CN101200716B

CN101200716B - 使用聚多卡醇和衍生物的核酸分离

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Publication number: CN101200716B
Application number: CN200710199513XA
Authority: CN
Inventors: S·阿迪; H·勒英; N·纳克鲍尔; E·鲁斯曼
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2006-12-11
Filing date: 2007-12-10
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2027-12-10
Also published as: US20120100599A1; US8192958B2; JP5354894B2; ES2402869T3; US20110311982A1; HK1178567A1; CN102776173A; CN101200716A; CA2614069C; HK1118859A1; CN102776173B; JP2008142083A; US8097717B2; US20080187905A1; CA2614069A1

Abstract

本发明涉及一种组合物，所述组合物包含离液剂、缓冲物质和0.5％～5％(V/V)的聚多卡醇或其衍生物。本发明也涉及所述组合物的用途和包括本发明的组合物的试剂盒。本发明还涉及用于检测生物样品中的核酸的方法，所述方法包括下列步骤：在离液剂、缓冲物质和0.5％～5％(V/V)的聚多卡醇或其衍生物的存在下培养所述生物样品，任选地分离所述核酸，任选地扩增所述核酸，以及检测所述核酸。本发明进一步涉及用于提纯生物样品中的核酸的方法，所述方法包括下列步骤：在离液剂、缓冲物质和0.5％～5％(V/V)的聚多卡醇或其衍生物的存在下培养所述生物样品，和分离所述核酸由此提纯所述核酸。

Description

使用聚多卡醇和衍生物的核酸分离

技术领域

本发明涉及一种组合物，所述组合物包含离液剂、缓冲物质和0.5％～5％(V/V)的聚多卡醇或其衍生物。本发明也涉及所述组合物的用途和包括本发明的组合物的试剂盒。本发明还涉及用于在生物样品中检测核酸的方法，所述方法包括下列步骤：在离液剂、缓冲物质和0.5％～5％(V/V)的聚多卡醇或其衍生物的存在下培养所述生物样品，任选地分离所述核酸，任选地扩增所述核酸，以及检测所述核酸。本发明进一步涉及用于在生物样品中提纯核酸的方法，所述方法包括下列步骤：在离液剂、缓冲物质和0.5％～5％(V/V)的聚多卡醇或其衍生物的存在下培养所述生物样品，和分离所述核酸由此提纯所述核酸。

背景技术

许多生物物质，尤其是核酸，就将它们与其自然环境分离而言提出了特殊的挑战。一方面，核酸常常以极低的浓度存在，另一方面，它们常常在存在许多其他固体和溶解物，如溶胞后的细胞的情况下被发现。这导致核酸难以分离或测定，尤其是在生物特异性测定中，所述生物特异性测定允许对特定分析物，如核酸进行检测，或对特定分析物性质进行检测，而且在诊断及生物分析学领域的研究与发展中起主要作用。生物特异性测定的实例是杂交测定、免疫测定和受体-配体测定。杂交测定使用用于核酸分析物，如RNA和DNA的分子检测的特异性碱基配对。因此，长度为18～20个核苷酸的寡核苷酸探针能够对例如人类基因组中的所选的互补序列进行特异性识别。需要两个寡核苷酸引物选择性结合的另一种测定是在US 4,683,195中描述的聚合酶链反应(PCR)。该方法允许通过具有热稳定性的聚合酶在脱氧核苷三磷酸的存在下在几个循环中将特定的核酸区域选择性扩增至可检测的水平。

如上所述，在上面所提及的测定之一中分析所述生物物质或将其用于其他过程中之前，必须从包含不同成分例如蛋白质成分和非蛋白质成分的复杂混合物的生物样品中将其分离或提纯。对于第一阶段的步骤来说，常常使用可允许所关注的成分如核酸富集的方法。这些常常包含在细菌细胞、真菌细胞、病毒颗粒或更为复杂的有机体的细胞如人类血细胞或植物细胞中。所关注的成分也被称为“靶标成分”。

为释放所述细胞或颗粒的内容物，所述细胞或颗粒可以用酶或化学药品进行处理从而使有机体的细胞壁溶解、降解或变性。该过程通常称为溶胞(lysis)。包含该胞溶物的所得溶液称为溶胞产物。在溶胞过程中常常遇到的问题是降解所述靶标成分的其他酶(如分解核酸的脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶)在溶胞过程中与所关注的成分接触。这些降解酶也可存在于所述细胞的外部，或在溶胞前以不同的细胞区室在空间上分隔开再与靶标成分接触。在该过程中释放的其他成分可以为例如属于脂多糖的内毒素，其对细胞具有毒性并可能导致意图用于人类或动物疗法的产品出现问题。

已经有各种手段可以解决上面所提及的该问题。当意欲释放核酸时通常使用诸如硫氰酸胍或阴离子、阳离子、两性离子或非离子洗涤剂等离液剂。此外有利的是使用可快速降解这些酶或不需要的蛋白的蛋白酶。然而，这有可能导致另一个问题，即所述物质或酶在后续步骤中会干扰各试剂或成分。

可有利地用于上述溶胞或样品制备过程的酶是可使蛋白质底物中的酰胺键分裂并被分类为蛋白酶，或(可以替代地)肽酶的酶(参见Walsh，C.，Enzymatic Reaction Mechanisms(1979)chapter 3，W.H.Freeman and Company，San Francisco)。已经得到应用的蛋白酶是例如碱性蛋白酶(WO 98/04730)或酸性蛋白酶(US 5,386,024)。广泛用于核酸分离的样品制备的蛋白酶是来自Tritirachium album的蛋白酶K(例如参见Sambrook，J.，等：Molecular Cloning(1989)Cold Spring HarborUniversity Press，NY，USA)，该蛋白在酶pH约为中性时具有活性并属于本领域的技术人员所公知为枯草杆菌蛋白酶(subtilisins)的蛋白酶族。枯草杆菌蛋白酶是由革兰氏阳性细菌或真菌所产生的丝氨酸蛋白酶。

