DE69031237T2

DE69031237T2 - Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69031237T2
Application number: DE69031237T
Authority: DE
Inventors: Henriette Maria Alei Adriaanse; Willem Rene Boom; Tim Kievits; Peter Franklin Lens
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Biomerieux BV
Priority date: 1989-03-23
Filing date: 1990-03-22
Publication date: 1998-01-02
Anticipated expiration: 2010-03-23
Also published as: DE69031237T3; JP2001078790A; CA2012777A1; DE69031237D1; ATE156830T1; JP2680462B2; CA2271603A1; DE389063T1; EP0389063B2; GR960300019T1; EP0389063A3; ES2085245T3; JPH1072485A; KR0148693B1; ZA902190B; DK0389063T3; ES2085245T1; GR3025351T3; NL8900725A; KR900014594A

Description

Die Erfindung bezieht sich sowohl auf ein Verfahren und auf eine Kombination von Mitteln für die Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäure enthaltenden Ausgangsmaterial als auch auf ein Testset zum Vermehren der mit dem genannten Verfahren erhaltenen Nukleinsäure. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren und ein Testset für die Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäure enthaltendem biologischen Material, wie zum Beispiel Gesamtblut, Blutserum, Buffy Coat (die Crusta phlogistica oder die Leukozyten-Fraktion des Bluts), Urin, Faeces, cerebrospinalliquor, Sperma, Speichel, Gewebe, Zellkulturen und ähnlichem. Die Nukleinsäuren, wie aus oben genanntem biologischen Material isoliert, kann auch die endogene Nukleinsäure des Organismus umfassen, von dem die Probe stammt, sowie jegliche Fremd-Nukleinsäuren (viral, fungal, bakteriell oder parasitisch).
Bekannte Verfahren der Isolierung von Nukleinsäure (NA) aus komplexen Ausgangsmaterialien wie Gesamtblut, Blutserum, Urin oder Faeces umfassen im allgemeinen die Lyse des biologischen Materials durch ein Detergens in Anwesenheit von Proteine abbauenden Enzymen, gefolgt von verschiedenen Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln, z.B. Phenol und/oder Chloroform, Ethanolfällung und Dialyse der Nukleinsäuren.
In Marko M.A. et al., Analytical Biochemistry 121, 382-387, 1982 ist ein Verfahren beschrieben, worin Plasmid-DNA verschiedenen Extraktionen und Detergens-Behandlungen unterzogen wird, um die Zellen zu lysieren aus denen die Plasmid-Nukleinsäure erhalten wird und um Zellbestandteile und auch anderes Nukleinsäurematerial zu entfernen. Die reine Plasmid-DNA wird in einem abschliessenden Schritt an Glaspuder in Anwesenheit einer chaotropen Substanz gebunden.
Diese bekannten Verfahren z.B. der Isolierung von doppelsträngiger) DNA sind sehr arbeits- und zeitaufwendig. Die verhältnismässig grosse Zahl von Schritten, die erforderlich, um sind NA aus solchen Ausgangsmaterialien zu isolieren, vergrössern das Risiko der Übertragung der NA von Probe zu Probe bei der gleichzeitigen Bearbeitung verschiedener klinischer Proben. Wenn die NA für einen anschliessenden Nachweis auf Anwesenheit von NA, z.B. eines Krankheitserregers (z.B. ein Virus oder ein Bakterium) mit dem Nukleinsäureamplifikationsverfahren, zum Beispiel der äusserst sensitiven Polymerase-Kettenreaktion (PCR, Saiki et al., Science 230, 1985, 1350) isoliert werden soll, ist das erhöhte Risiko einer solchen Übertragung von NA zwischen verschiedenen Proben, wenn falsch positive Ergebnisse verursacht werden, ein grosser Nachteil.
