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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zum Optimieren
des Bindens von Nukleinsäure,
vorzugsweise aus Blut stammend, in wässriger Lösung an eine Festphase, sowie
einen Kit zum Isolieren von Nukleinsäure.
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In
der WO 00/09746 wird ein Gefäß zur Blutentnahme
beschrieben, das eine Lösung
enthält,
die als Bestandteile ein Guanidiumiumsalz, eine Puffersubstanz,
ein Reduktionsmittel und/oder ein Detergenz umfasst. Das Gefäß ist besonders
geeignet zur Entname von Blut, das auf Nukleinsäuren hin untersucht werden soll.
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Die
WO 01/60517 beschreibt ein Gefäß zur Probenentnahme,
das eine Nukleinsäurestabilisierende Lösung und
eine Nukleinsäure-bindende
Festphase enthält.
Das Gefäß ist besonders
geeignet zur Entnahme von Blut, das auf Nukleinsäure hin untersucht werden soll.
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Während der
Abnahme von z.B. Blut wird dieses herkömmlicherweise in Gefäßen aufgefangen,
die bereits Antikoagulantien wie z.B. Heparin, Citrat oder EDTA
enthalten. So wird verhindert, dass das Blut gerinnt. So gewonnene
Blutproben lassen sich längere
Zeit bei geeigneten Temperaturen lagern. Diese Art der Blutgewinnung
hat jedoch erhebliche Nachteile, wenn Nukleinsäuren, wie z.B. mRNA oder virale
RNA und DNA analysiert werden sollen. Für solche Zwecke sollten die
Nukleinsäuren,
die in der Probe enthalten sind, am besten bereits im Moment der
Abnahme stabilisiert werden, d.h. es sollte der Abbau der vorhandenen
Nukleinsäuren,
aber auch die Neusynthese von mRNA verhindert werden.
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Dieses
Ziel der stabilen Lagerung der im Probenmaterial enthaltenen Nukleinsäuren vom
Moment der Abnahme an ist bei der Lagerung, insbesondere von Blut,
aus folgenden Gründen
bis jetzt praktisch nicht zu bewerkstelligen:
Zellen enthalten
Nukleasen, d. h. Enzyme, die Nukleinsäuren zerstören, sobald sie mit ihren Substraten
(RNA, DNA) in Kontakt kommen. Die Wirkung zellulärer und extrazellulärer Nukleasen
ist normalerweise unter physiologischer Kontrolle, solange die Zellen
in ihrer normalen Umgebung sind. Die Entnahme von Blut führt zu mehr
oder weniger starken Veränderungen
der in den Zellen enthaltenen Nukleinsäuren. Nukleasen werden dann
innerhalb der Zellen und/oder durch die Lyse von Zellen nach außen freigesetzt.
Außerdem
werden Nukleinsäuren
mehr oder weniger stark synthetisiert. Gerade die Langzeitlagerung
von biologischen Proben, wie Blut, führt zur Alterung und Zerstörung der
Zellen.
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Die
oben geschilderten Probleme der Stabilität von Nukleinsäure in Blutproben
trifft in ähnlicher
Art und Weise auch auf Nukleinsäuren
aus anderen biologischen Proben, wie z.B. Speichel und Gewebeproben, zu.
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Ein
weiteres Problem bei der Langzeitlagerung von biologischen Proben
(z.B. Blut), die nach herkömmlichen
Abnahmeverfahren gewonnen wurden, ist die starke Veränderung
des Probenmaterials. Solche Veränderungen,
wie z.B. starke Lyse von Zellen, können dazu führen, dass die Standardverfahren
der Nukleinsäureisolierung
nicht mehr mit befriedigender Effizienz und Reproduzierbarkeit funktionieren.
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Abgesehen
von den Problemen einer stabilen Lagerung von Nukleinsäuren, die
im Probenmaterial enthalten sind, ergeben sich beim herkömmlichen
Verfahren der Probenentnahme (z.B. Blut) weitere Schwierigkeiten.
Z.B. werden die herkömmlichen
Antikoagulantien oft bei der Nukleinsäureisolierung nicht mit genügender Effizienz
abgetrennt und stören
bei der nachfolgenden Nukleinsäureanalytik,
wie z.B. bei der Amplifikation mittels PCR (Polymerase Chain Reaction).
Heparin ist z.B. ein allgemein bekannter Inhibitor der PCR.
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Schließlich ergibt
sich bei der quantitativen Nukleinsäureanalytik die Frage, wie
das gesamte Verfahren von der Probennahme bis hin zur Nukleinsäuremessung
unter standardisierten Bedingungen kontrolliert und optimiert werden
kann. Idealerweise sollte dem Probenmaterial bereits bei der Entnahme
eine in Menge und Qualität
definierte Standardnukleinsäure
zugesetzt werden, die dem gesamten Prozeß der Probennahme bis hin zur
Bestimmung unterzogen wird. Die ursprünglich in der Pobe enthaltenen
Nukleinsäure
sollte auch möglichst
quantitativ der Analytik zugeführt
werden. Dies ist insbesondere von Bedeutung bei der Diagnostik, da
sich hierbei, je nach Befund, unterschiedliche Konsequenzen in der
Behandlung des Probenspenders ergeben können. Auch dies ist mit den
herkömmlichen
Abnahme- und Isoliersystemen nicht zu bewerkstelligen.
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Ein
weiterer Nachteil der konventionellen Probenentnahme, wie Blutentnahme,
ist die Gefahr der Übertragung
von infektiösem
Material, da bisher für
die Nukleinsäureisolierung
manuelle Verfahrensschritte notwendig sind. Ein Kontakt mit potentiell
infektiösen
Erregern kann nicht ausgeschlossen werden.
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In
der Literatur ist ein Verfahren beschrieben, bei dem eine Blutprobe
unmittelbar nach der Abnahme vom Patienten mit Guanidiniumsalz vermischt
wird (
EP 0 818542 A1 ).
Bei diesem Verfahren liegt das Guanidiniumsalz in Pulverform vor,
um somit die höhere
Stabilität
des Guanidiniumsalzes zu nutzen. Dieses Verfahren besitzt jedoch
gravierende Nachteile, da sich das Salz z.B. zunächst in dem zugegebenen Blut
lösen muss. Der
Lösungsvorgang
ist insbesondere temperaturabhängig
und aufgrund des verwendeten, undurchsichtigen Probenmaterials nicht
zu kontrollieren. Die Verwendung eines entspechenden Produktes für diagnostisch-medizinische
Zwecke ist somit äußerst problematisch.
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Nukleasen
sind äußerst aktive
Enzyme, die insbesondere in Körperflüssigkeiten/sekreten,
wie Speichel oder Blut, in hoher Konzentration vorkommen, und die
nur unter extrem denaturierenden Bedingungen zu inhibieren sind.
Die Denaturierung ist abhängig
von der Konzentration des Guanidiniumsalzes in Lösung. Eine inhibierende Konzentration
von Guanidiniumsalz in Lösung
ist bei dem Verfahren der
EP
0 818 542 nicht von Anfang an gegeben. Es kommt also zum
unkontrollierten Abbau von Nukleinsäuren während des Lösungsvorgangs. Bei diesem Verfahren
wird außerdem
auf den Zusatz von reduzierenden Agenzien verzichtet, ohne die eine
wirksame Inhibition – insbesondere
von RNasen – in
der Regel nicht gewährleistet
ist. Schließlich
trifft die
EP 0 818 542 keinerlei
Maßnahmen
zur möglichst
quantitativen Isolierung der Nukleinsäure des Probenmaterials.
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Die
gemäß herkömmlicher
Methoden erhaltene Probe kann außerdem nicht direkt für die weitere
Nukleinsäureisolierung
an Festphasen verwendet werden. Die Verwendung von Guanidiniumsalzpulver
erlaubt außerdem
nicht den Zusatz von internen Nukleinsäurestandards. Solche Standards
sind zur Verfahrenskontrolle und genauen Quantifizierung jedoch
unerläßlich.