在溶胞步骤之后的样品制备的后续步骤中，所述靶标成分被进一步富集。如果所述靶标成分是核酸，则该靶核酸通常在其用于基于探针的测定之前由复杂溶胞混合物提取。

对于核酸的提取已经有了数种方法：

-序列依赖性或生物特异性方法，如：

-亲合色谱法

-与固定化探针杂交

-不依赖序列的或物理化学方法，如：

-使用例如苯酚-氯仿进行的液-液萃取

-使用例如纯乙醇进行的沉淀

-使用滤纸进行的提取

-使用如十六烷基-三甲基-溴化铵等成胶束剂进行的萃取

-与诸如吖啶衍生物等固定化插入染料结合

-吸附至硅胶或硅藻土

-在离液条件下吸附至磁性玻璃颗粒(MGP)或有机硅烷颗粒

对于提取目的而言尤其关注的是核酸对玻璃表面的吸附，尽管其他表面也是可解的。近年来已经提出了通过利用核酸与玻璃或二氧化硅表面的结合行为而将核酸与其自然环境分离的许多方法。

例如，EP 0 389 063公开了在离液剂的存在下核酸与二氧化硅表面的结合。WO 96/41811和WO 01/37291公开了核酸与磁性玻璃颗粒的二氧化硅表面的结合。市场上销售的市售系统为例如可由RocheDiagnostics，Mannheim，Germany得到的the High Pure

系统和theMagNA Pure

系统。

为增强或影响生物样品的溶胞和/或核酸与二氧化硅表面的结合行为，在现有技术中已经使用了各种试剂。

WO 95/01359公开了为将核酸结合至二氧化硅表面使用1％～50％的不同醇类、聚乙二醇或三氯乙酸并结合高盐浓度。

WO 97/05248公开了用于从生物样品中分离并提取DNA、RNA和蛋白质的溶液。所述溶液包括离液剂、还原剂和诸如醇等有机溶剂。

WO 01/37291公开了包含50mM Tris pH7.0、15％(V/V)聚多卡醇、5M异硫氰酸胍和1mM二硫苏糖醇(DTT)的溶胞缓冲液。

WO 2005/064010涉及用于在水溶液中将核酸与固相结合的组合物。所述组合物包含胍盐、缓冲物质和洗涤剂诸如Triton-X-100、NP-40、聚多卡醇及Tween 20等。所述洗涤剂的浓度可以为5％～30％，优选为10％～20％。

WO 00/09746和WO 01/60517描述了具有包含胍盐、缓冲物质、还原剂和洗涤剂的溶液的容器。所述洗涤剂的浓度可以为5％～30％。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种新型组合物，所述组合物用于生物样品的溶胞和/或用于影响或增强核酸与二氧化硅表面的结合行为。

通过本发明的发现已经解决了该问题，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含离液剂(chaotropic agent)、缓冲物质和0.5％～5％(V/V)的聚多卡醇(polidocanol)或其衍生物。

在本发明的另一个实施方式中，本发明的组合物用于提纯核酸、用于将核酸与固体表面结合或用于检测核酸。

在本发明的又一个实施方式中，提供了用于检测生物样品中的核酸的方法，包括下列步骤：

a)在离液剂、缓冲物质和0.5％～5％(V/V)的聚多卡醇或其衍生物的存在下培养所述生物样品，

b)任选地分离所述核酸，

c)任选地扩增所述核酸，以及

d)检测所述核酸。

在本发明的再一个实施方式中，提供了用于提纯生物样品中的核酸的方法，包括下列步骤：

b)分离所述核酸由此提纯所述核酸。

术语“聚多卡醇(polidocanol)”或“polydocanol”是指由每个分子中平均约有9个氧化乙烯基团的聚乙二醇单十二烷基醚的混合物构成的化合物或组合物。其可由分子式(C₂H₄O)_nC₁₂H₂₆O或HO(CH₂CH₂O)_n(CH₂)₁₁CH₃描述，其中n为大约9，即，作为其中月桂醇与氧化乙烯反应(乙基氧化)的制造方法的结果，乙二醇部分的中数为约9。这意味着分子量为约600g/mol。该化合物的其他名称为3，6，9，12，15，18，21，24，27-nonaoxanonatriacontan-1-醇、十二烷基九乙二醇醚、十二烷基九乙二醇、聚乙二醇9月桂基醚或laureth 9。所述化合物也是适宜的乳化和增溶剂，用于油/水(O/W)型的化妆用乳液和皮肤病用乳液、局部麻醉剂、杀精子剂和表面活性剂或治疗曲张静脉的硬化剂。所述化合物可以由例如Kolb，Hedingen，Switzerland(Sympatens-AL/090 P)获得。但根据本发明，术语“聚多卡醇”或“polydocanol”还应当指具有式(C₂H₄O)₉C₁₂H₂₆O或HO(CH₂CH₂O)₉(CH₂)₁₁CH₃的化学上明确的化合物。 “聚多卡醇”在室温下是白色软膏状物质，在约30℃时变成清澈的、无色至轻微发黄的液体。因此，对于制备含有聚多卡醇的组合物来说，当例如在水浴中加热至如37℃或40℃时可由吸液管吸取聚多卡醇，也可以在室温下作为固体物质加入。因而，根据本发明，2.37l聚多卡醇(液体)(稍高于30℃，优选37℃)等于2.365kg固体聚多卡醇(稍低于30℃，优选为室温，即20℃～25℃)。所得组合物或溶液以％(V/V)或％(W/V)表示聚多卡醇的含量。术语“(V/V)”意思是单位体积的体积，“(W/V)”意思是单位体积的重量。所述组合物的优选溶剂或主要成分为水，即，优选的是这些组合物为水性组合物或水性溶液。

术语“聚多卡醇的衍生物”或“polydocanol的衍生物”涉及化学衍生的但具有与“聚多卡醇”或“polydocanol”的各种性质相同或极为相近的各种性质，尤其是在本发明的方法中的各种性质的“聚多卡醇”或“polydocanol”。