Ein solches für Kontaminationen empfindliches Beispiel ist das in Analytical Biochemistry 162, 1987, 156 beschriebene Verfahren für die Isolierung von Gesamt-RNA aus Geweben und Zellkulturen. Gemäss diesem Verfahren wird die RNA in einer einzigen Extraktion mit einer Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroformmischung dem biologischen Ausgangsmaterial entzogen. Nach der Phasentrennung kann die RNA in einem brauchbaren Zustand innerhalb von 4 Stunden durch weiteres Verarbeiten der wässrigen Phase gewonnen werden.
In Analytical Biochemistry 162, 1987, 463 ist ein Verfahren für die Isolierung von DNA aus Geweben und Zelllinienn beschrieben, bei dem die Zellen in einem Guanidinium-Salzsäure enthaltenden Puffer dispergiert und in Ethanol gefällt werden. Mit diesem für Kontaminationen bekannten Verfahren kann ebenfalls ein brauchbares NA-Produkt innerhalb weniger Stunden nach Bearbeitung der abgetrennten DNA isoliert werden.
Diese bekannten Verfahren können jedoch nicht erfolgreich bei komplexen Ausgangsmaterialien, z.B. Gesamtblut und Blutserum, angewendet werden.
Ein Gegenstand der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, dass die Nachteile der bekannten Verfahren beseitigt.
Insbesondere ist es ein Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem Nukleinsäuren (d.h. DNA und/oder RNA) sofort (ohne Vorbehandlungen) aus dem komplexen Ausgangsmaterial isoliert werden kann, auf einer beispiellos schnellen, einfachen und wiederholbaren Art und Weise in solch unbeschädigten Zuständen und hoher Reinheit, dass es als Reagenz in molekularbiologischen Reaktionen verwendet werden kann.
Weiterhin ist ein Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das sich von den bekannten Verfahren durch ein niedriges Kontaminationsrisiko im Vergleich zu anderen Proben und Personen unterscheidet, d.h. es ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung verschiedener klinischer Proben mit einem minimalen Risiko der Übertragung von NA zwischen den verschiedenen Proben und bedeutet ebenfalls das niedrigst mögliche Risiko der Ansteckung von Personen durch Viren oder Bakterien, die in den zu bearbeitenden Proben vorhanden sein können.
Diese Gegenstände werden gemäss der Erfindung durch ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäure aus Nukleinsäure haltigem Ausgangsmaterial verwirklicht, gekennzeichnet durch Mischen des Ausgangsmaterials mit einer chaotropen Substanz und einer Nukleinsäure bindenden festen Phase, Trennen der festen Phase mit der daran gebundenen Nukleinsäure von der Flüssigkeit, wonach die so erhaltenen feste Phase-Nukleinsäure-Komplexe gewaschen werden und falls erforderlich, die Nukleinsäure von den genannten Komplexen eluiert wird.
Obwohl die Erfindung im weitesten Sinne auf jeglichen Nukleinsäure enthaltendes Ausgangsmaterial anwendbar ist, einschliesslich Nahrungsmittel und ähnliche Produkte, Impfstoffe und Milch, die mit einem Virus oder Bakterium infiziert sind, ist die Erfindung insbesondere auf ein Verfahren anwendbar, in dem das verwendete Ausgangsmaterial Nukleinsäure haltiges biologisches Material wie zum Beispiel Gesamtblut, Blutserum, Buffy Coat, Urin faeces, Cereborspinalflüssigkeit, Sperma, Speichel, Gewebe und Zellkulturen (wie zum Beispiel Säugetierzellkulturen und Bakterienkulturen) ist. Einige Arten von Nukleinsäure haltigen biologischen Materialien, wie pflanzliches Material, einige gram-positive Bakterien und einige Hefen und Pilze können jedoch nicht sofort als Startmaterial für das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden, da sie sich aufgrund ihrer speziellen Zellwandstruktur nicht in einer chaotropen Substanz lysieren lassen. Solches Ausgangsmaterial erfordert daher eine Vorbehandlung, die die Zellen zugänglich macht, z.B. eine vorhergehende Zelllyse, wonach das daraus resultierende Lysat dem der Erfindung gemässen Verfahren unterzogen werden kann.