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Der
vorliegenden Erfindung lag das technische Problem zugrunde, Mittel
zum Optimieren der Ausbeute an Nukleinsäuren aus biologischen Proben
anzugeben, insbesondere Mittel anzugeben, die die Bindung von Nukleinsäure aus
der Probe an eine Festphase optimieren. Schließlich sollen die Mittel ein
verbessertes Nukleinsäureanalyseverfahren
aus biologischen Proben mit einer niedrigeren Nachweisgrenze ermöglichen, wobei
dies insbesondere im Rahmen der Diagnostik wünschenswert ist.
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Dieses
Problem wird erfindungsgemäß gelöst durch
eine Zusammensetzung zum Optimieren des Bindens von Nukleinsäure in wässriger
Lösung
an eine Festphase (Bindelösung
auch PrIS genannt), enthaltend ein Guanidiniumsalz, eine Puffersubstanz
und ein Detergenz, gekennzeichnet dadurch, dass der pH-Wert der Lösung ≥ 7,0, vorzugsweise > 7,5, ganz besonders
bevorzugt > 8,0 ist.
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Dieses
Problem wird auch gelöst
durch einen Kit zum Isolieren von Nukleinsäure, enthaltend folgende Bestandteile:
- a) eine wässrige
Lösung
zum Stabilisieren von Nukleinsäure
(auch N-sS oder NAST genannt), enhaltend folgende Bestandteile:
– ein Guanidiniumsalz,
und/oder
– eine
Puffersubstanz, und/oder
– ein
Reduktionsmittel, und/oder
– ein Detergenz;
- b) eine Zusammensetzung zum Optimieren des Bindens von Nukleinsäure in wässriger
Lösung
an eine Festphase, enthaltend ein Guanidiniumsalz, eine Puffersubstanz
und ein Detergenz, gekennzeichnet dadurch, dass der pH-Wert der Lösung ≥ 7,0 ist;
und
- c) eine Festphase, die Nukleinsäuren binden kann.
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Weitere
bevorzugte Ausführungsformen
sind in den Unteransprüchen
angegeben.
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Der
Kit bietet folgende Vorteile: 1. Die Probe, vorzugsweise Blut, wird
bereits im Moment der Abnahme lysiert, indem das Abnahmegefäß bereits
eine entsprechende Lyselösung,
welche gleichzeitig eine Nukleinsäure-stabilisierende Lösung ist,
enthält.
2. Die Nukleinsäure-stabilisierende
Lösung
bewirkt, dass das Probenmaterial, insbesondere die darin enthaltenen
Nukleinsäuren,
unmittelbar nach Kontakt mit der Lösung stabilisiert werden. 3.
Die Nukleinsäure-stabilisierende
Lösung
ist ferner so gewählt,
dass das Probenmaterial direkt in nachfolgenden Isolierungsverfahren
verwendet werden kann. 4. Die Nukleinsäure-stabilisierende Lösung kann
bei der nachfolgenden Isolierung so effizient abgetrennt werden,
dass eine Hemmung bspw. der PCR nicht auftritt. 5. Der Nukleinsäure-stabilisierenden
Lösung
kann ein interner Standard zugesetzt werden. Dieser erlaubt die
Kontrolle des gesamten Verfahrens von der Probenentnahme bis hin
zur Nukleinsäuredetektion.
6. Die in dem Gefäß enthaltene
Festphase eignet sich insbesondere für eine spätere Isolierung der daran gebundenen
Nukleinsäure.
7. Der Zusatz der Zusammensetzung zum Binden der Nukleinsäure an eine Festphase, "Bindelösung", führt – ohne an
eine Theorie gebunden zu sein – zu
einer Freisetzung der Nukleinsäuren
aus evtl. entstandenen Präzipitaten
von Blutbestandteilen und einer verbesserten Bindung der Nukleinsäure an die
Festphase und somit zu einer erhöhten
Ausbeute an isolierter Nukleinsäure,
die der Analytik zur Verfügung
steht. Außerdem
wird durch die Bindung der Nukleinsäuren an die Festphase die anschließende Isolierung
vereinfacht, indem bereits eine erste Trennung von Nukleinsäure und
weiteren Probenbestandteilen in dem Gefäß erfolgt.
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Die
Nukleinsäure-stabilisierende
Lösung
kann so gewählt
werden, dass die Nukleinsäure
sofort nach der Zellyse an die entsprechende Oberfläche bindet
oder erst nach Zusatz weiterer Reagenzien. Der erste Fall ist bspw.
gegeben wenn eine Glasoberfläche
in Anwesenheit eines Guanidiniumsalzes vorgegeben wird. Der zweite
Fall lässt
sich durch den Zusatz der "Bindelösung" oder z.B. durch
Vorlegen einer Biotinbeschichteten Oberfläche und nachträglichem
Hinzufügen
von Streptavidin mit Nukleinsäure
bindenden Eigenschaften erzielen bzw. optimieren.
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Der
Kit lässt
sich grundsätzlich
für die
Aufarbeitung beliebiger Körperflüssigkeiten
verwenden. Insbesondere ist er für
die Aufarbeitung von Körperflüssigkeiten
geeignet, die zelluläre
Bestandteile enthalten, wie z. B. Knochenmark, aber auch z.B. Speichelproben.
Vorzugsweise handelt es sich jedoch um einen Kit zur direkten Entnahme
von Vollblut aus einem Spender.
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Der
Kit enthält
Vorzugsweise ein Gefäß, das vorzugsweise
aus einem herkömmlichen
Blutentnahmegefäß (z. B.
Röhrchen)
besteht, in dem ein definiertes Volumen einer Nukleinsäure-stabilisierenden
Lösung und
eine Nukleinsäure-bindende
Festphase enthalten sind. Das Röhrchen
wird anschließend
Vorzugsweise mit einem definierten Unterdruck versehen, der ermöglicht,
dass nur ein bestimmtes Volumen Blut entnommen wird. Das Röhrchen kann
mit konventionellen Methoden der Blutabnahme gehandhabt werden.
Die in dem Röhrchen
enthaltene Stabilisierungslösung
enthält
in ihrer bevorzugten Ausführungsform
folgende Reagenzien:
ein Guanidiniumsalz, z. B. Guanidiniumthiocyanat,
ein Detergenz, z. B. Triton-X-100, ein Reduktionsmittel, z. B. Dithiothreitol,
und ein geeignetes Puffersystem wie z.B. Citrat, Tris, MES oder
Hepes. In der beschriebenen Zusammansetzung ist die Lösung kompatibel
mit dem Vakuumröhrchen.
Die Lösung
kann problemlos in dem Vakuumröhrchen
gelagert werden, ohne dass es zu einer Beeinträchtigung der gewünschten
stabilisierenden Funktion kommt. Das gesamte System ist insbesondere
für den
Blutspender problemlos und sicher bei der Probennahme. Die Nukleinsäure-stabilisierende
Lösung,
enthaltend das Guanidiniumsalz, welches als Lyse- und stabilisierende
Substanz dient, die Nukleinsäure
bindende Festphase, die Puffersubstanz, das Reduktionsmittel und
das Detergenz ist lagerungsstabil und verwandelt das zugeführte, frisch
entnommene Material, wie Blut, in ein Material, das ebenfalls lagerungsstabil
ist und das für
die weitere Nukleinsäureanalyse
bzw. isolierung unmittelbar verwendet werden kann.
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Als
Guanidiniumsalz sind Guanidiniumthiocyanat und/oder Guanidiniumchlorid
bevorzugt.
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Die
Abk. „M", „mM" und „μM" stehen im Folgenden
für die
Einheiten mol/l, mmol/l bzw. μmil/l.
Vorzugsweise liegt das Guanidiniumsalzin einer Konzentration von
1 bis 8,0 M vor. Als Puffersubstanz ist Tris oder Citrat bevorzugt,
wobei der exakte pH vorzugsweise mit HCl eingestellt wird. Weitere
mögliche
Puffer sind jedoch HEPES, MOPS, MES, Citrat- und Phosphatpuffer, wie z.B. PBS.