在本发明的说明书中“组合物”的另一种说法是溶液。

“生物样品”是取自植物或动物(包括人类)并且为固体或液体的样品。其具体实例将在下面进行更详细的描述。

具体实施方式

在本发明的一个实施方式中，提供了一种组合物，包含：

-离液剂，

-缓冲物质，和

-0.5％～5％(V/V)的聚多卡醇或其衍生物。

在本发明的优选实施方式中，本发明的组合物包含0.5％～4.9％(V/V)聚多卡醇、0.5％～4.5％(V/V)聚多卡醇、0.5％～3％(V/V)聚多卡醇或其衍生物，优选所述组合物包含0.75％～1.75％(V/V)聚多卡醇或其衍生物。

在本发明的另一优选实施方式中，本发明的组合物包含1％～4.5％(V/V)聚多卡醇或其衍生物，优选所述组合物包含1.5％～3％(V/V)聚多卡醇或其衍生物。

在本发明的另一优选实施方式中，在本发明的组合物中，所述离液剂是硫氰酸胍、异硫氰酸胍、氯化胍或脲。然而，也可以使用氯酸钾(KClO₄)或碘化钾(KI)。

在本发明的另一优选实施方式中，在本发明的组合物中，所述缓冲物质是三-(羟基甲基)-氨基甲烷(TRIS)、磷酸盐、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)(HEPES)、乙酸盐或柠檬酸盐。

在本发明的另一优选实施方式中，在本发明的组合物中，所述组合物的pH为酸性，优选所述组合物的pH为3～5。

在本发明的又一优选实施方式中，所述组合物还包含还原剂，优选为二硫苏糖醇(DTT)。

在本发明的极为优选的实施方式中，所述组合物包含4 M硫氰酸胍、50mM柠檬酸钠、1％(W/V)DTT、3％(V/V)聚多卡醇，pH为4。

在本发明的又一优选实施方式中，本发明的组合物还包含蛋白酶。

在本发明的优选实施方式中，本发明的组合物用于提纯核酸、用于将核酸与固体表面结合或用于检测核酸。

本发明还设想了一种试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括本发明的组合物。本领域中公知的该试剂盒还包括可在样品制备过程中使用的塑料器皿，例如96或384孔形式的微量滴定板或例如由Eppendorf，Hamburg，Germany制造的普通反应管等以及用于执行本发明的方法的所有其他试剂。因此，所述试剂盒可另外包括对核酸具有亲合性的物质，优选的是所述对核酸具有亲合性的物质包括具有二氧化硅表面的物质。所述具有二氧化硅表面的物质优选是玻璃。所述的对核酸具有亲合性的物质最优选是包含磁性玻璃颗粒的组合物。本发明的这些试剂盒的成分可以分别提供在管中或存储容器中。根据各成分的性质，它们也可以提供在单独的管中或存贮容器中。所述试剂盒可进一步或额外地包括洗涤液，当DNA或RNA与磁性玻璃颗粒结合时，所述洗涤液适用于该磁性玻璃颗粒的洗涤步骤。所述洗涤液可以在缓冲溶液或上述具有酸性pH而不含乙醇和/或离液剂的溶液中包含乙醇和/或离液剂。所述洗涤液或其他溶液常常作为在使用前需要稀释的储备溶液提供。所述试剂盒可进一步或额外地包括洗脱液或洗脱用缓冲剂，即，溶液或缓冲液(例如10mM Tris、1mM EDTA，pH为8.0)或纯水用以洗脱与磁性玻璃颗粒结合的DNA或RNA。此外，可以存在可用于核酸，即DNA或RNA的提纯过程的追加试剂或缓冲溶液。因此，在本发明的实施方式中，提供一种包括本发明的组合物的试剂盒。优选的是，所述试剂盒另外包括对核酸具有亲合性的物质，优选具有二氧化硅表面的物质。所述对核酸具有亲合性的物质更优选是包含磁性玻璃颗粒的组合物。本发明的试剂盒优选另外还包括洗涤缓冲剂和洗脱缓冲剂。

在本发明的优选实施方式中，本发明的试剂盒用于研究、生物分析学或诊断学中的核酸提纯。在本发明的优选实施方式中，本发明的试剂盒或本发明的方法用于高通量形式，即，用于允许对大量不同样品进行分析的自动化方法。

在本发明的实施方式中，提供了用于检测生物样品中的核酸的方法，包括下列步骤：

b)任选地分离所述核酸，

c)任选地扩增所述核酸，以及

d)检测所述核酸。

在本发明的方法的步骤a)中，所述生物样品经溶胞而释放生物样品中所含有的包括核酸的生物物质。关于用于获得核酸的溶胞过程的普通参数，具体可以参考Sambrook，J.，等：Molecular Cloning，A LaboratoryManual，2^nd edition(1989)Cold Spring Harbour Laboratory Press，NY，USA，和Ausubel，F.，等：Current Protocols in Molecular Biology(1987)JohnWiley & Sons，Inc.，NY，USA。使用本发明的组合物将溶胞过程结合也是适用的。例如，溶胞可以使用超声波、高压、通过剪切力进行。此外常常发生的情况是添加用于降解存在于生物样品中的蛋白质的蛋白酶。本发明的蛋白酶可以以固体形式加入，例如作为片剂或粉末，也可以以缓冲溶液或非缓冲溶液中的溶解形式加入。蛋白酶的实例是蛋白酶K或来自EP 1 201 753中描述的枯草杆菌的另一种蛋白酶。