Mit Nukleinsäure (NA) ist sowohl RNA als auch DNA in jeder möglichen Konfiguration gemeint, d.h. in Form von doppelsträngiger (ds) Nukleinsäure oder in Form von einzelsträngiger (ss) Nukleinsäure oder als eine Kombination (teilweise ds oder ss).
Die Verwendung einer Nukleinsäure bindenden festen Phase, genauer Silicapartikel, ist gemäss der Erfindung wesentlich, die fähig sind, DNA in Anwesenheit einer chaotropen Substanz zu binden. Mit Silica sind SiO&sub2;-Kristalle und andere Formen von Siliciumoxiden gemeint, wie Diatomeenskelette, die aus SiO&sub2; aufgebaut sind, amorphe Siliciumoxide und Glasspulver. Auch Alkylsilica, Aluminiumsilicate (Zeolit) oder mit -NH&sub2; aktiviertes Silica eignen sich als Nukleinsäure bindende, feste Phase gemäss der Erfindung.
Aus PNAS 76, 1979, 615 ist für den Fall der Verwendung von Silicapartikeln bekannt, dass dsDNA aus einer hochkonzentrierten Lösung von chaotropem NaI-Salz (Natriumjodid) von der Agarose freigesetzt und an Glas gebunden werden kann. Diese Publikation beschreibt zwei Verfahren zur Isolierung von DNA aus einem Agarose-Gel, die beide in einem ersten Schritt eine NaI-Lösung verwenden, um die Agarose zu lösen. In dem einen Verfahren wird die DNA in einem zweiten Schritt mit Aceton gefällt, während gemäss dem anderen Verfahren die DNA in einem zweiten Schritt an Glaspartikel gebunden und dann in einen wässrigen Puffer eluiert wird. Dieses Verfahren ist jedoch für komplexere Ausgangmaterialien, wie Körperflüssigkeiten oder biologische Ausgangsmaterialien, nicht zu gebrauchen. Dieser Artikel offenbart darüberhinaus auch kein der Erfindung gemässes Ein-Schritt-Verfahren.
Gemäss der Erfindung ist es empfehlenswert Silikapartikel mit einer Grösse zu verwenden, die sich im wesentlichen im Bereich zwischen 0,05 und 500 µm bewegt. Der Ausdruck "im wesentlichen" bedeutet, dass 80 % oder mehr, vorzugsweise mehr als 90 % der Silicapartikel innerhalb der definierten Partikelgrösse sind. Um eine einfache Verarbeitung der gebundenen Nukleinsäure zu gewähren, wird eine Grösse der verwendeten Partikel von im wesentlichen zwischen 0,1 und 200 µm bevorzugt, jedoch ist ein Verfahren, in dem die verwendeten Silicapartikel eine Grösse von im wesentlichen zwischen 1 und 200 µm haben, am meisten bevozugt. Die NA- Bindungskapazität der Silicapartikel ist grösser je kleiner die Partikel sind, jedoch wird insbesondere in dem Fall von NA-reichem Ausgangsmaterial und im Fall von relativ langen NA-Molekülen der Verwendung von extremem kleinen Silikapartikeln darin resultieren, dass die gebildeten NA-Silicakomplexe nicht mehr ausreichend diespergiert werden können. Das bedeutet, dass die gebundene NA nicht mehr nicht mehr in reiner Form aus den Komplexen zurückgewonnen werden kann. Dieses Problem tritt gelegentlich auf, wenn menschliches Blut als Ausgangsmaterial verwendet wird und unfraktioniertes Siliciumdioxid mit Partikelgrössen im bereich von 0,2 bis 10 µm verwendet wird. Die Bildung von Aggregaten, die sich nicht mehr dispergieren lassen, kann durch Verwendung von fraktioniertem Silica, dessen Partikelgrösse 1-10 µm beträgt, vermieden werden. Wenn ein Ausgangsmaterial verwendet wird, dass reich an Zellen ist, wie zum Beispiel Bakterienkulturen, wurde jedoch festgestellt, dass die Verwendung einer solchen groben Silicafraktion nicht ausreicht, um die Bildung der schwer zu dispergierenden Partikel zu verhindern und optimale Ergebnisse werden erhalten, wenn ein noch rauheres Silica wie Diatomeenerde verwendet wird, die eine Partikelgrösse im Bereich von 2 bis 200 µm hat.