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Als
Festphase können
alle Nukleinsäure
bindenden Materialien eingesetzt werden. Besonders geeignet sind
Glaspartikel, Nukleinsäure
bindende Polymere, mit solchen beschichtete Partikel, Nukleinsäure bindende
Beschichtungen des Entnahmesystem oder mit Silika beschichtete Partikel.
Die Oberfläche
der Nukleinsäure-bindenden
Festphase kann alternativ mit spezifischen Bindemolekülen (z.B.
Streptavidin, Oligonukleotide, peptide nucleic acids (PNAs), etc.)
beschichtet werden, die mit Markermolekülen auf der Nukleinsäure oder
mit der Nukleinsäure
direkt wechselwirken. Die Formgebung der Materialien ist nur abhängig von
der Form des Entnahmesystem und der nachfolgenden Isolierungsmethode.
Besonders geeignet sind Formgebungen, die im Anschluß direkt
bei der weiteren Verarbeitung der Nukleinsäure eingesetzt werden können, ganz
besonders geeignet sind Oberflächen,
die mit herkömmlichen
Isolierungsverfahren kompatibel sind, wie z.B. Magnetpartikel oder
Vliese.
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Geeignete
Festphasen sind gewerblich erhältlich,
z. B. Silica beschichtete Magnetpartikel, wie sie im mRNA Isolation
Kit for Blood/Bone Marrow (Roche) enthalten sind.
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Die
Pufferkonzentration in der Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung liegt
vorzugsweise zwischen 10 und 300 mM, besonders bevorzugt zwischen
10 und 100 mM.
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Als
Detergenz in der Nukleinsäure-stabilisierenden
Lösung
ist Triton-X-100 bevorzugt. Weitere mögliche Detergenzien sind NP-40,
Tween 20, Polydocanol oder andere Detergenzien.
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Triton-X-100
und Tween 20 sind Markennamen. Die Detergenzkonzeniration in der
Nukleinsäure-stabilisierenden
Lösung
liegt vorzugsweise bei 5 bis 30% (w/v), besonders bevorzugt bei
10 bis 20% (w/v).
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Als
Reduktionsmittel ist DTT bevorzugt, wobei jedoch auch β-Mercaptoethanol,
TCEF(Tris(2-carboxyethyl)phosphin) oder andere Reduktionsmittel
einsetzbar sind.
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Die
bevorzugte Konzentration des Reduktionsmittels in der Nukleinsäure-stabilisierenden
Lösung
liegt bei 0,1 bis 10% (w/v); besonders bevorzugt sind 0,5 bis 2%
(w/v).
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Der
pH der Lösung
liegt in der Nukleinsäure-stabilisierenden
Lösung
vorzugsweise bei 3,0 bis 9,0, besonders bevorzugt bei 4,0 bis 7,5.
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Der
pH der Lösung
wird insbesondere so gewählt,
dass sich nach Zugabe des Probenmaterials in der Nukleinsäure-stabilisierenden
Lösung
ein pH-Wert im Bereich von 5,0 bis 7,5 einstellt. Da durch Vorgabe
des Unterdrucks sichergestellt wird, welches Probenvolumen entnommen
wird, kann durch Vorlegen einer gewünschten Pufferkonzentration
bzw. einem entsprechenden Volumen an Lösung gewährleistet werden, dass nach
Aufnahme des vollständigen
Probenvolumens der gewünschte
pH auch erzielt wird. Besonders bevorzugt ist ein pH zwischen 6,3
und 6,9 nach Probenaufnahme.
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Eine
besonders bevorzugte Nukleinsäure-stabilisierende
Lösung
enthält
3–4 M
Guanidiniumthiocyanat, 40–80
mM Tris, 11–14%
(w/v) Triton-X-100, 40–80
mM DTT, eine Festphase aus Glaspartikeln oder Silika beschichteten
Magnetpartikeln, wobei der pH so eingestellt wird, dass sich nach
Blutzugabe ein pH von 6 bis 7,5 ergibt.
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Bei
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
weist das Volumen zur Aufnahme der Blutprobe einen Unterdruck auf,
der so eingestellt werden kann, dass ein vorab bestimmtes Blutvolumen
in das Entnahmegefäß eingesaugt
wird, nachdem ein Blutgefäß angestochen
wurde. Entsprechend evakuierte Gefäße sind auf dem Markt erhältlich.
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Das
Gefäß, enthaltend
das entnommene Blut, kann dann sofort der weiteren Schritte zur
Analytik zugeführt
werden oder aber für
einen längeren
Zeitraum (bis mehrere Tage oder Wochen) ohne Nachteile für die Qualität der Probe
aufbewahrt werden.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird die frisch entnommene Probe, wie Blut, direkt in dem Entnahmegefäß mit der
oben beschriebenen Nukleinsäure-stabilisierenden
Lösung
in Kontakt gebracht, so dass sofort sämtliche Vorgänge, die
das Nukleinsäuremuster
der Probe verändern
können,
gestoppt werden. Die Nukleinsäuren
können
vorzugsweise bereits im Gefäß an der
Festphase gebunden vorliegen oder in einem weiteren Reaktionsschritt
an die Festphase gebunden werden, wobei das Ausmaß der Bindung
durch die Zugabe der erfindungsgemäßen Bindelösung optimiert wird.
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Die
später
im Rahmen der Nukleinsäureanalytik
ermittelten Daten hinsichtlich der nachgewiesenen Nukleinsäuren stellen
daher sehr genau den Ist-Zustand zum Zeitpunkt der Blutentnahme
dar, sowohl hinsichtlich der Mengen als auch der Arten der Nukleinsäuren.
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Vorzugsweise
entspricht die entnommene Blutmenge dem 0,1- bis 2-fachen der in
dem Gefäß vorgelegten
Lösung.
Letztere beträgt
vorzugsweise 0,5 bis 5,0 ml. Somit liegt die Endkonzentration an
Guanidiniumsalz nach Probenzusatz vorzugsweise bei 1,0 bis 5 M,
vorzugsweise bei 1,0 bis 3,0 M, bevor die Bindelösung zugesetzt wird.
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Nach
Zugabe der Bindelösung
zum Gefäß, enthaltend
das Probenmaterial, wie Blut, und die Nukleinsäure-stabilisierende Lösung, enthält die Lösung in
dem Gefäß vorzugsweise:
- – ein
Guanidiniumsalz in einer Konzentration von 1 bis 8 M;
- – ein
Detergenz in einer Konzentration von 5 bis 25% (w/v);
- – einen
Puffer in einer Konzentration von 100 bis 500 mM;
- – ein
Reduktionsmittel in einer Konzentration von 5 bis 50 mM; und hat
einen pH-Wert von > 7.5,
vorzugsweise ≥ 8,0.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
enthält
das Gefäß mit Blutprobe,
Stabilisierungslösung
und Bindelösung
folgende Bestandteile:
- – ein Guanidiniumsalz in einer
Konzentration von 1,5 bis 5, vorzugsweise von 2,5 bis 3,5 M;
- – ein
Detergenz in einer Konzentration von 8 bis 20, vorzugsweise 10 bis
16% (w/v);
- – ein
Puffer in einer Konzentration von 150 bis 400, vorzugsweise 200
bis 300 mM;
- – ein
Reduktionsmittel in einer Konzentration von 20 bis 40 mM, vorzugsweise
25 bis 35 mM; und mit
- – einem
pH > 7,0, vorzugsweise > 7,5, besonders bevorzugt ≥ pH 8,0.
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Weiterhin
ist bevorzugt, dass die oben genannte Lösung aus Blutprobe, NsS und
PrIS einen pH ≤ 10, vorzugsweise ≤ pH 9,0 aufweist.
Diese Maßnahme
minimiert eine alkalische Hydrolyse der Nukleinsäure.
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Der
erfindungsgemäße Kit wird
vorzugsweise dann zur Probenentnahme eingesetzt, wenn die Probe für die Nukleinsäureanalytik
verwendet werden soll.
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Die
Verwendung o.g. Nukleinsäure-stabilisierenden
Lösung
als Bestandteil des beschriebenen Abnahmesystems garantiert die
sofortige Lyse der Zellen und simultane Stabilisierung der Probe
durch unmittelbare Inaktivierung der Nukleasen. Überraschenderweise kann die
so gewonnene Probe selbst bei Raumtemperatur über mehrere Tage gelagert werden.