优选利用聚合酶链反应将所述核酸扩增，聚合酶链反应特异地将靶序列扩增至可检测的量。因此，在本发明的优选实施方式中，在本发明的方法的所述扩增步骤c)中，所述核酸通过聚合酶链反应扩增。其他可能的扩增反应是连接酶链反应(LCR，Wu，D.Y.，和Wallace，R.B.，Genomics 4(1989)560-569和Barany，F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 (1991)189-193)；聚合酶连接酶链反应(Barany，F.，PCR Methods and Appl.1(1991)5-16)；Gap-LCR(PCT专利公开No.WO 90/01069)；RepairChain Reaction(EP 0 439 182)，3SR(Kwoh，D.Y.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177；Guatelli，C.J.，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878；PCT专利公开号WO 92/08808)，和NASBA(US 5,130,238)。此外，还有链置换扩增(SDA)、转录介导扩增(TMA)和Qβ-扩增(对于综述例如参见Whelen，A.C.，和Persing，D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373；Abramson，R.D.，和Myers，T.W.，CurrentOpinion in Biotechnology 4(1993)41-47)。

尤其优选的检测方法是在WO 92/02638和相应的US专利US 5,210,015、US 5,804,375、US 5,487,972中公开的TaqMan

instrument中进行的方法。该方法使用聚合酶的核酸外切酶活性以生成信号。具体地说，通过包括下述步骤的方法检测所述靶核酸成分：使所述样品与含有与靶核酸成分的区域互补的序列的寡核苷酸以及含有与同一靶核酸成分序列链的第二区域互补的序列的标记寡核苷酸接触，但不包括由所述第一寡核苷酸限定的核酸序列，以在杂交条件下生成双链体(duplexes)的混合物，其中，所述双链体包括与所述第一寡核苷酸和所述标记寡核苷酸退火以使第一寡核苷酸的3’端与标记寡核苷酸的5’端相邻的靶核酸。然后，在足以允许聚合酶的5’到3’核酸酶活性以切割所述退火的标记的寡核苷酸并释放标记片段的条件下，用具有5’到3’核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶处理该混合物。检测和/或测定由标记的寡核苷酸的水解所产生的信号。在TaqMan

instrument中进行的方法消除了对形成与固相结合的反应复合物并使之可检测的需要。更概括地说，公开了一种用于在检测步骤之前提纯(至少一种)靶核酸成分的方法，其中，所述扩增和/或检测反应为均匀液相。

通过本领域的技术人员公知的，且在例如Sambrook，J.，等：MolecularCloning(1989)Cold Spring Harbor University Press，NY，USA或Lottspeich，F.，and Zorbas，H.(eds.)，Bioanalytik，1^st edition(1998)Spektrum Akademischer Verlag GmbH，Heidelberg，Berlin，Germany中描述的标准分析法可以测定或检测所述核酸。优选的是，所述核酸的量由上述文献中描述的方法测定。在DNA检测步骤之前还可以有进一步的提纯步骤，例如沉淀步骤。所述检测方法可以包括但不限于结合或插入诸如溴化乙锭等特异性染料，溴化乙锭插入双链DNA中并随后改变其荧光性。提纯的DNA也可以通过任选地用限制酶切消化后以电泳法分离，其后进行观察。此外还有一些基于探针的分析，其利用与特定序列的寡核苷酸杂交，随后检测杂交物。还可以在本领域的技术人员已知的其他步骤之后确定DNA的顺序。其他方法将多种多样的DNA序列应用于硅片，所述硅片结合了特定探针并在结合互补序列时产生信号。

在本发明的实施方式中，提供了用于提纯生物样品中的核酸的方法，包括下列步骤：a)在离液剂、缓冲物质和0.5％～5％(V/V)的聚多卡醇或其衍生物的存在下培养所述生物样品，b)分离所述核酸由此提纯所述核酸。

本发明的两种方法的步骤a)的培养条件是优选通过将本发明的组合物加入所述生物样品中而准备的。在本发明的优选实施方式中，在本发明的方法的步骤a)中，所述生物样品在离液剂、缓冲物质和0.5％～4.9％(V/V)聚多卡醇或其衍生物，0.5％～4.5％(V/V)聚多卡醇或其衍生物，0.5％～3％(V/V)聚多卡醇或其衍生物，优选0.75％～1.75％(V/V)聚多卡醇或其衍生物的存在下进行培养。

本发明的方法的分离步骤b)优选包括将核酸与对核酸具有亲合性的物质，优选具有二氧化硅表面的物质结合，任选地洗涤与所述物质结合的核酸并从所述物质中将所述核酸洗脱。所述具有二氧化硅表面的物质优选是包含磁性玻璃颗粒的组合物。在最优选的实施方式中，所述洗涤步骤不是任选的。

为了将核酸与对其具有亲合性的物质结合，在所述核酸与所述物质的表面结合的条件下使溶胞混合物与对所述核酸具有亲合性的物质接触。该条件对于本领域的技术人员基本上是公知的。这些条件还取决于核酸与表面结合的方法。例如，如果经修饰的核酸是所述核酸，则结合可以通过代表所述修饰的核酸基团发生，例如生物素与抗生物素蛋白链菌素涂覆的表面结合。

如果分离未经修饰的核酸，则优选使所述核酸与具有二氧化硅表面的物质直接结合，因为除了别的原因之外，所述核酸不必进行修饰，甚至天然核酸都可以被结合。这些方法由各种文献进行了详细描述。例如，在Vogelstein，B.，and Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.USA 76(1979) 615-619中，提出了在碘化钠的存在下使来自琼脂糖凝胶的核酸与磨砂燧石玻璃结合的方法。在Marko，M.A.，等，Anal.Biochem.121(1982)382-387中描述了在高氯酸钠的存在下由玻璃粉上的细菌提纯质粒DNA。在DE 3734442中，描述了通过使用乙酸沉淀噬菌体颗粒并以高氯酸盐使噬菌体颗粒溶胞而在玻璃纤维过滤器上分离单链M13噬菌体DNA。对与玻璃纤维过滤器结合的核酸进行洗涤，然后用含有甲醇的Tris/EDTA缓冲液进行洗脱。在Jakobi，R.，等，Anal.Biochem.175(1988)196-201中描述了由λ噬菌体提纯DNA的类似方法。所述方法需要在离液盐溶液中使核酸与玻璃表面选择性结合，并使所述核酸与污染物，诸如琼脂糖、蛋白质或细胞残渣等分离。为使玻璃颗粒与污染物分离，可以将所述颗粒离心分离，或者使流体流过玻璃纤维过滤器。然而，这是抑制所述方法用于处理大量样品的限制性步骤。沉淀后通过添加盐和乙醇使用磁性颗粒固定核酸更为有利，并在例如Alderton，R.P.，等，Anal.Biochem.201(1992)166-169和WO 91/12079中进行了描述。在该方法中，核酸与磁性颗粒一同凝集。通过施用磁场并进行洗涤步骤将凝集物与原始溶剂分离。在一个洗涤步骤之后，核酸溶解在Tris缓冲液中。磁性多孔玻璃也可由市场购得，所述磁性多孔玻璃在多孔的特殊玻璃基质中包含磁性颗粒，并由含有抗生物素蛋白链菌素的层被覆。如果生物材料，如蛋白质或核酸在复杂的制备步骤中被修饰以使其与生物素共价结合，则上述产品可用于分离该生物材料。可磁化的特殊吸附剂已被证实极为有效且适用于自动样品制备。亚铁磁颜料和铁磁颜料以及超顺磁颜料均可用于该目的。最优选的MGP是在WO 01/37291中描述的那些。