Gemäss der Erfindung ist es wesentlich zusätzlich zu der oben erwähnten Nukleinsäure bindenden festen Phase wie Silicapartikel eine chaotrope Substanz zu verwenden. Chaotrope Substanz bedeutet eine Substanz, die fähig ist die Sekundär-, Tertiär und oder Quaternärstruktur eines Proteins und Nukleinsäuren zu ändern und zumindest die Primärstruktur intakt zu lassen.
Beispiele dafür sind Guanidinium(iso)thiocyanat und Guanidinsalzsäure. Auch Natriumjodid, Kalziumjodid, Natrium(iso)thiocyanat, Harnstoff oder Kombinationen dieser Substanzen sind in Kombination mit Nukleinsäure bindenden festen Phasen zur Isolierung von NA aus Nukleinsäure haltigem Ausgangsmaterial sehr geeignet. Das gemäss der Erfindung verwendete chaotrope Guanidiniumsalz ist vorzugsweise Guanidiniumthiocyanat (GuSCN).
Das Verfahren gemäss der Erfindung wird normalerweise derart ausgeführt, dass das Ausgangsmaterial mit einer ausreichend grossen Menge einer chaotropen Substanz, wie zum Beispiel Guanidiniumsalz und zum Beispiel Silicapartikel gemischt wird, um im wesentlich die gesamte, in dem Ausgangsmaterial vorhandene Nukleinsäure freizusetzen und an die genannten Silicapartikel zu binden. Ein geeignetes Protokoll ist zum Beispiel die Zugabe einer Suspension aus Silicapartikeln zu einer gepufferten in einem Reaktionsgefäss vorhandenen GuSCN-Lösung, gefolgt von der Zugabe der Probe und gründlichem Mischen. Die Lyse der Zellen und der gegebenenfalls anwesenden Viren wird nun erfolgen und die freigewordenen NA wird beinah sofort an die Silicapartikel gebunden. Die entstandenen Silica-Nukleinsäurekomplexe können von der Flüssigkeit getrennt wereden, zum Beispiel durch schnelle Sedimentation (Zentrifugation) und Verwerfen des Überstands (z.B. durch Absaugen) und die Komplexe (z.B. in der Form eines Silica-Nukleinsäurepellets) werden dann (z.B. in Form eines Silica-Nukleinsäurepellets) gewaschen (dispergiert oder homogenisiert), z.B. mit einem ein chaotropes Guanidiumsalz enthaltenden Puffer unter Verwendung zum Beispiel eines Vortexmixers und nochmaligem Sedimentieren. Vorzugsweise werden die Silica-Nukleinsäure-Partikel mit Waschpuffer gewaschen und anschliessend nochmals mit einer Wasser-Alkohol-Lösung (vorzugsweise ungefähr 70 % Alkohol, um Ertragsverluste zu begrenzen) und mit Aceton gewaschen, anschliessend getrocknet, um das Aceton zu entfernen (z.B. durch Erhitzen). Die in den gewaschenen und getrockneten Silica-Nukleinsäure-Komplexen vorhandene NA wird mit einem wässrigen Elutionspuffer eluiert. Die Auswahl des Elutionspuffer wird durch die beabsichtigte Verwendung der NA mitbestimmt. Beispiele geeigneter Elutionspuffer sind TE-Puffer, Aqua bidest und PCR-Puffer (siehe den Teil "Material und Methoden"). Alle diese Schritte werden vorzugsweise in einem einzigen Reaktionsgefäss (z.B. einem 1,5 ml Eppendorfgefäss aus Polypropylen) durchgeführt und die gereinigete NA in einem verhältnismässig kleinen Volumen, z. B. weniger als 100 µl, zurückgewonnen. Die auf diese Weise isolierte NA is frei von Nukleinsäure abbauenden Enzymen und ist von so hoher Reinheit, dass sie sofort als Substrat für verschiedene Enzyme, wie DNA-Polymerase (z.B. Taq-DNA- Polymerase), DNA-Restriktionsenzyme, DNA-Ligase und Reverse Transkriptase (wie AMV-Reverse Transkriptase) dienen kann.