Das Abnahmesystem gewährleistet
außerdem
eine kontaminationssichere und nicht-infektiöse Handhabung von der Probennahme über die
Nukleinsäureisolierung
bis hin zur Analytik. Bei den herkömmlichen Verfahren der Nukleinsäureisolierung
sind bisher immer zusätzliche
Handhabungsschritte (wie die Überführung der
entnommenen Blutprobe in die Reagenzien zur Nukleinsäureisolierung usw.)
notwendig, die mit einem zusätzlichen
Infektionsrisiko oder Kontaminationsrisiko der Probe verbunden sind,
wie eingangs bereits ausführlich
beschrieben wurde. Obwohl der Kit im wesentlichen im Zusammenhang mit
einem Gefäß zur Aufnahme
von Blut beschrieben worden ist, gilt das Gesagte auch für andere
Systeme zur Aufnahme biologischer Proben, wie Abstriche.
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Überraschenderweise
kann die zum Teil an die Festphase gebundene Nukleinsäure auch
nach längerer
Lagerung einfach aus dem Probenmaterial isoliert werden. Während der
Lagerung der stabilisierten Nukleinsäure können mit zunehmender Lagerungsdauer
zunehmend Präzipitate,
bestehend aus Blutbestandteilen, wie z.B. Porphyrinsalze des Hämoglobins,
entstehen, an die Nukleinsäure
teilweise bindet. Die Anwesenheit der bindenden Festphase während der
Probenlyse und -stabilisierung führt
zu einer sofortigen Bindung einiger Nukleinsäuren, vorwiegend DNA an die
Oberfläche.
Erst durch Zusatz der Bindelösung
wird eine vollständige
Freisetzung der Nukleinsäure
aus den evtl. entstandenen Präzipitaten
und eine optimale Bindung derselben an die Festphase erzielt. Der
Zusatz sollte unmittelbar vor dem eigentlichen Isolierungsschritt
erfolgen, da durch Zugabe der Bindelösung keine optimale Stabilisierung
der Nukleinsäure
mehr gewährleistet
ist. Vorzugsweise erfolgt der Zusatz der Bindelösung unmittelbar vor der eigentlichen
Probenaufarbeitung zur Isolierung der Nukleinsäure.
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Die
mit dem Kit gewonnene Probe kann gängigen Nukleinsäureisolierungsverfahren
zugeführt
werden; bei Verwendung von Silika beschichteten Magnetpartikeln
oder Silica-Vliese
in Säulen
ist es möglich,
auf gängige
Standardverfahren der Nukleinsäureisolierung
zurückzugreifen
(Magnetseparation bzw. Zentrifugation oder Unterdruck, Waschen,
Elution der Nukleinsäure).
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Die
vorliegende Erfindung besteht somit aus einem Probenaufnahmesystem,
das so konzipiert ist, dass folgende Bedingungen erfüllt werden:
1. Kontrollierte Probenentnahme und gleichzeitige Stabilisierung der
im Probenmaterial enthaltenen Nukleinsäuren (DNA, RNA). 2. Probenentnahme,
bei der auf den Einsatz von Antikoagulantien vollkommen verzichtet
werden kann. 3. Optimierte Bindung der Nukleinsäuren an eine im System enthaltene
Festphase. 4. Die mit dem beschriebenen System gewonnene Probe kann
leicht in bestehende Nukleinsäureisolierungssysteme
integriert werden. 5. Das System samt darin enthaltener Probe ist lagerungsstabil.
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Zusätzlich wurde überraschenderweise
festgestellt, dass die mit dem beschriebenen Abnahmesystem gewonnene
Probe in dem Gefäß über längere Zeit
ohne Degradation der Nukleinsäuren
lagerungsstabil ist.
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Die
folgenden Beispiele erläutern
die Erfindung.
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1:
Probenentnahmegefäß mit Nukleinsäure-stabilisierender
Substanz (N-sS), definiertem Vacuum, mit Festphase versetzt und
mit Septum versiegelt.
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2:
Graphische Darstellung einer Gelanalyse (1% Agarose) von 28S und
18S rRNA, die im Probeentnahmegefäß unterschiedlich lange gelagert
wurde. Spalte 1: Isolierung und Auftrennung der RNA unmittelbar
nach Probenentnahme (keine Lagerung), Spalte 2: Lagerung für einen
Monat bei –20°C, Spalte
3: Lagerung für
6 Tage bei 4°C.
Die Menge der aufgetragenen RNA entsprach einem Blutvolumen von
120 μl.
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3:
Graphische Darstellung einer Gelanalyse (1% Agarose) von DNA, die
im Probeentnahmegefäß unterschiedlich
lange gelagert wurde. Spalte 1: Isolierung unmittelbar nach Probenentnahme
(keine Lagerung), Spalte 2: Lagerung für einen Monat bei –20°C, Spalte
3: Lagerung für
6 Tage bei 4°C.
Die Menge der aufgetragenen DNA entsprach einem Blutvolumen von
10 μl.
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4:
Graphische Darstellung einer Gelanalyse von isolierter MS2-RNA nach
Inkubation in Serum/Stabilisierungslösung mit/ohne DTT nach 180
min bei 40°C.
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Spalte
1: Positiv Kontrolle: MS-2 RNA; Spalte 2: DNA Marker; Spalten 3
bis 5: MS-2 RNA nach Inkubation mit DTT-haltiger Stabilisierungslösung (3-fach
Bestimmung); Spalten 6 bis 8: MS-2 RNA nach Inkubation mit Stabilisierungslösung ohne
DTT (3-fach Bestimmung).
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5:
Graphische Darstellung einer Gelanalyse von MS2-RNA, die nach Inkubation
in Serum/Stabilisierungslösung
für 3 Tage
bei 40°C
isoliert wurde. Der Guanidiniumthiocyanatgehalt (GTC Gehalt) der
Stabilisierungslösung
nach Serumzugabe, in welcher die betreffende RNA inkubiert wurde,
ist in der entsprechenden Spalte angegeben.
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Spalte
1: 2,70 M GTC, Spalte 2: 2,5 M GTC, Spalte 3: 2,36 M GTC, Spalte
4: 2,2 M GTC, Spalte 5: 2,08 M GTC, Spalte 6: 1,94 M GTC, Spalte
7: 1,80 M GTC, Spalte 8: 1,66 M GTC.
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6:
Graphische Darstellung einer Gelanalyse der PCR Amplifikate von
MS2-RNA, welche nach 1 bzw. 8 Tagen Inkubation bei 40°C in Serum/Stabilisierungslösung isoliert
wurde. Spalte 1: Amplifikat der nach einem Tag isolierten RNA, Spalte
2: Amplifikat der nach 8 Tagen isolierten RNA. Spalte 3: DNA Marker,
Spalte 4: MS2-RNA positiv Kontrolle: 0,8 μg in 10 μl RT 1:50 verdünnt, 1 μl amplifiziert.
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7:
Graphische Darstellung einer Gelanalyse von isolierter MS2-RNA nach
6 (Spalten 2–12)
bzw. 13 (Spalten 14–19)
Tagen Inkubation bei Raumtemperatur in Serum/Stabilisierungslösung. Hinter
den betreffenden Spalten steht der pH-Wert, welcher nach Mischung
von Serum und Stabilisierungslösung
erreicht wurde.
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Spalte
1, 13, 20: DNA-Marker, Spalte 2: pH 8.0, Spalte 3: pH 7.7, Spalte
4: pH 7.5, Spalte 5: pH 7.35, Spalte 6: pH 7.18, Spalten 7, 14:
pH 7.07, Spalten 8, 15: pH 6.94, Spalten 9, 16: pH 6.8, Spalten
10, 17: pH 6.72, Spalten 11, 18: pH 6.68, Spalten 12, 19: pH 6.7.
Die Stabilisierungslösung
der RNA in Spalten 12, 19 hatten den gleichen pH Wert, wie die der
RNA in Spalte 11, enthielt aber 5 M 4 M GTC anstelle von 4 M 3 M.