使核酸与玻璃颗粒结合的方法可详细描述如下。优选在浓度为1mol/l～8mol/l，优选为2mol/l～6mol/l的离液剂或盐的存在下进行该结合。离液盐可以为例如碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸胍、异硫氰酸胍或盐酸胍。也可以使用其他物质。提纯效果来自于在下述条件下DNA或RNA与具有玻璃表面的物质结合的行为：即在一定浓度的离液剂、更高浓度的有机溶剂的存在下或在酸性条件下。为使样品与对于核酸具有亲合性的物质接触，将样品与所述物质混合，并培养足以发生结合的一段时间。专业人员通常熟悉用非磁性颗粒进行处理的各方法中的培养步骤的持续时间。通过及时地确定表面上不同点处的固定化生物材料的量可以优化该步骤。10秒～30分钟的培养时间可能适合于核酸。培养后，将已结合的核酸与液体分离。通常通过重力可以实现所述分离，或者在核酸与磁性玻璃颗粒结合的便利情况中通过施加磁场而分离与磁性颗粒结合的所述物质以完成上述分离。例如，可以将磁性颗粒拉至在其中进行培养的容器的器壁。其后可以除去含有未与磁性颗粒结合的样品内容物的液体。使用的除去方法取决于在其中进行培养的容器的类型。适宜的步骤包括通过移液或抽吸除去液体。结合有DNA或RNA的物质然后用例如70体积份乙醇与30体积份水(“70％乙醇”)的混合物或不包含醇的适宜的洗液洗涤至少一次。使用不会导致核酸由所述物质表面释放但能够尽量充分地洗掉有害污物的洗液。该洗涤步骤优选通过用所述洗液温育结合有核酸的物质而进行。所述物质优选在该步骤中再悬浮。被污染的洗液优选被除去，正如上述用于结合生物材料的步骤中那样。在最后的洗涤步骤之后，所述物质可以在真空中进行短暂干燥，或者允许流体蒸发。也可以进行使用丙酮的预处理步骤。之后，可采用相反的条件，例如将离液剂或有机溶剂的浓度降低以洗脱与所述物质结合的DNA或RNA。优选的是，通过例如借助重力或者在磁性玻璃颗粒的情况中借助磁力并除去上清液而将固定化核酸成粒从而执行将磁性玻璃颗粒与样品的其余部分分离的过程。然后，具有固定化生物材料的磁性玻璃颗粒在没有或仅有少量的离液剂和/或有机溶剂的溶液中再悬浮。作为选择，所述悬浮液也可以由没有或仅有少量的离液剂和/或有机溶剂的溶液稀释。在DE 3724442和Jakobi，R.，等，Anal.Biochem.175(1988)196-201中已知有这种性质的缓冲液。具有低盐含量的洗脱缓冲液尤其是具有含量为小于0.2mol/l的缓冲液。在特别优选的实施方式中，所述洗脱缓冲液包含用于缓冲目的物质Tris。在另一个特定的实施方式中，所述洗脱缓冲液是软化水。含有经提纯的DNA或RNA的溶液现在可用于其他反应。

对于洗涤和结合步骤，优选使用下述液体：所述液体适用于分子生物学中的过程，尤其是利用这些物质在特定条件下与玻璃颗粒结合的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的提纯过程。优选液体包括醇类和/或酮类或其与水的任何混合物。根据本发明醇类优选包括通式为R-OH的伯醇、仲醇或叔醇，在所述通式中R表示通式-(-CH₂)_n-CH₃，其中n＞＝0。不过，也可以使用其他醇类，只要它们适用于分子生物学目的即可，如丙三醇。尤其适宜的是醇类异丙醇、乙醇或其与水的混合物，优选80体积份异丙醇与20体积份水的混合物。在本发明的另一实施方式中，所述液体包含酮类，诸如丙酮。

对核酸和所述靶核酸成分具有亲合性的物质包括具有二氧化硅表面的物质，优选所述具有二氧化硅表面的物质是玻璃，对核酸具有亲合性的物质最优选是包含磁性玻璃颗粒的组合物。各步骤基本上如上所述进行。总之，将磁性玻璃颗粒添加至包含核酸的溶胞混合物中。在经过使吸附发生的适宜时期之后(其可通过机械搅拌而优化)，将所述颗粒与包含不被检测的附加成分的环境流体分离。优选通过将磁铁靠着容器壁放置而施加磁场并从管中除去残留液体进行上述分离。为进一步除去仍然可能存在的污物，优选使用不会导致核酸由玻璃表面释放的流体进行洗涤步骤。添加具有下述试剂条件的洗脱用缓冲液以从玻璃表面除去核酸，即，在该试剂条件下核酸不会与玻璃表面结合并被洗脱。这些条件尤其是低盐条件。取决于所述核酸的预计的进一步用途，现在可将所述流体与颗粒分离并进一步处理。优选通过应用磁场以使颗粒与洗脱物分离进行该分离步骤。在WO 01/37291中描述了用于该方法的最优选的磁性玻璃颗粒。