Mit dem erfindungsgemässen Verfahren kann zum Beispiel eine ausreichende Menge NA in ungefähr 45 Minuten aus 50 µl Gesamtblut isoliert werden, ohne voherige Trennung von Plasma und Zellen, um NA-Sequenzen mittels einer Amplifikationsmethode wie zum Beispiel die PCR-Methode oder die sogenannte in der EP 0329822 beschriebene NASBA-Methode (NASBA = auf Nukleinsäuresequenzen basierende Amplifikation) nachzuweisen. Die Erfindung ist jedoch auch auf verschiedene andere NA enthaltende biologische Materialien anwendbar, wie Serum, Faeces, Urin etc. Aus diesem Grund ist die Erfindung für die Diagnose von bakteriellen und viralen Infektionen, als auch für die Untersuchung von Genpolymorphismen im Rahmen der pränatalen Diagnostik und der Diagnostik der Prädisposition für erbliche Tumore geeignet.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren der NA-Isolierung ist das Risiko der Kontamination sehr niedrig, weil das gesamte Verfahren in einem einzigen Reaktionsgefäss durchgeführt werden kann und die von dem rohen Ausgangsmaterial in dem ersten Schritt des Verfahrens freigewordene NA ist zumindest zum grössten Teil an die feste Phase während dem gesamten weiteren Reinigungsverfahren gebunden. Das Risiko für das Personal sich während des Verarbeitens des Materials möglicherweise mit Bakterien oder Viren zu infizieren, bleibt im wesentlichen auf den ersten Schritt des Isolierungsverfahrens, in dem die Probe in das Reaktionsgefäss gegeben wird, beschränkt. Bei dieser ersten Behandlung werden die potentiell vorhandenen Krankheitserreger wirksam inaktiviert. Das Verfahren erfordert keine spezielle periphere Ausrüstung (ein Vortex-Mixer, eine Zentrifuge des 12 000 x g-Eppendorf-Typs und ein Wasserbad oder ein Eppendorf-Wärmeblock gehören zu der Standardlaborausrüstung) und auch kein spezielles biochemisches Wissen, so dass das Verfahren für routinemässige NA-Isolierungen aus einer grossen Anzahl von Proben, in andern Worten für die Automation, geeignet ist. Mit dem erfingsgemässen Verfahren können mehr als 10 und sogar mehr als 24 verschiedene Proben in ungefähr einer Stunde bearbeitet werden.
Die Erfindung bezieht sich nicht nur auf ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäure aus einem Nukleinsäure enthaltenden Ausgangsmaterial, sondern auch auf einen Testkit, um die mit dem genannten Verfahren gewonnene Nukleinsäure zu vermehren.
In einer erfingsgemässen Ausführungsform umfasst eine Kombination von Mitteln (a) einen Guanidinium(iso)thiocyanat-Lysispuffer, (b) eine wässrige Suspension aus Silica-Partikeln mit einer Grösse im wesentlichen zwischen 0,05 und 500 µm, vorzugsweise zwischen 0,1 und 200 µm und am meisten bevorzugt zwischen 1 und 200 µm, c) ein Guanidinium(iso)thiocyanat enthaltender Waschpuffer und falls erforderlich (d) einen Elutionspuffer. Eine erfindungsgemässe Kombination von Mitteln kann daher z.B. aus den folgenden 4 Komponenten zusammengesetzt sein.
Komponente 1: eine gepufferte Guanidinium(iso)thiocyanatlösung;
Komponente 2: eine Suspension aus Silicapartikeln
Komponente 3: ein Waschpuffer: und (gegebenenfalls)
Komponente 4: ein Elutionspuffer.
Die Komponenten 1 und 2 können, falls erforderlich, vereint werden, was jedoch zu einer begrenzten Haltbarkeit führt.
Andere Reagenzien, wie Aceton und Ethanol, die vorzugsweise in dem erfindungsgemässen Verfahren der NA-Isolierung verwendet werden, gehören zu einer standardmässigen Laborausrüstung.
Die Erfindung wird im folgenden durch eine Anzahl von Beispielen veranschaulicht. In dem vorangehenden Teil werden die verwendeten Materialien und Methoden beschrieben.

