinsäuren während des Lösungsvorgangs. Bei diesem Verfahren wird außerdem auf den Zusatz von reduzierenden Agenzien verzichtet, ohne die eine wirksame Inhibition - insbesondere von RNasen - in der Regel nicht gewährleistet ist. Schließlich trifft die EP 0 818 542 keinerlei Maßnahmen zur möglichst quantitativen Isolierung der Nukleinsaure des Probenmaterials.
Die gemäß herkömmlicher Methoden erhaltene Probe kann außerdem nicht direkt für die weitere Nukleinsäureisolierung an Festphasen verwendet werden. Die Verwendung von Guanidiniumsalzpulver erlaubt außerdem nicht den Zusatz von internen Nukleinsäurestandards. Solche Standards sind zur Verfahrenskontrolle und genauen Quantifizierung jedoch unerläßlich.
Der vorliegenden Erfindung lag das technische Problem zugrunde, Mittel zum Optimieren der Ausbeute an Nukleinsäuren aus biologischen Proben anzugeben, insbesondere Mittel anzugeben, die die Bindung von Nukleinsaure aus der Probe an eine Festphase optimieren. Schließlich sollen die Mittel ein verbessertes Nukleinsäureanalyseverfahren aus biologischen Proben mit einer niedrigeren Nachweisgrenze ermöglichen, wobei dies insbesondere im Rahmen der Diagnostik wünschenswert ist.
Dieses Problem wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Zusammensetzung zum Optimieren des Bindens von Nukleinsaure in wässriger Lösung an eine Festphase (Bindelösung auch PrIS genannt), enthaltend ein Guanidiniumsalz, eine Puffersubstanz und ein Detergenz, gekennzeichnet dadurch, dass der pH-Wert der Lösung > 7,0, vorzugsweise > 7,5, ganz besonders bevorzugt > 8,0 ist.
Dieses Problem wird auch gelöst durch einen Kit zum Isolieren von Nukleinsaure, enthaltend folgende Bestandteile: a) eine wässrige Lösung zum Stabilisieren von Nukleinsaure (auch N-sS oder NAST genannt) , enhaltend folgende Bestandteile: - ein Guanidiniumsalz, und/oder - eine Puffersubstanz, und/oder - ein Reduktionsmittel, und/oder - ein Detergenz; b) eine Zusammensetzung zum Optimieren des Bindens von Nukleinsaure in wässriger Lösung an eine Festphase, enthaltend ein Guanidiniumsalz, eine Puffersubstanz und ein Detergenz, gekennzeichnet dadurch, dass der pH- Wert der Lösung > 7,0 ist; und c) eine Festphase, die Nukleinsäuren binden kann.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen angegeben. Der Kit bietet folgende Vorteile: 1. Die Probe, vorzugsweise Blut, wird bereits im Moment der Abnahme lysiert, indem das Abnahmegefäß bereits eine entsprechende Lyselösung, welche gleichzeitig eine Nukleinsäure-stabilisierende Lösung ist, enthält. 2. Die Nukleinsäure-stabilisierende Lösung bewirkt, dass das Probenmaterial, insbesondere die darin enthaltenen Nukleinsäuren, unmittelbar nach Kontakt mit der Lösung stabilisiert werden. 3. Die Nukleinsäure-stabilisierende Lösung ist ferner so gewählt, dass das Probenmaterial direkt in nachfolgenden Isolierungsverfahren verwendet werden kann. 4. Die Nukleinsäure-stabilisierende Lösung kann bei der nachfolgenden Isolierung so effizient abgetrennt werden, dass eine Hemmung bspw. der PCR nicht auftritt. 5. Der Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung kann ein interner Standard zugesetzt werden. Dieser erlaubt die Kontrolle des gesamten Verfahrens von der Probenentnahme bis hin zur Nukleinsäuredetektion. 6. Die in dem Gefäß enthaltene Festphase eignet sich insbesondere für eine spätere Isolierung der daran gebundenen Nukleinsaure. 7. Der Zusatz der Zusammensetzung zum Binden der Nukleinsaure an eine Festphase, "Bindelösung", führt - ohne an eine Theorie gebunden zu sein - zu einer Freisetzung der Nukleinsäuren aus evtl. entstandenen Präzipitaten von Blutbestandteilen und einer verbesserten Bindung der Nukleinsaure an die Festphase und somit zu einer erhöhten Ausbeute an isolierter Nukleinsaure, die der Analytik zur Verfügung steht. Außerdem wird durch die Bindung der Nukleinsäuren an die Festphase die anschließende Isolierung vereinfacht, indem bereits eine erste Trennung von Nukleinsaure und weiteren Probenbestandteilen in dem Gefäß erfolgt.
Die Nukleinsäure-stabilisierende Lösung kann so gewählt werden, dass die Nukleinsaure sofort nach der Zellyse an die entsprechende Oberfläche bindet oder erst nach Zusatz weiterer Reagenzien. Der erste Fall ist bspw. gegeben wenn eine Glasoberfläche in Anwesenheit eines Guanidiniumsalzes vorgegeben wird. Der zweite Fall lässt sich durch den Zusatz der "Bindelösung" oder z.B. durch Vorlegen einer Biotin- beschichteten Oberfläche und nachträglichem Hinzufügen von Streptavidin mit Nukleinsaure bindenden Eigenschaften erzielen bzw. optimieren.
Der Kit lässt sich grundsätzlich für die Aufarbeitung beliebiger Körperflüssigkeiten verwenden. Insbesondere ist er für die Aufarbeitung von Körperflüssigkeiten geeignet, die zelluläre Bestandteile enthalten, wie z. B. Knochenmark, aber auch z.B. Speichelproben. Vorzugsweise handelt es sich jedoch um einen Kit zur direkten Entnahme von Vollblut aus einem Spender.
Der Kit enthält vorzugsweise ein Gefäß, das vorzugsweise aus einem herkömmlichen Blutentnahmegefäß (z. B. Röhrchen) besteht, in dem ein definiertes Volumen einer Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung und eine Nukleinsäure-bindende Festphase enthalten sind. Das Röhrchen wird anschließend vorzugsweise mit einem definierten Unterdruck versehen, der ermöglicht, dass nur ein bestimmtes Volumen Blut entnommen wird. Das Röhrchen kann mit konventionellen Methoden der Blutabnahme gehandhabt werden. Die in dem Röhrchen enthaltene Stabilisierungslösung enthält in ihrer bevorzugten Ausführungsform folgende Reagenzien: ein Guanidiniumsalz, z. B. Guanidiniumthiocyanat, ein Detergenz, z. B. Triton-X-100, ein Reduktionsmittel, z. B. Dithiothreitol, und ein geeignetes Puffersystem wie z.B. Citrat, Tris, MES oder Hepes. In der beschriebenen Zusammensetzung ist die Lösung kompatibel mit dem Vakuumröhrchen. Die Lösung kann problemlos in dem Vakuumröhrchen gelagert werden, ohne dass es zu einer Beeinträchtigung der gewünschten stabilisierenden Funktion kommt. Das gesamte System ist insbesondere für den Blutspender problemlos und sicher bei der Probennahme.
Die Nukleinsäure-stabilisierende Lösung, enthaltend das Guanidiniumsalz, welches als Lyse- und stabilisierende Substanz dient, die Nukleinsaure bindende Festphase, die Puffersubstanz, das Reduktionsmittel und das Detergenz ist lagerungsstabil und verwandelt das zugeführte, frisch entnommene Material, wie Blut, in ein Material, das ebenfalls lagerungsstabil ist und das für die weitere Nukleinsäureanalyse bzw. - isolierung unmittelbar verwendet werden kann.