用于本发明的磁性玻璃颗粒可以作为不同制剂提供。可以以片剂、粉末或优选悬浮液的形式提供。在本发明的优选实施方式中，这些悬浮液包含5mg/ml～60mg/ml磁性玻璃颗粒(MGP)。在本发明的另一实施方式中，所述含有二氧化硅的材料悬浮在水性缓冲溶液中，该水性缓冲溶液任选地包含浓度为2mol/1～8mol/l，优选为4mol/l～6mol/l的离液剂。离液盐为碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸胍、异硫氰酸胍或盐酸胍。也可以使用本领域的技术人员所知的其他化合物。本发明的离液剂是扰乱液态水的有序结构，并在该试剂存在于含有DNA或RNA的溶液中时具有使DNA或RNA与磁性玻璃颗粒结合的效果的任何化学物质。制造适宜的水性缓冲溶液对于专业人员来说是显而易见的。例如在Sambrook等，(1989)，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor University Press，NewYork，NY，USA中可以找到适用于分子生物学目的的缓冲体系。优选的缓冲物质是三-(羟基甲基)-氨基甲烷(TRIS)、磷酸盐、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)(HEPES)、其盐或其他适宜的物质。另外，可以存在改变溶液的离子强度的物质，如NaCl、KCl或CaCl₂，或金属阳离子络合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐。也可以存在本领域的专业人员所知的其他生物物质。本发明的方法适用于从核酸包含核酸的与其他生物物质形成的复杂混合物中提纯核酸，即RNA或DNA。由此，不同核酸的混合物，甚至含有低丰度的所关注的核酸的混合物可得到提纯。在本发明的一个实施方式中，提纯特定核酸的混合物，在所述混合物中就浓度而言所述核酸可以为微量成分(或者可以以低丰度存在)。

在上述步骤之后，使用本发明的方法分离的核酸可根据需要进一步使用。例如，所述核酸可用作各种酶促反应的底物。当涉及核酸时，它们可以用于测序、放射性或非放射性标记、它们所包含的一种或多种序列的扩增、转录、与标记探针核酸杂交、翻译或连接。

在本发明的实施方式中，所述生物样品意图包含病毒或细菌细胞，以及来自多细胞生物体的分离的细胞，例如人类和动物细胞(如白细胞)，和具有免疫活性的低和高分子化合物，例如半抗原、抗原、抗体和核酸、血浆、脑脊髓液、唾液、粪便、活检标本、骨髓、含漱液、血清、组织、尿或其混合物。在本发明的优选实施方式中，所述生物样品是来自人体或动物体的流体，优选所述生物样品是血液、血浆、血清或尿。所述血浆优选是EDTA、肝素或柠檬酸盐血浆。在本发明的实施方式中，所述生物样品包含细菌细胞、真核细胞、病毒或其混合物。所述生物样品也可以是用于环境分析、食品分析或分子生物学研究的类型，例如来自细菌培养、噬菌体溶胞产物。

在本发明的另一优选实施方式中，所述核酸包含DNA或RNA或NDA与RNA。优选的是，所述DNA或RNA或NDA与RNA均来自微生物或病毒。所述病毒可以为甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、巨细胞病毒(CMV)或细小病毒B19。

本发明的方法优选用于研究，生物分析学尤其是医学中的诊断学或诊断研究，即，用于确定人类或动物中的疾病或失调的原因的方法。本发明的方法优选用于诊断分析或生物分析学。

本发明的优选实施方式是在例如WO 99/16781中所描述的可自动化的方法中使用本发明的方法或试剂盒。可自动化的方法是指该方法的各步骤适于使用能够在具有很少或没有来自人类的外部控制或影响的条件下进行操作的设备或装置进行。自动化方法是指所述可自动化的方法的各步骤使用能够在具有很少或没有来自人类的外部控制或影响的条件下进行操作的设备或装置进行。仅有所述方法的制备步骤可能必须手动进行，例如，存储容器必须装满并放好，样品的选择必须由人完成，以及本领域的技术人员已知的其他步骤如计算机的操控。所述设备或装置可以例如自动添加液体、混合样品或在特定温度下执行培养步骤。这样的装置或设备通常是由执行其中指定了单独的步骤和指令的程序的计算机控制的机械装置(robot)。优选的自动化方法是以高通量形式进行的那些方法，所述高通量形式是指所述方法和所使用的装置或设备针对短时间内的高通量样品而优化。在本发明的另一实施方式中，本发明的方法或试剂盒用于半自动化过程，所述半自动化过程是指一些反应步骤可能不得不手动进行。在本发明的优选实施方式中，含有本发明的MGP的悬浮液由存储容器中取出，并将部分体积添加至不同的反应容器中。反应容器可以是由塑料制成的反应管，最终为包括96或384或更多的可以进行反应的孔的微量滴定板的形式。然而，这些容器也可以由其他材料，例如钢制成。

附图说明

图1数据集1的结果

图2数据集1的结果

图3数据集2的结果

图4结果总汇(聚多卡醇浓度以V/V提供)

实施例

提供下列实施例和附图有助于理解本发明，本发明的真实范围由所附权利要求限定。应当理解可以对所陈述的各步骤进行修正，而不会脱离本发明的精神。

实施例1

公开了用于执行快速聚合酶链反应的改进的方法并在TaqMan

instrument(Roche，Mannheim，Germany)(参见WO 92/02638)中使用。在该方法中，在所述扩增反应中增添带有两个标记的探针。所述的两个标记非常接近以使该两个标记能够进行荧光能量转移(FRET)，然后猝熄所述标记的荧光。该探针可以与扩增物杂交，并被具有热稳定性的DNA聚合酶的核酸外切酶活性以扩增物依赖性方式水解。因此，所述标记释放，荧光不被进一步猝熄，由此获得可测定的荧光。扩增物的量因此与特定波长的发射光的强度相关联。因而，该特定的PCR方法可用于分析管中存在多少核酸，以及所述核酸可以多么有效的进行扩增。本领域的技术人员已知其他方法也可用于该评价。