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8:
Graphische Darstellung des Nachweises von RNA und DNA im Standard
Agarosegel (1% Agarose). Spalte 1: Molekulargewichtsmarker, Spalte
2 bis 4: Isolierte Nukleinsäuren;
Spalte 2: Nukleinsäure aus
Vollblutlysat versetzt mit MS2 RNA (7 Tage), Spalte 3: Nukleinsäure: aus
Vollblutlysat versetzt mit MS2 RNA (0 Tage, Kontrolle), Spalte 4:
Nukleinsäure
aus Vollblutlysat (7 Tage), Spalte 5: Nukleinsäure aus Vollblutlysat (0 Tage,
Kontrolle). Die oberen Banden zeigen chromosomale DNA (bei allen
4 Proben deutlich erkennbar), die unteren Banden in den Spalten
2 und 3 zeigen die zugesetzte und isolierte MS2 RNA.
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Beispiel 1:
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Blutentnahmesystem
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Das
Blutentnahmesystem kann in einer bevorzugten Ausführungsform
folgendermaßen
zusammengesetzt sein (s. 1): Ein Röhrchen wird mit einem definierten
Volumen der Nukleinsäure-stabilisierenden Lösung gefüllt, mit
einer Nukleinsäure-bindenden
Festphase und mit einem definierten Vakuum versehen, dann mit einem
Septum verschlossen. Das Septum ist so konstruiert, dass es mit
dem gängigen
Probenentnahmezubehör
(Kanüle
usw.) kompatibel ist. Im vorliegenden Beispiel wurden 2,2 ml Reagenz
vorgelegt und das Vakuum war so eingestellt, dass bei der Probennahme
exakt 1,3 ml Blut zufließen
konnten. Die im zufließenden
Blutstrom enthaltenen Nukleinsäuren
wurden unmittelbar in eine stabile Form überführt.
-
Allgemeine
Vorbemerkung zu den nachfolgenden Beispielen.
-
Wenn
nicht anders erwähnt
hatte bei allen nachfolgend beschriebenen Beispielen die Nukleinsäure-stabilisierende
Substanz (N-sS) folgende Zusammensetzung: 45 mM Tris, 5 M Guanidiniumthiocyanat,
0,8 (w/v) Dithiothreitol, 18% (w/v) Triton-X-100, pH 6,0.
-
In
allen beschriebenen Beispielen wurde die Nukleinsäure-stabilisierende
Substanz mit der Probe im Verhältnis
1 zu 0,59 gemischt (1 Volumen N-sS plus 0,59 Volumen Probenmaterial).
-
Für alle Beispiele
wurde Blut dadurch stabilisiert, dass es unmittelbar bei der Entnahme
in das mit N-sS versetzte Röhrchen
gegeben wurde.
-
Beispiel 2:
-
Stabilität von Nukleinsäure nach
Mischung von Probenmaterial und N-sS.
-
Isolierung von RNA und
DNA vom Probenlysat mit silikaderivatisierten Oberflächen.
-
Material und Methode:
-
Das
Probenmaterial für
die DNA- und RNA-Isolierung wurde unmittelbar nach der Entnahme,
nach Lagerung für
6 Tage bei 4°C
und nach Lagerung für
1 Monat bei –20°C verwendet.
-
Für die Isolierung
von RNA (2) wurde der HighPure RNA Isolation
Kit (Roche, Kat.-Nr.
1 828 665) verwendet. Die Beipackzettelvorschrift wurde folgendermaßen modifiziert:
Ein Volumen von 2,4 ml Probenlysat wurde in 4 Aliquots mit jeweils
600 μl auf
die Säule
aufgetragen, so dass insgesamt Probenmaterial aus 2,4 ml Lysat aufgetragen
wurden. Alle anderen Schritte wurden entsprechend dem Beipackzettel
ausgeführt.
Die RNA wurde schließlich
mit 100 μl
Elutionspuffer eluiert.
-
Zur
Isolierung von DNA (3) wurde der QiaAmp Blood Kit
(Qiagen-Kat.-Nr. 29104) eingesetzt. Die im Beipackzettel beschriebene
Standardprozedur wurde in verschiedenen Punkten modifiziert: 400 μl Probenvolumen
wurden direkt auf die Säule
gegeben, wobei das im Kit enthaltene Bindereagenz nicht eingesetzt
wurde. 25 μl
Proteinase-K-Stocklösung
wurden zugefügt
und die Probe 10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde
die Säule
in ein Sammelgefäß gestellt
und wie im Beipackzettel beschrieben zentrifugiert. Alle weiteren
Schritte wurden, bis auf die Verwendung von Ethanol, wie im Beipackzettel
beschrieben durchgeführt. Das
Elutionsvolumen war 200 μl.
-
Beispiel 3
-
Bedeutung von reduzierenden
Reagenzien (z.B. DTT) in der Stabilisierungslösung für die Langzeitstabilisierung
von RNA
-
Material und Methode:
-
Verwendete Stabilisierungslösung:
-
4.0
M GTC; 13,5% Triton X100; 45 mM Tris/HCl; mit 120 mM bzw. ohne DTT
700 μl Serum
wurden mit 700 μl
Stabilisierungslösung
gemischt. Nach 2 min Inkubation wurden 20 μl MS2-RNA (0.8 μg/μl von Roche Diagnostics)
zugegeben. Die Proben wurden für
180 min bei 40°C
inkubiert und anschließend
in Aliquots a 400 μl
mit dem High Pure total RNA Kit von Roche entsprechend Experiment
1 aufgearbeitet. Die Proben wurden in 50 μl eluiert und bei –20°C eingefroren.
Die Analytik erfolgte mittels Agarosegel (siehe 4).
-
Ergebnis:
Ohne den Zusatz von reduzierenden Reagenzien zur Stabilisierungslösung kann
keine Langzeitstabilisierung von RNA erreicht werden.
-
Beispiel 4
-
Stabilität von MS2-RNA
in Serum/Stabilisierungslösung:
Abhängigkeit
von der GTC Konzentration
-
Material und Methode
-
- Verwendete Stabilisierungslösungen: 3–5 M GTC; 13.5% Triton X100;
50 mM DTT; 42 mM Tris/HCl;
- pH der Lösungen:
ca. 5,0;
- pH der Lösungen
nach Serumzugabe: ca. 6.7.
-
2,0
ml Serum wurden mit 2.5 ml der jeweiligen Stabilisierungslösungen gemischt.
Nach einer Inkubationszeit von 2–5 min wurden 90 μl MS2-RNA
(0.8 μg/μl von Roche)
zugegeben und bei 40°C
inkubiert. In regelmäßigen Abständen wurden
400 μl Probe
entnommen und mit dem High Pure total RNA Kit von Roche entsprechend
Experiment 1 aufgearbeitet. Die Proben wurden in 50 μl eluiert
und bei –20°C eingefroren.
Für die Analyse
der RNA-Integrität
wurden 20 μl
des Eluates auf ein 1,5%iges Agarosegel aufgetragen (
5).
Die RT-PCR-Analytik erfolgte mittels AMV-RT und PCR. Jeweils 10 μl der Eluate
wurden mittels AMV-RT (Roche) reverse transkribiert und anschließend mittels
quantitativer PCR auf dem Lightcycler analysiert.
| Ansatz
für RT:
(42°C für 1 h) | |
| 4.0 μl | AMV-RT-Puffer |
| 2.0 μl | dNTP's (Endkonzentration
10 mM) |
| 0.5 μl | RNaseinhibitor
(Roche, 20 units) |
| 1.0 μl | Primer
2827 (Endkonzentration 1 μM) |
| 1.9 μl | DMPC-Wasser |
| 0.6 μl | AMV-RT
(Roche, 15 units) |
| 10 μl | Template-RNA |
| 20 μl | |
-
Die
PCR wurde auf dem Lightcycler bei einer Annealingtemperatur von
61°C unter
Verwendung von SYBR-Green als Detektionssystem durchgeführt. Alle
Proben mit einem Treshold-Cycle größer 20 werden als negativ betrachtet,
da das detektierte Signal ausschießlich auf die Bildung von Primerdimeren
zurückzuführen ist.