Als Guanidiniumsalz sind Guanidiniumthiocyanat und/oder Guanidiniumchlorid bevorzugt.
Vorzugsweise liegt das Guanidiniumsalz in einer Konzentration von 1 bis 8,0 M vor.
Als Puffersubstanz ist Tris oder Citrat bevorzugt, wobei der exakte pH vorzugsweise mit HCI eingestellt wird. Weitere mögliche Puffer sind jedoch HEPES, MOPS, MES, Citrat- und Phosphatpuffer, wie z.B. PBS. Als Festphase können alle Nukleinsaure bindenden Materialien eingesetzt werden. Besonders geeignet sind Glaspartikel, Nukleinsaure bindende Polymere, mit solchen beschichtete Partikel, Nukleinsaure bindende Beschichtungen des Entnahmesystern oder mit Silika beschichtete Partikel. Die Oberfläche der Nukleinsäure-bindenden Festphase kann alternativ mit spezifischen Bindemolekülen (z.B. Streptavidi , Oligonukleotide, peptide nucleic acids (PNAs), etc.) beschichtet werden, die mit Markermolekülen auf der Nukleinsaure oder mit der Nukleinsaure direkt wechselwirken . Die Formgebung der Materialien ist nur abhängig von der Form des Entnahmesystern und der nachfolgenden Isolierungsmethode. Besonders geeignet sind Formgebungen, die im Anschluß direkt bei der weiteren Verarbeitung der Nukleinsaure eingesetzt werden können, ganz besonders geeignet sind Oberflächen, die mit herkömmlichen Isolierungsverfahren kompatibel sind, wie z.B. Magnetpartikel oder Vliese.
Geeignete Festphasen sind gewerblich erhältlich, z. B. Silica beschichtete Magnetpartikel, wie sie im mRNA Isolation Kit for Blood/Bone Marrow (Röche) enthalten sind.
Die Pufferkonzentration in der Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung liegt vorzugsweise zwischen 10 und 300 mM, besonders bevorzugt zwischen 10 und 100 mM.
Als Detergenz in der Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung ist Triton-X-100 bevorzugt- Weitere mögliche Detergenzien sind NP-40, Tween 20, Polydocanol oder andere Detergenzien.
Die Detergenzkonzentration in der Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung liegt vorzugsweise bei 5 bis 30 % (w/v), besonders bevorzugt bei 10 bis 20 % (w/v).
Als Reduktionsmittel ist DTT bevorzugt, wobei jedoch auch ß-Mercaptoethanol, TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphin) oder andere Reduktionsmittel einsetzbar sind.
Die bevorzugte Konzentration des Reduktionsmittels in der Nukleinsäure- stabilisierenden Lösung liegt bei 0,1 bis 10 % (w/v); besonders bevorzugt sind 0,5 bis 2 % (w/v). Der pH der Lösung liegt in der Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung vorzugsweise bei 3,0 bis 9,0, besonders bevorzugt bei 4,0 bis 7,5.
Der pH der Lösung wird insbesondere so gewählt, dass sich nach Zugabe des Probenmaterials in der Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung ein pH-Wert im Bereich von 5,0 bis 7,5 einstellt. Da durch Vorgabe des Unterdrucks sichergestellt wird, welches Probenvolumen entnommen wird, kann durch Vorlegen einer gewünschten Pufferkonzentration bzw. einem entsprechenden Volumen an Lösung gewährleistet werden, dass nach Aufnahme des vollständigen Probenvolumens der gewünschte pH auch erzielt wird. Besonders bevorzugt ist ein pH zwischen 6,3 und 6,9 nach Probenaufnahme.
Eine besonders bevorzugte Nukleinsäure-stabilisierende Lösung enthält 3-4 M Guanidiniumthiocyanat, 40-80 mM Tris, 11-14 % (w/v) Triton-X-100, 40-80 mM DTT, eine Festphase aus Glaspartikeln oder Silika beschichteten Magnetpartikeln, wobei der pH so eingestellt wird, dass sich nach Blutzugabe ein pH von 6 bis 7,5 ergibt.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das Volumen zur Aufnahme der Blutprobe einen Unterdruck auf, der so eingestellt werden kann, dass ein vorab bestimmtes Blutvolumen in das Entnahmegefäß eingesaugt wird, nachdem ein Blutgefäß angestochen wurde. Entsprechend evakuierte Gefäße sind auf dem Markt erhältlich.
Das Gefäß, enthaltend das entnommene Blut, kann dann sofort der weiteren Schritte z:ur Analytik zugeführt werden oder aber für einen längeren Zeitraum (bis mehrere Tage oder Wochen) ohne Nachteile für die Qualität der Probe aufbewahrt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die frisch entnommene Probe, wie Blut, direkt in dem Entnahmegefäß mit der oben beschriebenen Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung in Kontakt gebracht, so dass sofort sämtliche Vorgänge, die das Nukleinsäuremuster der Probe verändern können, gestoppt werden. Die Nukleinsäuren können vorzugsweise bereits im Gefäß an der Festphase gebunden vorliegen oder in einem weiteren Reaktionsschritt an die Festphase gebunden werden, wobei das Ausmaß der Bindung durch die Zugabe der erfindungsgemäßen Bindelösung optimiert wird.
Die später im Rahmen der Nukleinsäureanalytik ermittelten Daten hinsichtlich der nachgewiesenen Nukleinsäuren stellen daher sehr genau den Ist-Zustand zum Zeitpunkt der Blutentnahme dar, sowohl hinsichtlich der Mengen als auch der Arten der Nukleinsäuren.
Vorzugsweise entspricht die entnommene Blutmenge dem 0,1- bis 2-fachen der in dem Gefäß vorgelegten Lösung. Letztere beträgt vorzugsweise 0,5 bis 5,0 ml. Somit liegt die Endkonzentration an Guanidiniumsalz nach Probenzusatz vorzugsweise bei 1 ,0 bis 5 M, vorzugsweise bei 1,0 bis 3,0 M, bevor die -Bindelösung zugesetzt wird.
Nach Zugabe der Bindelösung zum Gefäß, enthaltend das Probenmaterial, wie Blut, und die Nukleinsäure-stabilisierende Lösung, enthält die Lösung in dem Gefäß vorzugsweise: - ein Guanidiniumsalz in einer Konzentration von 1 bis 8 M; - ein Detergenz in einer Konzentration von 5 bis 25 % (w/v); - einen Puffer in einer Konzentration von 100 bis 500 mM; - ein Reduktionsmittel in einer Konzentration von 5 bis 50 mM; und hat einen pH-Wert von > 7.5, vorzugsweise > 8,0.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Gefäß mit Blutprobe, Stabilisierungslösung und Bindelösung folgende Bestandteile: - ein Guanidiniumsalz in einer Konzentration von 1 ,5 bis 5, vorzugsweise von 2,5 bis 3,5 M; - ein Detergenz in einer Konzentration von 8 bis 20, vorzugsweise 10 bis 16 % (w/v); - ein Puffer in einer Konzentration von 150 bis 400, vorzugsweise 200 bis 300 mM; - ein Reduktionsmittel in einer Konzentration von 20 bis 40 mM, vorzugsweise 25 bis 35 mM; und mit - einem pH > 7,0, vorzugsweise > 7,5, besonders bevorzugt > pH 8,0. Weiterhin ist bevorzugt, dass die oben genannte Lösung aus Blutprobe, NsS und PrIS einen pH≤ 10, vorzugsweise < pH 9,0 aufweist. Diese Maßnahme minimiert eine alkalische Hydrolyse der Nukleinsaure.