荧光测定通过用在反应早期的循环中获得的初始荧光测定结果，即背景荧光除而标准化，而循环之间的荧光测定结果看起来似乎相对恒定。选择用于初始荧光测定的循环数对于所有相比较的反应而言相同，以使全部测定表示相对于相同的反应循环的增加。在聚合酶链反应扩增的早期循环中，靶标分子的数目可以由几何方程式N_i＝N_o×(1+E)ⁱ描述，其中N₀＝反应开始时的靶标分子的数目，N_i＝完成第i个循环时的靶标分子的数目，E＝扩增的效率(0＝＜E＝＜1)。在所述扩增的该几何增长阶段，达到特定阈值(C_T或C_P值或交点)所需的循环的数目与(1+E)的对数成反比。因此，C_T或C_P值表示允许在各反应间进行比较的反应效率的测定值。表示反应在更少的循环中达到阈值的C_T或C_P值的减小表明反应效率增加。当扩增产物的增多通过测定反应荧光的增强而被监测到时，C_T或C_P此处定义为在所述荧光超过任意荧光水平(arbitraryfluorescence level，AFL)之前所执行的扩增循环的数目。选择接近基线荧光水平的AFL，但高于所测荧光中的随机波动范围，从而使得反应动力学在所述扩增的几何增长阶段被测定。扩增产物在后续循环中的累积抑制反应并最终导致反应平稳段。对于所有反应选择AFL为1.5。由于PCR扩增由离散的循环构成且荧光测定每循环进行一次，因此测定的荧光通常在单循环中由AFL以下增至AFL以上。为提高测定精度，达到AFL阈值(此处称为_CT或C_P值或交叉点)的循环的“准确”数目通过在各循环间插入荧光测定值计算。

实施例1.1-用于两个实验的设备和材料

两个数据集证明通过在溶胞和结合混合物中使用浓度为1％～5％的聚多卡醇增大了分子生物检测的灵敏度。

设备：

-COBAS

AmpliPrep/COBAS

TaqMan

System with DockingStation(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)

-装置特异的一次性物品(device specific disposables)(SPU，S-Tubes，K-Tubes，K-Tips)

-用于制造样品材料的Eppendorf移液管和吸头

样品材料：

-WHO 1^st国际标准/用于HBV DNA NAT测定的HBV(NationalBiological Standards Board(NIBSC)，South Mimms，Potters Bar，Hertfordshire，UK/NIBSC code：97/746；conc.：5E+05国际单位冻干/瓶，在0.5mL无核酸酶的水中重构，conc.：1E+06 IU/mL)

-人类混合血清，对于HBV测试为PCR阴性

HBV WHO标准物在血清中稀释至12IU/mL(数据集1的实验)和10IU/mL(数据集2的实验)，并在-20℃冷冻直至进行制备。

试剂：COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV测试，IVD：

-盒1：小球

-盒3：蛋白酶和洗脱缓冲剂

-盒4：Mastermix，用额外的19个单位的ZO5刺突(spiked)，锰溶液

定量标准物

盒2包括具有不同的聚多卡醇浓度的将被测试的溶胞缓冲剂。其制备如下所述。所有缓冲剂的pH为4。

溶胞缓冲剂的基本组成：

下面，将对代表所有缓冲剂的制备的示例性缓冲剂的制备进行描述：

-将硫氰酸胍(GuSCN)(94.53g)溶解在约50℃的PCR级的水中(50ml/全部缓冲剂体积的0.25～0.5)，同时通过磁力搅拌棒进行搅拌

-加入柠檬酸钠(2.94g)并搅拌以溶解

-将在40℃的水浴中液化的聚多卡醇(30ml、20ml、10ml、2ml或0.2ml)加入对应的制备物(8.1a/b～8.5a/b)中，然后在搅拌的同时冷却至室温。

-将二硫苏糖醇(DTT)(2g)加入各制备物((8.1b～8.5b))中

-pH用HCl调节为pH 4.0

-各制备物用PCR级的水加注至200ml，再次搅拌直至各溶液均一，然后等分为80ml装入溶胞缓冲剂瓶中。

组分	最终浓度
		硫氰酸胍 (GuSCN)	4M	这些组分对于制造所有溶胞缓冲剂是不变的组分
柠檬酸三钠二水合物	50mM
		PCR级的水	./.
盐酸(HCl)	用于调节为pH4
		1，4-二硫苏糖醇(DTT)	0％/1％(W/V)	这两种组分的浓度发生变化
聚多卡醇	0.1％/1％/1.5％/3％/5％/ 15％(V/V)

制得的溶胞缓冲剂与其余试剂一样也在2℃～8℃存储，且人工装入所用系统的2号盒中。

实施例1.2-方法/实施：

将冷冻的样品材料在30℃的水浴中解冻。随后，COBAS

AmpliPrepinstrument中的自动样品制备与COBAS

TaqMan

instrument中的扩增及检测根据制造者的描述进行。测试和测试原理的概括及说明在COBAS

AmpliPrep/COBAS

TaqMan

HBV Test Package Insert(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany)中详细描述。

命中率的确定(图1和2)通过分析各聚多卡醇浓度下的24个复制物(replicates)进行，并确定单位复制物数目的阴性结果的数目。另外，靶标ct值、IQS ct值以及靶标荧光值和IQS荧光值被测定并计算IQS ct值与靶标ct值的差值。那些ct测定和荧光测定出于完全性考虑而仅仅进行并记录在图1和2中。所述确定值为命中率，命中率是指阴性结果与阳性结果的比率。在此上下文环境中ct值仅仅是指所述样品是阳性还是阴性。