Dies kann durch die Analyse der Schmelzkurven am Lightcycler (Roche)
eindeutig bewiesen werden. Das RT-Produkt wurde 1:50 mit bidest.
Wasser verdünnt
und 1 μl
davon für
eine 10 μl-PCR
gemäß folgendem Schema
eingesetzt:
| Ansatz
für PCR: | |
| 1.6 μl | MgCl2 (Stammlsg. 25 mM) |
| 5.9 μl | DMPC-Wasser |
| 0.25 μl | Primer
2827 (Stammlsg. 20 mM) |
| 0.25 μl | Primer
2335 (Stammlsg. 20 mM) |
| 1.0 μl | SYBR-Green-Mastermix
(Roche) |
| 1.0 μl | RT-Ansatz |
| 10 μl | |
-
Das
Amplifikat der PCR wurde vollständig
auf ein 2%iges Agarosegel aufgetragen (siehe 6).
-
Ergebnis:
-
5 zeigt
die eluierte MS2-RNA nach 3 Tagen Inkubation bei 40°C detektiert
im Agarosegel. Obwohl nach 8 Tagen bei 40°C noch alle RNA-Proben amplifiziert
und eindeutig nachgewiesen werden können (6), sind
bereits nach 3 Tagen deutliche Unterschiede der RNA-Integrität in Abhängigkeit
vom GTC-Gehalt zu erkennen. Demnach ist ein Salzgehalt kleiner 2
M in der Serum/Stabilisierungslösung
für die
Integrität der
RNA von Vorteil, insbesondere höheren
Temperaturen, z.B. 40 Grad Celsius.
-
Nicht
gezeigt ist die Tatsache, dass MS2-RNA bereits 2 min nach Zusatz
zu Serum vollständig
von RNasen abgebaut wird und damit keine RNA mehr nachweisbar ist.
Mit diesem Beispiel konnte belegt werden, dass der Abbau der RNA
durch Zusatz von Stabilisierungslösung zum Serum deutlich verzögert werden
kann. Nach 8 Tagen bei 40°C
in Serum/Stabilisierungslösung
kann MS2-RNA mittels PCR ohne Probleme detektiert werden (Abb 6),
obwohl die RNA-Integrität
teilweise litt.
-
Beispiel 5
-
Stabilität von MS2-RNA
in Serum/Stabilisierungslösung:
Abhängigkeit
vom pH-Wert der mit Stabilisierungslösung versetzten Probe.
-
- Material
und Methode
| Verwendete
Lösung: | |
| 4 M
(5 M) | GTC |
| 14,4% | Triton
X 100 |
| 50
m M | DTT |
| 45
mM | Tris
HCl |
pH nach Serumzugabe zwischen 6,7 und 7,5.
-
2,5
ml Stabilisierungslösung
wurden mit 2,0 ml Serum gemischt. Nach Zugabe von 90 μl MS2 RNA (0,8 μg/ml, Roche)
wurden die Proben bei Raumtemperatur inkubiert. In regelmäßigen Abständen wurde
die RNA aus 500 μl
Probe mit dem Roche viral RNA Kit entsprechend Beispiel 4 aufgearbeitet
und in 50 μl
Elutionspuffer isoliert. 20 μl
des Eluates wurden mittels Agarosegel analysiert (siehe 7).
-
Ergebnis:
-
Der
pH der Serum/Stabilisierungslösung
und damit auch der pH und Pufferbereich der Stabilisierungslösung ist
für die
Langzeitstabilisierung von RNA entscheidend. Während bei einem pH Wert von
8,0 bereits nach 2 Tagen keine intakte RNA mehr nachgewiesen werden
konnte, ist in einem pH Bereich zwischen 6,6 und 7,0 noch nach 13
Tagen Inkubation bei Raumtemperatur intakte RNA nachweisbar. Neben
dem pH Wert ist jedoch auch eine optimal eingestellte GTC Konzentration
für die
Langzeitstabilisierung von RNA von Bedeutung (siehe Beispiel 4).
Das dargestellte Beispiel verdeutlicht, dass für eine Langzeitstabilisierung
von RNA eine GTC Endkonzentration in der stabilisierten Probe von
2,2 M GTC besser ist als 2,8 M.
-
Beispiel 6
-
Stabilität einer
Nukleinsäure
bindenden Oberfläche
in Gegenwart von Stabilisierungslösung gezeigt unter Verwendung
von Silika beschichteten Magnetpartikeln.
-
- Material
und Methode
| Verwendete
Lösung: | |
| 4,5
M | GTC |
| 15% | Triton-X-100 |
| 100
mM | DTT |
| 50
mM | MES |
-
Dabei
wurde die Lösung
und Blut im Verhältnis
1:1 eingesetzt.
-
Die
Silika beschichteten Magnetpartikel wurden dem mRNA Isolation Kit
for Blood/Bone Marrow (Roche Molecular Biochemicals) entnommen.
Die verwendete Menge Partikel pro ml betrug ca. 35 mg. Das Blutentnahmesystem,
bestehend aus dem Entnahmeröhrchen,
der Stabilisierungslösung
und den Magnetpartikeln, wurde 14 Tage bei Raumtemperatur gelagert.
Anschließend
wurde mit diesem System Vollblut entnommen. Als Kontrolle wurde
ein frisch hergestelltes Entnahmesystem (Röhrchen, Stabilisierungslösung, Magnetpartikel)
verwendet. Aus beiden Ansätzen
erfolgte die Isolierung der im Probenmaterial enthaltenen Nukleinsäuren. Die
Magnetpartikel wurden mit einem Magneten abgetrennt, der Überstand
wurde verworfen. Die Partikel wurden in 50% Ethanol, 10 mM Tris,
pH 7,0 resuspendiert und mehrmals mit derselben Lösung gewaschen.
Schließlich
wurden die Partikel in 10 mM Tris/HCl pH 7,0 auf 70°C erhitzt,
wobei sich die Nukleinsäure von
den Magnetpartikeln löst.
Die Partikel wurden magnetisch separiert und der Nukleinsäure enthaltende Überstand
im Standard Agarosegel analysiert.
-
-
Tabelle 1:
-
Nach
14 Tagen Lagerung hat sich die Nukleinsäure bindende Eigenschaft der
Festphase nicht verändert.
Die Probe, als auch die Kontrolle zeigen dieselben Nukleinsäure bindenden
Eigenschaften.
-
Beispiel 7
-
Stabilität, Isolierung
und Nachweis von DNA und RNA, nach 7 Tagen Lagerung bei gleichzeitiger
Bindung an Silika beschichtete Magnetpartikel.
-
- Material
und Methode
| Verwendete
Suspension: | |
| 4,5
M | GTC |
| 15% | Triton-X-100 |
| 100
mM | DTT |
| 50
mM | MES |
| 35
mg/ml | Partikel |
-
4
Blutentnahmesysteme (Röhrchen)
enthaltend 1,0 ml der oben beschriebenen Suspension wurde mit 1
ml Vollblut versetzt. Zwei der Röhrchen
(Vollblutlysat) wurde zusätzlich
mit 25 μg
MS2 RNA versetzt. Je ein Röhrchen
der beiden Ansätze
(Vollblutlysat +/– MS2
RNA) wurde unmittelbar danach zur Nukleinsäureisolierung eingesetzt (Durchführung siehe
Beispiel 6). Die beiden anderen Röhrchen wurden 7 Tage bei Raumtemperatur
gelagert: Nach diesem Zeitraum wurde die Nukleinsäureisolierung
durchgeführt.
Das Elutionsvolumen betrug 200 μl
pro 200 μl
Vollblutvolumen. Die Nukleinsäuren
wurden im Standard Agarosegel analysiert.
-
Ergebnis:
-
Nach
7 Tagen Lagerung im Probennahmesystem (Lösung, Festphase) ist die Stabilität von chromosomaler
DNA und MS2-RNA nachweislich gegeben (8).