Der erfindungsgemäße Kit wird vorzugsweise dann zur Probenentnahme eingesetzt, wenn die Probe für die Nukleinsäureanalytik verwendet werden soll.
Die Verwendung o.g. Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung als Bestandteil des beschriebenen Abnahmesystems garantiert die sofortige Lyse der Zellen und simultane Stabilisierung der Probe durch unmittelbare Inaktivierung der Nukleasen. Überraschenderweise kann die so gewonnene Probe selbst bei Raumtemperatur über mehrere Tage gelagert werden. Das Abnahmesystem gewährleistet außerdem eine kontaminationssichere und nicht-infektiöse Handhabung von der Probennahme über die Nukleinsäureisolierung bis hin zur Analytik. Bei den herkömmlichen Verfahren der Nukleinsäureisolierung sind bisher immer zusätzliche Handhabungsschritte (wie die Überführung der entnommenen Blutprobe in die Reagenzien zur Nukleinsäureisolierung usw.) notwendig, die mit einem zusätzlichen Infektionsrisiko oder Kontaminationsrisiko der Probe verbunden sind, wie eingangs bereits ausführlich beschrieben wurde. Obwohl der Kit im wesentlichen im Zusammenhang mit einem Gefäß zur Aufnahme von Blut beschrieben worden ist, gilt das Gesagte auch für andere Systeme zur Aufnahme biologischer Proben, wie Abstriche.
Überraschenderweise kann die zum Teil an die Festphase gebundene Nukleinsaure auch nach längerer Lagerung einfach aus dem Probenmaterial isoliert werden. Während der Lagerung der stabilisierten Nukleinsaure können mit zunehmender Lagerungsdauer zunehmend Präzipitate, bestehend aus Blutbestandteilen, wie z.B. Porphyrinsalze des Hämoglobins, entstehen, an die Nukleinsaure teilweise bindet. Die Anwesenheit der bindenden Festphase während der Probenlyse und -Stabilisierung führt zu einer sofortigen Bindung einiger Nukleinsäuren, vorwiegend DNA an die Oberfläche. Erst durch Zusatz der Bindelösung wird eine vollständige Freisetzung der Nukleinsaure aus den evtl. entstandenen Präzipitaten und eine optimale Bindung derselben an die Festphase erzielt. Der Zusatz sollte unmittelbar vor dem eigentlichen Isolierungsschritt erfolgen, da durch Zugabe der Bindelösung keine optimale Stabilisierung der Nukleinsaure mehr gewährleistet ist. Vorzugsweise erfolgt der Zusatz der Bindelösung unmittelbar vor der eigentlichen Probenaufarbeitung zur Isolierung der Nukleinsaure.
Die mit dem Kit gewonnene Probe kann gängigen Nukleinsäureisolierungsverfahren zugeführt werden; bei Verwendung von Silika beschichteten Magnetpartikeln oder Silica- Vliese in Säulen ist es möglich, auf gängige Standardverfahren der Nukleinsäureisolierung zurückzugreifen (Magnetseparation bzw. Zentrifugation oder Unterdruck, Waschen, Elution der Nukleinsaure).
Die vorliegende Erfindung besteht somit aus einem Probenaufnahmesystem, das so konzipiert ist, dass folgende Bedingungen erfüllt werden: 1. Kontrollierte Probenentnahme und gleichzeitige Stabilisierung der im Probenmaterial enthaltenen Nukleinsäuren (DNA, RNA). 2. Probenentnahme, bei der auf den Einsatz von Antikoagulantien vollkommen verzichtet werden kann. 3. Optimierte Bindung der Nukleinsäuren an eine im System enthaltene Festphase. 4. Die mit dem beschriebenen System gewonnene Probe kann leicht in bestehende Nukleinsäureisolierungssysteme integriert werden. 5. Das System samt darin enthaltener Probe ist lagerungsstabil.
Zusätzlich wurde überraschenderweise festgestellt, dass die mit dem beschriebenen Abnahmesystem gewonnene Probe in dem Gefäß über längere Zeit ohne Degradation der Nukleinsäuren lagerungsstabil ist.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Abb. 1: Probenentnahmegefäß mit Nukleinsäure-stabilisierender Substanz (N-sS), definiertem Vacuum, mit Festphase versetzt und mit Septum versiegelt.
Abb. 2: Graphische Darstellung einer Gelanalyse (1% Agarose) von 28S und 18S rRNA, die im Probeentnahmegefäß unterschiedlich lange gelagert wurde. Spalte 1 : Isolierung und Auftrennung der RNA unmittelbar nach Probenentnahme (keine Lagerung), Spalte 2: Lagerung für einen Monat bei -20°C, Spalte 3: Lagerung für 6 Tage bei 4°C. Die Menge der aufgetragenen RNA entsprach einem Blutvolumen von 120 μl.
Abb 3: Graphische Darstellung einer Gelanalyse (1 % Agarose) von DNA, die im Probeentnahmegefäß unterschiedlich lange gelagert wurde. Spalte 1 : Isolierung unmittelbar nach Probenentnahme (keine Lagerung), Spalte 2: Lagerung für einen Monat bei -20°C, Spalte 3: Lagerung für 6 Tage bei 4°C. Die Menge der aufgetragenen DNA entsprach einem Blutvolumen von 10 μl.
Abb. 4:
Graphische Darstellung einer Gelanalyse von isolierter MS2-RNA nach Inkubation in
Serum/Stabilisierungslösung mit/ ohne DTT nach 180 min bei 40 °C.
Spalte 1: Positiv Kontrolle: MS-2 RNA; Spalte 2: DNA Marker; Spalten 3 bis 5: MS-2
RNA nach Inkubation mit DTT-haltiger Stabilisierungslösung (3-fach Bestimmung);
Spalten 6 bis 8: MS-2 RNA nach Inkubation mit Stabilisierungslösung ohne DTT (3-fach
Bestimmung).
Abb. 5:
Graphische Darstellung einer Gelanalyse von MS2-RNA, die nach Inkubation in Serum / Stabilisierungslösung für 3 Tage bei 40°C isoliert wurde. Der Guanidiniumthiocyanatgehalt (GTC Gehalt) der Stabilisierungslösung nach Serumzugabe, in welcher die betreffende RNA inkubiert wurde, ist in der entsprechenden Spalte angegeben. Spalte 1 : 2.70M GTC, Spalte 2: 2,5 M GTC, Spalte 3: 2,36 M GTC, Spalte 4: 2.2M GTC, Spalte 5: 2,08 M GTC, Spalte 6: 1,94 M GTC, Spalte 7: 1,80 M GTC, Spalte 8: 1.66M GTC.
Abb. 6: Graphische Darstellung einer Gelanalyse der PCR Amplifikate von MS2-RNA, welche nach 1 bzw. 8 Tagen Inkubation bei 40°C in Serum/Stabilisierungslösung isoliert wurde. Spalte 1 : Amplifikat der nach einem Tag isolierten RNA, Spalte 2: Amplifikat der nach 8 Tagen isolierten RNA. Spalte 3: DNA Marker, Spalte 4: MS2-RNA positiv Kontrolle: 0,8μg in 10μl RT 1:50 verdünnt, 1μl amplifiziert.