实施例1.3-带有所用的溶胞缓冲剂的详细说明的数据分析：

实施例1.3.1-数据集1：

数据集1的实验中使用的溶胞缓冲剂如上所述制造。制备下列缓冲剂：

标识	聚多卡醇浓度 (V/V)	DTT浓度 (W/V)
			RL 8.1a	15％	0％
RL 8.2a	10％	0％
			RL 8.3a	5％	0％
RL 8.4a	1％	0％
			RL 8.5a	0.1％	0％

Figure DEST_PATH_GA20180642200710199513X01D00011

溶胞缓冲剂RL 8.3a和TL 8.4a(图2)的结果显示了最佳的趋向，这取决于不同的聚多卡醇浓度。由于该结果，进行了更多的实验，对0.1％～5％的范围进行了更精确的分析。

实施例1.3.2-数据集2：

数据集2的实验中使用的溶胞缓冲剂在很大程度上与用于数据集1的相同。所用的不存在的缓冲剂由其他产物制造或新制：

编码	聚多卡醇浓度 (V/V)	DTT浓度 (W/V)
			RL 8.3a	5％	0％
RL 6.2	1,5％	0％
			RL 8.1a	1％	0％
RL 8.5a	0,1％	0％

(这些缓冲剂已经存在)

RL 8.1a	15％	0％
			RL 6.3	0％	0％

(这些缓冲剂用于制造包含3％聚多卡醇的缓冲剂)

数据集2的结果证实了依赖于聚多卡醇的最佳值，其为1.5％～3％的聚多卡醇。(如图3和4中所示)

实施例1.4-总结：

聚多卡醇的浓度影响分子生物检测的灵敏度，例如在COBAS AmpliPrep/COBAS

TaqMan

System中进行的方法。优选范围为1.5％～3％(V/V)的聚多卡醇。优选制剂为：4M GuSCN、50mM柠檬酸钠、1％(W/V)DTT、3％(V/V)聚多卡醇，pH4。

Claims

1.一种组合物，所述组合物包含：

-离液剂，

-缓冲物质，和

-按单位体积的体积计算0.5％～5％的聚多卡醇。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含按单位体积的体积计算0.5％～3％的聚多卡醇。

3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述组合物包含按单位体积的体积计算0.75％～1.75％的聚多卡醇。

4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含按单位体积的体积计算1％～4.5％的聚多卡醇。

5.如权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物包含按单位体积的体积计算1.5％～3％的聚多卡醇。

6.如权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中，所述离液剂是硫氰酸胍、氯化胍或脲。

7.如权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中，所述缓冲物质是三-(羟基甲基)-氨基甲烷(TRIS)、磷酸盐、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)(HEPES)、乙酸盐或柠檬酸盐。

8.如权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中，所述组合物的pH为酸性。

9.如权利要求8所述的组合物，其中，所述组合物的pH为3～5。

10.如权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含还原剂。

11.如权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含4M硫氰酸胍、50mM柠檬酸钠、按单位体积的重量计算1％的DTT、按单位体积的体积计算3％的聚多卡醇，pH4。

12.如权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含蛋白酶。

13.如权利要求1～12中任一项所述的组合物用于提纯核酸、用于将核酸与固体表面结合或用于检测核酸的用途。

14.一种试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～12中任一项所述的组合物。

15.如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒另外还包括对核酸具有亲合性的物质。

16.如权利要求15所述的试剂盒，其中，所述对核酸具有亲合性的物质为具有二氧化硅表面的物质。

17.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于所述对核酸具有亲合性的物质是包含磁性玻璃颗粒的组合物。

18.如权利要求14～17中任一项所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒另外还包括洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。

19.一种用于检测生物样品中的核酸的方法，所述方法包括下列步骤：

a)在离液剂、缓冲物质和按单位体积的体积计算0.5％～5％的聚多卡醇的存在下培养所述生物样品，以及

d)检测所述核酸。

20.一种用于检测生物样品中的核酸的方法，所述方法包括下列步骤：

a)在离液剂、缓冲物质和按单位体积的体积计算0.5％～5％的聚多卡醇的存在下培养所述生物样品，

b)分离所述核酸，以及

d)检测所述核酸。

21.一种用于检测生物样品中的核酸的方法，所述方法包括下列步骤：

c)扩增所述核酸，以及

d)检测所述核酸。

22.一种用于检测生物样品中的核酸的方法，所述方法包括下列步骤：

b)分离所述核酸，

c)扩增所述核酸，以及

d)检测所述核酸。

23.如权利要求21～22中任一项所述的方法，其中在所述扩增步骤c)中通过聚合酶链反应扩增所述核酸。

24.一种用于提纯生物样品中的核酸的方法，所述方法包括下列步骤：

b)分离所述核酸由此提纯所述核酸。

25.如权利要求19～22和24中任一项所述的方法，其中，在步骤a)中，在离液剂、缓冲物质和按单位体积的体积计算0.5％～3％的聚多卡醇的存在下培养所述生物样品。

26.如权利要求25所述的方法，其中在步骤a)中，在离液剂、缓冲物质和按单位体积的体积计算0.75％～1.75％的聚多卡醇的存在下培养所述生物样品。

27.如权利要求20、22和24中任一项所述的方法，其中所述分离步骤b)包括将所述核酸与对核酸具有亲合性的物质结合。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述对核酸具有亲合性的物质为具有二氧化硅表面的物质。

29.如权利要求27所述的方法，其中所述分离步骤b)还包括洗涤与所述物质结合的所述核酸并将所述核酸由所述物质洗脱。

30.如权利要求28所述的方法，其特征在于所述具有二氧化硅表面的物质是包含磁性玻璃颗粒的组合物。

31.如权利要求19～22和24中任一项所述的方法，其特征在于所述生物样品是来自人体或动物体的液体。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述来自人体或动物体的液体为血液、血浆、血清或尿。

33.如权利要求19～22和24中任一项所述的方法，其特征在于所述核酸包含DNA或RNA或DNA与RNA。

34.如权利要求33所述的方法，其特征在于所述DNA或RNA或DNA与RNA来源于微生物或病毒。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述微生物或病毒为甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒或巨细胞病毒。