-
Beispiel 8
-
Extraktion
von mRNA sowie zellulärer
und viraler DNA durch Bindung an magnetische Polymer-Beads auf der Basis
von Polyvinylalkohol und an magnetische Silica-Beads
-
Probenmaterial:
-
- 1,2 ml stabilisiertes Blut (= 400 μl Blut + 800 μl NsS)
(NsS
= Nucleic Acid stabilization Solution)
-
Spiken mit Viren:
-
- +6 × 106 copies/ml Cytomegaloviren (CMV)
-
Nukleinsäure-Extr.:
-
- +800 μl
Bindelösung
(PrIS = Pre-Incubation Solution)
-
Magnetic-Beads:
-
- a) 120 μl
Beadsuspension aus MagNA Pure LC total Nucleic Acid Isolation Kit
(Kat.Nr. 3 038 505, Roche Molecular Biochemicals)
- b) 30 μl
Beadsuspension von Carboxyl-Polyvinyl-Alkohol Magnetic Beads (M-PVA
C12 Kat.Nr. 01-01.204) der Firma Chemagen Biopolymer-Technologie
AG, Baesweiler, GER
-
Nukleinsäure Extrations-Protokoll
für a)
und b):
-
- • 900 μl NsS-Blut-PrIS
+ a) 120 μl
bzw. + b) 30 μl
Beadssuspension mischen
- • ca.
5 min Inkubation bei RT
- • Magnetseparation
- • Überstand
vollständig
entfernen
- • Proteinase
K-Schritt:
2 mg PK/ml in 10 mM TRIS-HCl pH 6,5 mit 0,1% Tween
20 und 0,5% Triton × 100
500 μl PK-Puffer
pro Probe, mischen, 10 min RT-Inkubation,
- • Magnetseparation, Überstand
entfernen
- • 1.
Waschschritt:
500 μl
Waschpuffer I (GTC-haltig) aus dem High Pure viral Nucleic Acid-Isolation
Kit (Kat.Nr. 1 858 874 Roche Molecular Biochemicals) pro Probe zugeben
und mischen für
10 sec. manuell oder mit Vortex
- • Magnetseparation, Überstand
vollständig
abnehmen
- • 2.
Waschschritt:
gleichen Waschritt mit 500 μl Waschpuffer I wiederholen
- • 3.
Waschschritt:
900 μl
Waschpuffer II (Ethanol haltig) aus gleichem Kit wie oben pro Probe
zugeben und mischen
- • Magnetseparation
und Überstand
vollständig
abnehmen
- • Elution
in 100 μl
Elutionspuffer aus gleichem Kit wie oben bei 80°C für 10 min inkubieren und Eluat
nach Magnetseparation vollständig
abnehmen und bis zur Analyse bei –70°C einfrieren
-
Nukleinsäure Analytik:
-
- • Agarosegel
Analyse:
20 μl
des Eluates werden auf einem 1% nativen Agarosegel analysiert
Ergebnis
für a)
und b):
– genomische
DNA ist sichtbar
a) 100%
b) 80%
– rRNA ist sichtbar
a)
100% entspricht ca. 10–20%
b)
200% der gesamten zellulären
RNA
- • PCR
für genomische
DNA am Beispiel des G6P-DH Gens:
Ergebnis:
a) 100%
b)
75%
- • PCR
für CMV:
Ergebnis:
a)
100% (entspricht 4 × 106 copies/ml = ca. 70% der gespikten CMV-Menge)
b)
75% entspricht 3 × 106 copies/ml = 50% der gespikten CMV-Menge
- • RT-PCR
für G6P-DH
mRNA:
Ergebnis:
a) nicht nachweisbar, vermutlich weil
der GTC-Gehalt zur Bindung von mRNA
zu niedrig war, durch die
Verdünnung
mit dem Proteinase K Puffer
b) 50% im Vergleich zu Standardexperimenten
mit Silica-Magnetic
Beads entsprechend dem MagNA Pure total NA Isolation Kit von Roche
Molecular Biochemicals, wie sie in diesem Experiment verwendet wurden.
-
Für die Beurteilung
der Ergebnisse in den einzelnen Experimenten wurde jeweils die nachgewiesene Nukleinsäuremenge
mit den Magnetic Beads mit Silica-Oberfläche von Roche Molecular Biochemicals
(= a)) als Standard und demzufolge also 100% gesetzt und die mit
b) isolierte Menge in Relation dazu gesetzt.
-
PriS-Zusammensetzung (Bindelösung) im
o.g. Experiment:
-
- 3,5 M GTC; 10% Triton X 100; 350 mM Tris/HCl; pH 8.0;
-
NsS-Zusammensetzung (Stabilisierungslösung) im
o.g. Experiment:
-
- 3,5 M GTC; 12,5% Triton X 100; 60 mM Tris/HCl; 60 mM DTT;
-
Beispiel 9
-
Nachweis der Bindeeffizienz
von Nucleinsäure
an Silica-Oberflächen
durch Zugabe der Bindelösung „PrIS" zur NAST-Blut Mischung
-
PrIS-Zusammensetzung:
-
- 3,5 M GTC; 10% Triton X 100; 350 mM Tris/HCl; pH 8.0;
-
NAST-Zusammensetzung:
-
- 3,5 M GTC; 12,5% Triton X 100; 60 mM Tris/HCl; 60 mM DTT;
-
Probenmaterial:
-
- 580 μl
stabilisiertes Blut (200 μl
Blut + 380 μl
NAST = Verhältnis
von 1 : 1,9)
-
Spiken mit CMV:
-
- 6 × 106 copies/ml Cytomegalovirus (CMV)
-
Nukleinsäure Extraktion:
-
- a) Zugabe von 580 μl PrIS (= Verhältnis von
1 : 1)
- b) ohne Zugabe von PrIS
-
Extraktionsprotokoll:
-
- Es wurden alle notwendigen Reagenzien, wie
Magnetic Beads mit Silica Oberfläche,
Waschpuffer und Elutionspuffer aus dem MagNA Pure total NA Isolation
Kit® von
Roche Molecular Biochemicals (Kat.Nr. 3 038 505) verwendet. Die
Proteinase K ist ebenfalls von Roche Molecular Biochemicals mit
der Kat.Nr. 1 964 364.
| a)
+40 μl
+300 μl | b)
+40 μl Proteinase
K (20 mg/ml)
+300 μl
Magnetic Beadsuspension |
- – mischen
und für
10 min bei RT inkubieren
- – Magnetseparation
und Überstand
entfernen
- – 1.
Waschen mit 850 μl
Waschpuffer I
- – Magnetseparation
und Überstand
entfernen
- – 2.
Waschen mit 450 μl
Waschpuffer II
- – Magnetseparation
und Überstand
entfernen
- – 3.
Waschen mit 450 μl
Waschpuffer III
- – Magnetseparation
und Überstand
vollständig
entfernen
- – Elution
mit 200 μl
Elutionspuffer bei 70°C
mit 10 min Inkubation
- – Magnetseparation
und Überstand
= Eluat sorgfältig
abnehmen und bei
- –70°C bis zur
Analyse einfrieren.
-
Analytik der extrahierten
Nukleinsäuren:
-
- – Agarosegel
Analyse:
20 μl
der Eluate wurden auf einem nativen 1% Agarosegel aufgetrennt
chromosomalen
DNA:
a) 100%
b) ca. 14%
rRNA:
a) 100%
b)
ca 20%
- – Quantitative
Bestimmung von CMV mit dem Light Cycler®, Roche
Molecular Biochemicals
a) 4,3 × 106 copies/ml
= 72% Extraktionseffizienz
b) 1,0 × 106 copies/ml
= 17% Extraktionseffizienz
- – Quantitative
Bestimmung der genomischen DNA mit dem G6P-DH Gen:
a) 100%
b)
21%
- – Quantitative
mRNA-Bestimmung anhand der G6P-DH mRNA:
a) 100%
b) 7%
-
Alle
Ergebnisse der durchgeführten
Analysen zeigen, daß die
Zugabe der Bindelösung „PrIS" für eine optimale
Extraktion der Nukleinsäuren
durch ihre optimale Bindung an die Silica-Festphase notwendig ist.