Abb. 7: Graphische Darstellung einer Gelanalyse von isolierter MS2-RNA nach 6 (Spalten 2-12) bzw. 13 (Spalten 14-19) Tagen Inkubation bei Raumtemperatur in Serum/Stabilisierungslösung. Hinter den betreffenden Spalten steht der pH-Wert, welcher nach Mischung von Serum und Stabilisierungslösung erreicht wurde.
Spalte 1, 13, 20: DNA-Marker, Spalte 2: pH 8.0, Spalte 3: pH 7.7, Spalte 4: pH 7.5, Spalte 5: pH 7.35, Spalte 6: pH 7.18, Spalten 7, 14: pH 7.07, Spalten 8, 15: pH 6.94, Spalten 9, 16: pH 6.8, Spalten 10, 17: pH 6.72, Spalten 11, 18: pH 6.68, Spalten 12, 19: pH 6.7. Die Stabilisierungslösung der RNA in Spalten 12, 19 hatten den gleichen pH Wert, wie die der RNA in Spalte 11, enthielt aber 5M 4 M GTC anstelle von 4 M 3 M.
Abb. 8:
Graphische Darstellung des Nachweises von RNA und DNA im Standard Agarosegel (1% Agarose). Spalte 1 : Molekulargewichtsmarker, Spalte 2 bis 4: Isolierte Nukleinsäuren; Spalte 2: Nukleinsaure aus Vollblutlysat versetzt mit MS2 RNA (7 Tage), Spalte 3: Nukleinsaure: aus Vollblutlysat versetzt mit MS2 RNA (0 Tage, Kontrolle), Spalte 4: Nukleinsaure aus Vollblutlysat (7 Tage) , Spalte 5: Nukleinsaure aus Vollblutlysat (0 Tage, Kontrolle). Die oberen Banden zeigen chromosomale DNA (bei allen 4 Proben deutlich erkennbar), die unteren Banden in den Spalten 2 und 3 zeigen die zugesetzte und isolierte MS2 RNA. Beispiel 1:
Blutentnahmesvstem
Das Blutentnahmesystem kann in einer bevorzugten Ausführungsform folgendermaßen zusammengesetzt sein (s. Abb. 1): Ein Röhrchen wird mit einem definierten Volumen der Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung gefüllt, mit einer Nukleinsäure-bindenden Festphase und mit einem definierten Vakuum versehen, dann mit einem Septum verschlossen. Das Septum ist so konstruiert, dass es mit dem gängigen Probenentnahmezubehör (Kanüle usw.) kompatibel ist. Im vorliegenden Beispiel wurden 2;2 ml Reagenz vorgelegt und das Vakuum war so eingestellt, dass bei der Probennahme exakt 1 ,3 ml Blut zufließen konnten. Die im zufließenden Blutstrom enthaltenen Nukleinsäuren wurden unmittelbar in eine stabile Form überführt.
Allgemeine Vorbemerkung zu den nachfolgenden Beispielen.
Wenn nicht anders erwähnt hatte bei allen nachfolgend beschriebenen Beispielen die Nukleinsäure-stabilisierende Substanz (N-sS) folgende Zusammensetzung: 45 mM Tris, 5 M Guanidiniumthiocyanat, 0,8 (w/v) Dithiothreitol, 18 % (w/v) Triton-X-100, pH 6,0.
In allen beschriebenen Beispielen wurde die Nukleinsäure-stabilisierende Substanz mit der Probe im Verhältnis 1 zu 0,59 gemischt (1 Volumen N-sS plus 0,59 Volumen Probenmaterial).
Für alle Beispiele wurde Blut dadurch stabilisiert, dass es unmittelbar bei der Entnahme in das mit N-sS versetzte Röhrchen gegeben wurde. Beispiel 2:
Stabilität von Nukleinsaure nach Mischung von Probenmaterial und N-sS. Isolierung von RNA und DNA vom Probenlvsat mit silikaderivatisierten Oberflächen.
Material und Methode:
Das Probenmaterial für die DNA- und RNA-Isolierung wurde unmittelbar nach der Entnahme, nach Lagemng für 6 Tage bei 4°C und nach Lagemng für 1 Monat bei -20°C verwendet.
Für die Isolierung von RNA (Abb. 2) wurde der HighPure RNA Isolation Kit (Röche, Kat.- Nr. 1 828665) verwendet. Die Beipackzettelvorschrift wurde folgendermaßen modifiziert: Ein Volumen von 2,4 ml Probenlysat wurde in 4 Aliquots mit jeweils 600 μl auf die Säule aufgetragen, so dass insgesamt Probenmaterial aus 2,4 ml Lysat aufgetragen wurden. Alle anderen Schritte wurden entsprechend dem Beipackzettel ausgeführt. Die RNA wurde schließlich mit 100 μl Elutionspuffer eiuiert.
Zur Isolierung von DNA (Abb. 3) wurde der QiaAmp Blood Kit (Qiagen-Kat.-Nr.29104) eingesetzt. Die im Beipackzettel beschriebene Standardprozedur wurde in verschiedenen Punkten modifiziert: 400 μl Probenvolumen wurden direkt auf die Säule gegeben, wobei das im Kit enthaltene Bindereagenz nicht eingesetzt wurde.25 μl Proteinase-K-Stocklösung wurden zugefügt und die Probe 10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die Säule in ein Sammelgefäß gestellt und wie im Beipackzettel beschrieben zentrifugiert. Alle weiteren Schritte wurden, bis auf die Verwendung von Ethanol, wie im Beipackzettel beschrieben durchgeführt. Das Elutionsvolumen war 200 μl. Beispiel 3
Bedeutung von reduzierenden Reagenzien (z.B. DTT) in der Stabilisierunoslösunα für die Langzeitstabilisierung von RNA
Material und Methode: Verwendete Stabilisierungslösung: 4.0 M GTC; 13,5 % Triton X100; 45 mM Tris/HCI; mit 120 mM bzw. ohne DTT 700 μl Serum wurden mit 700 μl Stabilisierungslösung gemischt. Nach 2 min Inkubation wurden 20 μl MS2-RNA (0.8 μg/μl von Röche Diagnostics) zugegeben. Die Proben wurden für 180 min bei 40 °C inkubiert und anschließend in Aliquots a 400 μl mit dem High Pure total RNA Kit von Röche entsprechend Experiment 1 aufgearbeitet. Die Proben wurden in 50 μl eluiert und bei - 20 °C eingefroren. Die Analytik erfolgte mittels Agarosegel (siehe Abb.4).
Ergebnis: Ohne den Zusatz von reduzierenden Reagenzien zur Stabilisierungslösung kann keine Langzeitstabilisierung von RNA erreicht werden.
Beispiel 4
Stabilität von MS2-RNA in Serum/Stabilisierungslösung: Abhängigkeit von der GTC Konzentration
Material und Methode
Verwendete Stabilisiemngslösungen: 3 - 5 M GTC; 13.5 % Triton X100; 50 mM DTT; 42 mM Tris/HCI; pH der Lösungen: ca. 5,0; pH der Lösungen nach Se mzugabe: ca.6.7.
2,0 ml Serum wurden mit 2.5 ml der jeweiligen Stabilisierungslösungen gemischt. Nach einer Inkubationszeit von 2-5 min wurden 90 μl MS2-RNA (0.8 μg/μl von Röche) zugegeben und bei 40 °C inkubiert. In regelmäßigen Abständen wurden 400 μl Probe entnommen und mit dem High Pure total RNA Kit von Röche entsprechend Experiment 1 aufgearbeitet. Die Proben wurden in 50 μl eluiert und bei - 20 °C eingefroren. Für die Analyse der RNA-Integrität wurden 20 μl des Eluates auf ein 1,5 %iges Agarosegel aufgetragen (Abb. 5). Die RT-PCR-Analytik erfolgte mittels AMV-RT und PCR. Jeweils 10 μl der Eluate wurden mittels AMV-RT (Röche) reverse transkribiert und anschließend mittels quantitativer PCR auf dem Lightcycler analysiert.
Ansatz für RT: 4.0 μl AMV-RT-Puffer (42 °C für 1 h) 2.0 μl dNTP's ( Endkonzentration 10 mM) 0.5 μl R Naseinhibitor (Röche, 20 units) 1.0 μl Primer 2827 (Endkonzentration 1 μM) 1.9 μl DMPC-Wasser 0.6 μl AMV-RT (Röche, 15 units) 10 ul Template-RNA 20 μl
Die PCR wurde auf dem Lightcycler bei einer Annealingtemperatur von 61 °C unter Verwendung von SYBR-Green als Detektionssystem durchgeführt. Alle Proben mit einem Treshold-Cycle größer 20 werden als negativ betrachtet, da das detektierte Signal ausschießlich auf die Bildung von Primerdimeren zurückzuführen ist. Dies kann durch die Analyse der Schmelzkurven am LightCycler (Röche) eindeutig bewiesen werden. Das RT-Produkt wurde 1:50 mit bidest. Wasser verdünnt und 1 μl davon für eine 10 μl-PCR gemäß folgendem Schema eingesetzt:
Ansatz für PCR: 1.6 μl gCI2 (Stammlsg.25 mM) 5.9 μl DMPC-Wasser 0.25 μl Primer 2827 (Stammlsg. 20 mM) 0.25 μl Primer 2335 (Stammlsg. 20 mM) 1.0 μl SYBR-Green-Mastermix (Röche) 1.0 ul RT-Ansatz 10 μl Das Amplifikat der PCR wurde vollständig auf ein 2 %iges Agarosegel aufgetragen (siehe Abb. 6). Ergebnis:
Abb. 5 zeigt die eluierte MS2-RNA nach 3 Tagen Inkubation bei 40 °C detektiert im Agarosegel. Obwohl nach 8 Tagen bei 40 °C noch alle RNA-Proben amplifiziert und eindeutig nachgewiesen werden können (Abb. 6), sind bereits nach 3 Tagen deutliche Unterschiede der RNA-Integrität in Abhängigkeit vom GTC-Gehalt zu erkennen. Demnach ist ein Salzgehalt kleiner 2 M in der Serum/Stabilisierungslösung für die Integrität der RNA von Vorteil, insbesondere höheren Temperaturen, z.B.40 Grad Celsius.
Nicht gezeigt ist die Tatsache, dass MS2-RNA bereits 2 min nach Zusatz zu Serum vollständig von RNasen abgebaut wird und damit keine RNA mehr nachweisbar ist. Mit diesem Beispiel konnte belegt werden, dass der Abbau der RNA durch Zusatz von Stabilisierungslösung zum Serum deutlich verzögert werden kann. Nach 8 Tagen bei 40 °C in Serum/Stabilisierungsiösung kann MS2-RNA mittels PCR ohne Probleme detektiert werden (Abb 6), obwohl die RNA-Integrität teilweise litt.
Beispiel 5
Stabilität von MS2-RNA in Serum/Stabilisierungslösung: Abhängigkeit vom pH-Wert der mit Stabilisierungslösung versetzten Probe.
Material und Methode
Verwendete Lösung: 4 M (5 M) GTC 14,4 % Triton X 100 50 mM DTT 45 mM Tris HCI pH nach Serumzugabe zwischen 6,7 und 7,5.
2,5 ml Stabilisierungslösung wurden mit 2,0 ml Serum gemischt. Nach Zugabe von 90 μl MS2 RNA (0,8 μg/ml, Röche) wurden die Proben bei Raumtemperatur inkubiert. In regelmäßigen Abständen wurde die RNA aus 500 μl Probe mit dem Röche viral RNA Kit entsprechend Beispiel 4 aufgearbeitet und in 50μl Elutionspuffer isoliert. 20μl des Eluates wurden mittels Agarosegel analysiert (siehe Abb. 7).
Ergebnis: Der pH der Serum / Stabilisierungslösung und damit auch der pH und Pufferbereich der Stabilisierungslösung ist für die Langzeitstabilisierung von RNA entscheidend. Während bei einem pH Wert von 8,0 bereits nach 2 Tagen keine intakte RNA mehr nachgewiesen werden konnte, ist in einem pH Bereich zwischen 6,6 und 7,0 noch nach 13 Tagen Inkubation bei Raumtemperatur intakte RNA nachweisbar. Neben dem pH Wert ist jedoch auch eine optimal eingestellte GTC Konzentration für die Langzeitstabilisierung von RNA von Bedeutung (siehe Beispiel 4). Das dargestellte Beispiel verdeutlicht, dass für eine Langzeitstabilisierung von RNA eine GTC Endkonzentration in der stabilisierten Probe von 2,2 M GTC besser ist als 2,8 M.
Beispiel 6
Stabilität einer Nukleinsaure bindenden Oberfläche in Gegenwart von Stabilisierungslösung gezeigt unter Verwendung von Silika beschichteten Maonetpartikeln.
Material und Methode
Verwendete Lösung: 4,5 M GTC 15 % Triton-X-100 100 mM DTT 50 mM MES
Dabei wurde die Lösung und Blut im Verhältnis 1:1 eingesetzt. Die Silika beschichteten Magnetpartikel wurden dem mRNA Isolation Kit for Blood/Bone Marrow (Röche Molecular Biochemicals) entnommen. Die verwendete Menge Partikel pro ml betrug ca. 35 mg. Das Blutentnahmesystem, bestehend aus dem Entnahmeröhrchen, der Stabilisierungslösung und den Magnetpartikeln, wurde 14 Tage bei Raumtemperatur gelagert. Anschließend wurde mit diesem System Vollblut entnommen. Als Kontrolle wurde ein frisch hergestelltes Entnahmesystem (Röhrchen, Stabilisierungslösung, Magnetpartikel) verwendet. Aus beiden Ansätzen erfolgte die Isolierung der im Probenmaterial enthaltenen Nukleinsäuren. Die Magnetpartikel wurden mit einem Magneten abgetrennt, der Überstand wurde verworfen. Die Partikel wurden in 50% Ethanol, 10mM Tris, pH 7,0 resuspendiert und mehrmals mit derselben Lösung gewaschen. Schließlich wurden die Partikel in 10mM Tris/HCI pH 7,0 auf 70°C erhitzt, wobei sich die Nukleinsaure von den Magnetpartikeln löst. Die Partikel wurden magnetisch separiert und der Nukleinsaure enthaltende Überstand im Standard Agarosegel analysiert.
Ergebnis:
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Tabelle 1: Nach 14Tagen Lagerung hat sich die Nukleinsaure bindende Eigenschaft der Festphase nicht verändert. Die Probe, als auch die Kontrolle zeigen dieselben Nukleinsaure bindenden Eigenschaften.
Beispiel 7
Stabilität, Isolierung und Nachweis von DNA und RNA. nach 7 Tagen Lagemng bei gleichzeitiger Bindung an Silika beschichtete Magnetpartikel.