-
Beispiel 10
-
Nukleinsäure Extraktion
aus NAST-Blut mit PrIS an Silica-Oberflächen mit dem Hiph Pure Viral
Nucleic Acid Kit® von ROCHE Molecular Biochemicals
Cat. No. 1 858 874
-
Blutentnahme:
-
Die
Blutentnahme erfolgt in einem NAST Vacuette® Röhrchen der
Firma Greiner BIO-ONE. Dieses Vakuum-Blutentnahmeröhrchen hat
ein Gesamtvolumen von 5 ml und enthält 2,3 ml NsS (Nucleic Acid
Stabilization) Lösung.
Das Vakuum ist so eingestellt, dass bei der Blutentnahme 1,2–1,25 ml
Blut in das Röhrchen
strömen
und sich mit der Lösung
vermischen. Damit liegen 3,5 ml NAS-Blut Mischung im Röhrchen vor,
wobei das Blut 1 : 2,8 verdünnt
wird.
NsS = Nukleinsäure
stabilisierende Lösung:
3 M GTC; 12,5% Triton X 100; 30 mM MES; 120 mM DDT
PrIS = Bindelösung: 4
M GTC; 12,5% Triton X 100; 250 mM Tris/HCl; pH 8.0;
200 μl Blut entsprechen
560 μl der
Blut-NAS-Mischung.
-
Spiken:
-
Jedes
Röhrchen
wurde mit einem positiven HCV- und CMV-Plasma gespikt, sodass die
folgenden Konzentrationen vorliegen:
HCV: 5,7 × 105 IU/ml Blut-NAS-Mischung
CMV: 2,0 × 106 copies/ml Blut-NAS-Mischung
-
Lagerung:
-
Die
Blutentnahme-Röhrchen
werden 1 Tag bei 20–24°C gelagert
-
Nukleinsäureextraktion:
-
- 56.0 μl
Blut-NsS-Mischung (= 200 μl
Blut) mit 350 μl
PRIS mischen und zum Lösen
der Kristalle bis zu 15 min. bei RT mit mehrmaligem Mischen (Vortex)
inkubieren.
- 115 μl
Isopropanol zufügen,
mischen, in 2 Portionen auf das High Pure® Säulchen auftragen,
welches jeweils bei 6000–7000
U/min 1 min. zentrifugiert wird.
- 450 μl
Removal Waschpuffer® (ROCHE Kit-Komp.) auftragen
und mit 6000–7000
U/min 1 min. zentrifugieren 2 × mit
450 μl Waschpuffer® (ROCHE
Kit-Komponente) die Säule
waschen, jeweils mit 6000–7000
rpm zentrifugieren, 100 μl
70°C heißen Elutionspuffer® (Kit-Komp.=
Wasser) zur Elution auftragen und bei 10 000 U/min 2 min. zentrifugieren
- Nukleinsäuren
aus 200 μl
Blut liegen in 100 μl
Eluat vor und werden bis zur Analytik bei –70°C in 10 μl Aliquots gelagert.
-
Analytik:
-
Alle
Schritte der Analytik wurden im Vergleich mit einer Standard-Nukleinsäure-Extraktion mit dem PAXgene
Blood RNA Kit® der
Firma Preanalytix GmbH, Schweiz durchgeführt. Dieses Kit arbeitet ebenfalls aus
Vollblut und beinhaltet ein anderes System der Nukleinsäure-Stabilisierung
während
der Blutentnahme.
-
1. Qualitative DNS/RNA
Analyse mit der Agarose-Gel-Analytik:
-
- NAST-PRIS: Die extrahierten Nukleinsäuren bestehen zu 90–95% aus
zellulärer
RNA (ribosomaler RNA, mRNA) während
die chromosomale DNS als dünne
Bande im Bereich von ca. 5–10%
liegt.
- PAXgene: Die extrahierten Nukleinsäuren bestehen zu 20–70% aus
zellulärer
RNA = rRNA und zu 30–80% aus
chromosomaler DNA.
-
2. Quantitative DNS/RNA
Bestimmung durch photometrische Messung (A 260)
-
- NsS-PRIS: Die 100 μl
Eluat (= 0,2 ml Blut) enthalten 2 μg RNA/DNS entsprechend 6,25%
der gesamten zellulären
Nukleinsäuren.
Bei einer Aufteilung DNA : RNA laut Agarosegel von etwa 1 : 10 entspricht
dies ca. 0,2 μg
DNA und 1,8 μg
RNA
Somit entspricht dies einer Ausbeute von ca 1% der genomischen
DNA und ca. 90% der gesamten zellulären RNA = rRNA.
- PAXgene: Die 80 μl
Eluat (= 2,5 ml Blut) enthalten 8,7 μg RNA/DNS, was 0,7 μg aus 0,2
ml Blut entspricht, also einer Ausbeute von 2% der Gesamt-Nukleinsäuren des
Blutes. Entsprechend der von Experiment zu Experiment stark schwankenden
Aufteilung von DNA : RNA = 30–80%
: 70–20%
entspricht dies einer Ausbeute von 0,7–1,8% der genomischen DNA und
von nur 7–24%
der gesamten zellulären
RNA = inclusive rRNA.
d.h. mit dem erfindungsgemäßen NAST-PRIS
werden ca. 3 mal mehr Gesamt-Nukleinsäuren und 4–13 mal mehr gesamt zelluläre RNA,
die überwiegend
aus rRNA besteht, isoliert.
-
3. Quantitative HCV-Bestimmung
mit dem Light-Cycler der Firma Roche Diagnostics:
-
- NsS-PRIS: Es wurde eine HCV Konzentrationen von ca. 4 × 105 IU/ml gemessen. Bezogen auf die gespikte Konzentration
von 5,7 × 105 IU/ml entspricht dies einer Wiederfindung
von 70%.
- PAXgene: Es wurden HCV Konzentrationen von 0,6–1,0 × 104 IU/ml gemessen entsprechend einer Wiederfindung
von 1–1,75%
der gespikten 5,7 × 105 HCV IU/ml.
Damit wird mit dem PAXgene
System eine 40–70
fach schlechtere Ausbeute für
HCV im Vergleich zu dem NAST-PRIS
System erreicht.
-
4. Quantitative
CMV-Bestimmung mit dem Light-Cycler der Firma Roche Diagnostics
-
- NAST-PRIS: Es wurde eine CMV-Konzentration von ca. 8 × 105 copies/ml gemessen, was 40% Wiederfindung der
gespikten Konzentration von 2 × 106 copies/ml entspricht.
- Paxgene: Es wurden CMV-Konzentrationen von 0,8–1,6 × 105 copies/ml gemessen, was einer Wiederfindung von
4–8% der
gespikten 2 × 106 CMV copies/ml darstellt.
Somit werden
mit dem PAXgene System 5–10
fach niedrigere Ausbeuten im Vergleich zu dem NAST-PRIS System erreicht.
-
5. Quantitative mRNA (G6P-DH)
Bestimmung mit dem Light-Cycler der Firma Roche Diagnostics
-
- NAST-PRIS: Es wurden 8–12
ng G6P-DH mRNA in 200 μl
Blut gemessen.
- PAXgene: Es wurden 0,1–0,25
ng G6P-DH mRNA in 200 μl
Blut gemessen.
Mit dem erfindungsgemäßen NAST-PRIS System wird 50–100 mal
mehr mRNA isoliert
-
6. Quantitative Bestimmung
des G6P-DH Gens mit dem Light-Cycler der Firma Roche Diagnostics
-
- NAST-PRIS: Es wurden 190–430 ng G6P-DH Gene in 200 μl Blut gemessen.
- PAXgene: Es wurden 544–1200
ng G6P-DH Gene in 200 μl
Blut gemessen.
-
Die
oben gezeigten Versuche zeigen damit eindeutig, daß das erfindungsgemäße System
zu einer deutlichen Steigerung der Ausbeute an niedermolekularen
Nukleinsäuren,
insbesondere von RNA (wie mRNA und viraler RNA und DNA (z.B. HCV,
CMV)) führt.
Die Begriffe NAST und NsS wurden synonym verwendet.