Material und Methode
Verwendete Suspension: 4,5 M GTC 15 % Triton-X-100 100 mM DTT 50 mM MES 35 mg/ml Partikel 4 Blutentnahmesysteme (Röhrchen) enthaltend 1,0 ml der oben beschriebenen Suspension wurde mit 1 ml Vollblut versetzt. Zwei der Röhrchen (Vollblutlysat) wurde zusätzlich mit 25μg MS2 RNA versetzt. Je ein Röhrchen der beiden Ansätze (Vollblutlysat +/- MS2 RNA) wurde unmittelbar danach zur Nukleinsäureisolierung eingesetzt (Durchführung siehe Beispiel 6). Die beiden anderen Röhrchen wurden 7 Tage bei Raumtemperatur gelagert: Nach diesem Zeitraum wurde die Nukleinsäureisolierung durchgeführt. Das Elutionsvolumen betrug 200μl pro 200μl Vollblutvolumen. Die Nukleinsäuren wurden im Standard Agarosegel analysiert.
Ergebnis: Nach 7 Tagen Lagemng im Probennahmesystem (Lösung, Festphase) ist die Stabilität von chromosomaler DNA und MS2-RNA nachweislich gegeben (Abb.8).
Beispiel 8 Extraktion von mRNA sowie zellulärer und viraler DNA durch Bindung an magnetische Polvmer-Beads auf der Basis von Polvvinylalkohol und an magnetische Silica-Beads
Pröbenmaterial: 1,2 ml stabilisiertes Blut (= 400 μl Blut + 800 μl NsS) (NsS=Nucleic Acid stabilization Solution)
Spiken mit Viren: + 6 x 10b copies/ml Cytomegaloviren (CMV)
Nukleinsäure-Extr.: + 800 μl Bindelösung (PrIS = Pre-Incubation Solution)
Magnetic-Beads: a) 120 μl Beadsuspension aus MagNA Pure LC total Nucleic Acid Isolation Kit (KaLNr. 3038 505, Röche Molecular Biochemicals) b) 30 μl Beadsuspension von Carboxyl-Polyvinyl-Alkohol Magnetic Beads (M-PVA C12 Kat.Nr. 01-01.204) der Firma Chemagen Biopolymer-Technologie AG, Baesweiler, GER Nukleinsaure Extratϊons-Protokoll für a) und b):
900 μl NsS-Biut-PrIS + a) 120 μl bzw. + b) 30 μl Beadssuspension mischen ca. 5 min Inkubation bei RT Magnetseparation Überstand vollständig entfernen Proteinase K-Schritt: 2 mg PK/ml in 10mM TRIS-HCI pH 6,5 mit 0,1 % Tween 20 und 0,5 % Triton x 100 500 μl PK-Puffer pro Probe, mischen, 10 min RT-Inkubation, Magnetseparation, Überstand entfernen 1. Waschschritt: 500 μl Waschpuffer I (GTC-haltig) aus dem High Pure viral Nucleic Acid-Isolation Kit (Kat.Nr. 1 858874 Röche Molecular Biochemicals) pro Probe zugeben und mischen für 10 sec. manuell oder mit Vortex Magnetseparation, Überstand vollständig abnehmen 2. Waschschritt: gleichen Waschritt mit 500 μl Waschpuffer I wiederholen 3. Waschschritt: 900 μl Waschpuffer II (Ethanol haltig) aus gleichem Kit wie oben pro Probe zugeben und mischen Magnetseparation und Überstand vollständig abnehmen Elution in 100 μl Elutionspuffer aus gleichem Kit wie oben bei 80°C für 10 min inkubieren und Eluat nach Magnetseparation vollständig abnehmen und bis zur Analyse bei -70°C einfrieren
Nukleinsaure Analytik: Agarosegel Analyse: 20 μl des Eluates werden auf einem 1% nativen Agarosegel analysiert
Ergebnis für a) und b): - genomische DNA ist sichtbar a) 100% b) 80% - rRNA ist sichtbar a) 100 % entspricht ca. 10-20% b) 200 % der gesamten zellulären RNA
• PCR für genomische DNA am Beispiel des G6P-DH Gens: Ergebnis: a) 100 % b) 75 %
• PCR für CMV: Ergebnis: a) 100 % (entspricht 4 x 106 copies/ml = ca. 70 % der gespikten CMV-Menge) b) 75 % entspricht 3 x 106 copies/ml = 50 % der gespikten CMV-Menge
• RT-PCR für G6P-DH mRNA: Ergebnis: a) nicht nachweisbar, vermutlich weil der GTC-Gehalt zur Bindung von mRNA zu niedrig war, durch die Verdünnung mit dem Proteinase K Puffer b) 50 % im Vergleich zu Standardexperimenten mit Silica- Magnetic Beads entsprechend dem MagNA Pure total NA Isolation Kit von Röche Molecular Biochemicals, wie sie in diesem Experiment verwendet wurden. Für die Beurteilung der Ergebnisse in den einzelnen Experimenten wurde jeweils die nachgewiesene Nukleinsäuremenge mit den Magnetic Beads mit Silica-Oberfläche von Röche Molecular Biochemicals (= a))als Standard und demzufolge also 100 % gesetzt und die mit b) isolierte Menge in Relation dazu gesetzt.
PrIS-Zusammensetzung (Bindelösung) im o.g. Experiment: 3,5 M GTC; 10 % Triton X 100; 350 mM Tris/HCI ; pH 8.0; NsS-Zusammensetzung (Stabilisierungslösung) im o.g. Experiment: 3,5 M GTC; 12,5 % Triton X 100; 60 mM Tris/HCI; 60 mM DTT;
Beispiel 9 Nachweis der Bindeeffizienz von Nucleinsäure an Silica-Oberflächen durch Zugabe der Bindelösuno ..PrIS" zur NAST-Blut Mischung
PrIS-Zusammensetzung: 3,5 M GTC; 10 % Triton X 100; 350 mM Tris/HCI ; pH 8.0; NAST-Zusammensetzung: 3,5 M GTC; 12,5 % Triton X 100; 60 mM Tris/HCI; 60 mM DTT;
Probenmaterial: 580 μl stabilisiertes Blut (200 μl Blut + 380 μl NAST = Verhältnis von 1 : 1,9) Spiken mit CMV: 6 x 106 copies/ml Cytomegalovirus (CMV)
Nukleinsaure Extraktion: a) Zugabe von 580 μl PrIS (= Verhältnis von 1 : 1) b) ohne Zugabe von PrIS
Extraktionsprotokoll: Es wurden alle notwendigen Reagenzien, wie Magnetic Beads mit Silica Oberfläche, Waschpuffer und Elutionspuffer aus dem MagNA Pure total NA Isolation Kit® von Röche Molecular Biochemicals (KatNr. 3 038 505) verwendet. Die Proteinase K ist ebenfalls von Röche Molecular Biochemicals mit der Kat.Nr. 1 964364. a) + 40 μl b) + 40 μl Proteinase K (20mg/ml) + 300 μl + 300 μl Magnetic Beadsuspension - mischen und für 10 min bei RT inkubieren - Magnetseparation und Überstand entfernen - 1. Waschen mit 850 μl Waschpuffer I - Magnetseparation und Überstand entfernen - 2. Waschen mit 450 μl Waschpuffer II - Magnetseparation und Überstand entfernen - 3. Waschen mit 450 μl Waschpuffer III - Magnetseparation und Überstand vollständig entfernen - Elution mit 200 μl Elutionspuffer bei 70° C mit 10 min Inkubation - Magnetseparation und Überstand = Eluat sorgfältig abnehmen und bei -70° C bis zur Analyse einfrieren.
Analytik der extrahierten Nukleinsäuren: - Agarosegel Analyse: 20 μl der Eluate wurden auf einem nativen 1 % Agarosegel aufgetrennt chromosomalen DNA: a) 100 % b) ca. 14 % rRNA: a) 100 % b) ca 20 %
- Quantitative Bestimmung von CMV mit dem Light Cycler®, Röche Molecular Biochemicals a) 4,3 x 106 copies/ml = 72 % Extraktionseffizienz b) 1 ,0 x 106 copies/ml = 17 % Extraktionseffizienz
- Quantitative Bestimmung der genomischen DNA mit dem G6P-DH Gen: a) 100 % b) 21 %
Quantitative mRNA-Bestimmung anhand der G6P-DH mRNA: a) 100 % b) 7 %
Alle Ergebnisse der durchgeführten Analysen zeigen, daß die Zugabe der Bindelösung „PrIS" für eine optimale Extraktion der Nukleinsäuren durch ihre optimale Bindung an die Silica-Festphase notwendig ist.
Beispiel 10
Nukleinsaure Extraktion aus NAST-Blut mit PrIS an Silica-Oberflächen mit dem High Pure Viral Nucleic Acid Kit® von RÖCHE Molecular Biochemicals Cat. No. 1 858874
Blutentnahme: Die Blutentnahme erfolgt in einem NAST Vacuette® Röhrchen der Firma Greiner BIO-ONE. Dieses Vakuum-Blutentnahmeröhrchen hat ein Gesamtvolumen von 5 ml und enthält 2,3 ml NsS (Nucleic Acid Stabilization) Lösung. Das Vakuum ist so eingestellt, dass bei der Blutentnahme 1,2 - 1,25 ml Blut in das Röhrchen strömen und sich mit der Lösung vermischen. Damit liegen 3,5 ml NAS-Blut Mischung im Röhrchen vor, wobei das Blut 1 : 2,8 verdünnt wird. NsS = Nukleinsaure stabilisierende Lösung: 3 M GTC; 12,5 % Triton X 100; 30 mM MES; 120 mM DDT PrIS = Bindelösung: 4 M GTC; 12,5 % Triton X 100; 250 mM Tris/HCI ; pH 8.0;
200 μl Blut entsprechen 560 μl der Blut-NAS-Mischung.
Spiken: Jedes Röhrchen wurde mit einem positiven HCV- und CMV-Plasma gespikt, sodass die folgenden Konzentrationen vorliegen:
HCV: 5,7 x 105 lU/ml Blut-NAS-Mischung CMV: 2,0 x 106 copies/ml Blut-NAS-Mischung Lagerung: Die Blutentnahme-Röhrchen werden 1 Tag bei 20 - 24° C gelagert
Nukleinsäureextraktion: 560 μl Blut-NsS-Mischung (= 200μl Blut) mit 350 μl PRIS mischen und zum Lösen der Kristalle bis zu 15 min. bei RT mit mehrmaligem Mischen (Vortex) inkubieren.
115 μl Isopropanol zufügen, mischen, in 2 Portionen auf das High Pure® Säulchen auftragen, welches jeweils bei 6000 - 7000 rpm 1 min. zentrifugiert wird.
450 μl Removal Waschpuffer® (RÖCHE Kit-Komp.) auftragen und mit 6000 - 7000 rpm 1 min. zentrifugieren .2 x mit 450 μl Waschpuffer® (RÖCHE Kit-Komponente) die Säule waschen, jeweils mit 6000 - 7000 rpm zentrifugieren, 100 μl 70°C heißen Elutionspuffer® (Kit-Komp.= Wasser) zur Elution auftragen und bei 10000 rpm 2 min. zentrifugieren
Nukleinsäuren aus 200 μl Blut liegen in 100 μl Eluat vor und werden bis zur Analytik bei -70°C in 10 μl Aliquots gelagert.
Analytik:
Alle Schritte der Analytik wurden im Vergleich mit einer Standard-Nukleinsäure- Extraktiόn mit dem PAXgene Blood RNA Kit® der Firma Preanalytix GmbH, Schweiz durchgeführt. Dieses Kit arbeitet ebenfalls aus Vollblut und beinhaltet ein anderes System der Nukleinsäure-Stabilisierung während der Blutentnahme.
1. Qualitative DNS/RNA Analyse mit der Agarose-Gel-Analytik:
NAST-PRIS: Die extrahierten Nukleinsäuren bestehen zu 90-95 % aus zellulärer RNA (ribosomaler RNA, mRNA) während die chromosomale DNS als dünne Bande im Bereich von ca. 5 -10 % liegt.
PAXgene: Die extrahierten Nukleinsäuren bestehen zu 20-70 % aus zellulärer RNA = rRNA und zu 30-80 % aus chromosomaler DNA.
2. Quantitative DNS/RNA Bestimmung durch photometrische Messung (A 260)
NsS-PRIS: Die 100 μl Eluat (= 0,2 ml Blut) enthalten 2 μg RNA/DNS entsprechend 6,25 % der gesamten zellulären Nukleinsäuren. Bei einer Aufteilung DNA : RNA laut Agarosegel von etwa 1 : 10 . entspricht dies ca. 0,2 μg DNA und 1,8 μg RNA Somit entspricht dies einer Ausbeute von ca 1 % der genomischen DNA und ca. 90 % der gesamten zellulären RNA = rRNA.
PAXgene: Die 80 μl Eluat (= 2,5 ml Blut) enthalten 8,7 μg RNA/DNS, was 0,7 μg aus 0,2 ml Blut entspricht, also einer Ausbeute von 2 % der Gesamt-Nukleinsäuren des Blutes. Entsprechend der von Experiment zu Experiment stark schwankenden Aufteilung von DNA : RNA = 30-80% : 70-20% entspricht dies einer Ausbeute von 0,7 - 1 ,8 % der genomischen DNA und von nur 7 -24 % der gesamten zellulären RNA = inclusive rRNA. d.h. mit dem erfindungsgemäßen NAST-PRIS werden ca. 3 mal mehr Gesamt-Nukleinsäuren und 4- 13 mal mehr gesamt zelluläre RNA, die überwiegend aus rRNA besteht, isoliert.
3. Quantitative HCV-Bestimmung mit dem Light-Cycler der Firma Röche Diagnostics: NsS-PRIS: Es wurde eine HCV Konzentrationen von ca. 4 x 105 lU/ml gemessen. Bezogen auf die gespikte Konzentration von 5,7 x 105 lU/ml entspricht dies einer Wiederfindung von 70%.
PAXgene: Es wurden HCV Konzentrationen von 0,6 - 1 ,0 x 104 lU/ml gemessen entsprechend einer Wiederfindung von 1 - 1,75 % der gespikten 5,7 x 105 HCV lU/ml. Damit wird mit dem PAXgene System eine 40 - 70 fach schlechtere Ausbeute für HCV im Vergleich zu dem NAST- PRIS System erreicht.
4. Quantitative CMV-Bestimmung mit dem Light-Cycler der Firma Röche Diagnostics
NAST-PRIS: Es wurde eine CMV-Konzentration von ca. 8 x 105 copies/ml gemessen, was 40 % Wiederfindung der gespikten Konzentration von 2 x 106 copies/ml entspricht.
Paxgene: Es wurden CMV-Konzentrationen von 0,8 - 1 ,6 x 105 copies/ml gemessen, was einer Wiederfindung von 4 - 8 % der gespikten 2 x 106 CMV copies/ml darstellt.
Somit werden mit dem PAXgene System 5 - 10 fach niedrigere Ausbeuten im Vergleich zu dem NAST-PRIS System erreicht.
5. Quantitative mRNA (G6P-DH) Bestimmung mit dem Light-Cycler der Firma Röche Diagnostics
NAST-PRIS: Es wurden 8 - 12 ng G6P-DH mRNA in 200 μl Blut gemessen.
PAXgene: Es wurden 0,1 - 0,25 ng G6P-DH mRNA in 200 μl Blut gemessen. Mit dem erfindungsgemäßen NAST-PRIS System wird 50 - 100 mal mehr mRNA isoliert
6. Quantitative Bestimmung des G6P-DH Gens mit dem Light-Cycler der Firma Röche Diagnostics
NAST-PRIS: Es wurden 190 - 430 ng G6P-DH Gene in 200 μl Blut gemessen.
PAXgene: Es wurden 544 - 1200 ng G6P-DH Gene in 200 μl Blut gemessen.
Die oben gezeigten Versuche zeigen damit eindeutig, daß das erfindungsgemäße System zu einer deutlichen Steigerung der Ausbeute an niedermolekularen Nukleinsäuren, insbesondere von RNA (wie mRNA und viraler RNA und DNA (z.B. HCV, CMV)) führt. Die Begriffe NAST und NsS wurden synonym verwendet.

Claims

Patentansprüche:
1. Zusammensetzung zum Binden von Nukleinsäuren in wässriger Lösung an eine Festphase, enthaltend ein Guanidiniumsalz, eine Puffersubstanz und ein Detergenz, gekennzeichnet dadurch, dass der pH-Wert der Lösung > 7.0, vorzugsweise >7,5 insbesondere >8,0 ist.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1 , wobei die Konzentration der Puffersubstanz in derwässrigen Lösung mindestens 100 mM ist.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Konzentration der Puffersubstanz in derwässrigen Lösung zwischen 250 mM und 750 mM liegt.
4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Konzentration der Puffersubstanz in derwässrigen Lösung zwischen 450 und 550 mM liegt.
5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Guanidiniumsalz ausgewählt wird aus Guanidiniumthiocyanat und Guanidiniumchlorid.
6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Guanidiniumsalz in einer Konzentration von 1 bis 8 M vorliegt.
7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Detergenz ausgewählt wird aus Triton-X-100, NP-40, Polydocanol und Tween 20.
8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Detergenz in einer Konzentration von 5 bis 30 Gew.% vorliegt.
9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung folgende Bestandteile enthält: - etwa 3-5 M Guanidiniumthiocyanat; - etwa 12-18 % (w/v) Triton-X-100; - etwa 450-550 mM TRIS/HCI.
10. Kit zum Isolieren von Nukleinsaure, enthaltend folgende Bestandteile: a) eine wässrige Nukleinsäure-stabilisierende Lösung, enhaltend folgende Bestandteile: - ein Guanidiniumsalz, und/oder - eine Puffersubstanz, und/oder - ein Reduktionsmittel, und/oder - ein Detergenz; b) eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9; und c) eine Festphase, die Nukleinsäuren binden kann.
11. Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Guanidiniumsalz in der Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung ausgewählt wird aus Guanidiniumthiocyanat und Guanidiniumchlorid.
12. Kit nach einem der Ansprüche 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das Guanidiniumsalz in der Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung in einer Konzentration von 1 bis 8 M vorliegt.
13. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Nukleinsäure-stabilisierende Lösung, vorzugsweise nach Zugabe von Probenmaterial, einen pH-Wert von 4 bis 7,5 aufweist, und die Puffersubstanz ausgewählt wird aus Tris, HEPES, MOPS, MES, Citrat- und Phosphatpuffer.
14. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Puffersubstanz in der Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung in einer Konzentration von 10 bis 300 mM vorliegt.
15. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Detergenz in der Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung ausgewählt wird aus Triton-X-100, NP-40, Polydocanol und Tween 20.
16. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Detergenz in der Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung in einer Konzentration von 5 bis 30 Gew.% vorliegt.
17. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Reduktionsmittel in der Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung ausgewählt wird aus Dithiothreitol, ß-Mercaptoethanol und TCEP.
18. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Reduktionsmittel in der Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung in einer Konzentration von 0,1 bis 10,0 Gew.% vorliegt.
19. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der pH der Lösung zum Stabilisieren der Nukleinsaure zwischen 4,0 und 7,5 liegt.
20. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure-stabilisierende Lösung folgende Bestandteile enthält: - 2,5 - 3,5 M Guanidiniumthiocyanat; - 40 - 80 mM MES; - 10 - 20 % (wlv) Triton-X-100; - 40 - 80 mM DTT.
21. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase getrennt als Vlies, Filter, Partikel, Gel, Kugel, Zapfen und/oder Stab vorliegt und/oder direkt dem Gefäß zur Aufnahme der Nukleinsäure-enthaltenden Probe verbunden ist.
22. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich d) ein Gefäß zur Aufnahme einer Probe enthalten ist.
23. Kit nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefäß ein Blutentnahmegefäß ist.
24. Gefäß, enthaltend eine Nukleinsaure einer biologischen Probe und eine Lösung enthaltend: - ein Guanidiniumsalz in einer Konzentration von 1 bis 8 M; - ein Detergenz in einer Konzentration von 5 bis 25 % (w/v); - einen Puffer in einer Konzentration von 100 bis 500 mM; - ein Reduktionsmittel in einer Konzentration von 5 bis 50 mM; und mit - einem pH > 7,0.
25. Gefäß nach Anspruch 24, enthaltend: - ein Guanidiniumsalz in einer Konzentration von 1 ,5 bis 5, vorzugsweise von 2,5 bis 3,5 M; - ein Detergenz in einer Konzentration von 8 bis 20, vorzugsweise 10 bis 16 % (w/v); - ein Puffer in einer Konzentration von 150 bis 400, vorzugsweise 200 bis 300 mM; - ein Reduktionsmittel in einer Konzentration von 10 bis 40 mM, vorzugsweise 25 bis 35 mM; und mit - einem pH > 7,5, besonders bevorzugt > pH 8,0.
26. Verfahren zum Isolieren einer Nukleinsaure, umfassend die folgenden Schritte: a) In Kontakt bringen einer Nukleinsäure-enthaltenden biologischen Probe und einer wässrigen Lösung zum Stabilisieren von Nukleinsaure, wie in den Ansprüchen 10 bis 20 beschrieben; b) Zusetzen einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Lösung nach a); c) Zusetzen einer Festphase, die Nukleinsäuren binden kann, zur Lösung nach b), wobei die Reihenfolge der Schritte a), b), und c) vertauschbar ist.
27. Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsaure in einer biologischen Probe, umfassend das Durchführen des Verfahrens nach Anspmch 26 und Detektion der isolierten Nukleinsaure oder eines Bestandteils davon.
8. Verfahren zum Binden von Nukleinsaure an eine Festphase, dadurch gekennzeichnet, dass der pH der Lösung enthaltend die Nukleinsaure und die Festphase auf einen Wert > 7,0, vorzugsweise >7,5, besonders bevorzugt > 8,0 eingestellt wird.
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