MATERIALIEN UND METHODEN

A) Suspension aus grobem Silica (SC)

Siliciumdioxid (SiO&sub2;) von Sigma mit einer Partikelgrössenverteilung 0,5 bis 10 µm, wobei 80 % zwischen 1 und 5 µm rangierten, wurde verwendet.
60 g Silica wurden in Aqua bidest (bis zu einem Volumen von 500 ml) in einem Zylinder mit einem Durchmesser von 5 cm suspendiert, die Höhe der wässrigen Säule betrug 27,5 cm. Nach einer 25- stündigen 1 x g-Sedimentation bei Raumtemperatur wurde der Überstand bis auf 70 ml abgesaugt. Aqua bidest wurde bis auf 500 ml zugegeben und die Partikel wurden durch Schütteln des Zylinders resuspendiert. Nach einer 5-stündigen 1 x g-Sedimentation wurde der Überstand bis auf 60 ml abgesaugt. Nach der Zugabe von 600 µl 32 %-iger (G/V) HCL wurden die Partikel durch Vortexen resuspendiert. Die Suspension wurde in Aliquots von 4 ml in 6 ml-Flaschen aufgeteilt, die fest verschlossen und in einem Autoklaven 20 Minuten bei 121 ºC erhitzt wurden. Dieses Sedimentations-Protokoll führte zu einer Anreicherung der grösseren Silicapartikel, d.h., d.h. die Partikel haben eine Partikelgrösse von mehr als 1 µm, was durch elektronenmikroskopische Untersuchung festgestellt wurde. Darüberhinaus resultiert die Autoklavenbehandlung einer sauren (pH ungefähr 2) Silicalösung darin, dass gegebenenfalls vorhandene Nukleinsäure völlig abgebaut wird. Die auf diese Weise erhaltene Suspension aus grobem Silica wird im folgenden als SC (Silica Coarse) bezeichnet.

Suspensioen von Silicaderivaten

Silica wurde mit Methylarnidsilicondioxid mit Alkylschwänzen mit einer Länge von 2 bis 18 C-Atomen derivatisiert. Die Grösse der derivatisierten Silicapartikel variierte von 63 bis 200 µm. Die Porengrösse der Partikel betrug 500 A. Diese Silicaderivate (12 MAAMC&sub2;-C&sub1;&sub8;) wurden von Diosynth, Oss geliefert.
Für die DNA-Isolierung (Beispiel H1) wurden 0,5 g der derivatisierten Silicapartikel in 1 ml Aqua bidest suspendiert. Diese Silicasuspensionen wurden mit 12 µl einer 32%-igen HCL 30 Minuten bei 90 ºC vorbehandelt.

B) L2-Puffer

L2-Puffer (0,1 M Tris.CL, pH 6,4) wurde durch Lösen von 12,1 g TRIS (Boehringer) in 800 ml Aqua bidest unter Zugabe von 8,1 ml 37 % (G/V) HCl hergestellt und auf ein Volumen von 1 l mit Aqua bidest aufgefüllt.

C) Waschflüsssigkeit L"

Die Waschflüssigkeit L2 wurde durch Lösen von 120 g GuSCN (Guanidiniumthiocyanat von Fluka) in 100 ml L2-Puffer hergestellt.

Waschflüssigkeiten L2*

Die Waschflüssigkeit L2* wurde durch Lösen von 12,45 g KI (Kaliumjodid von Merck) in 25 ml L2-Puffer hergestellt. Zur Herstellung einer auf NaI (Natriumjodid) basierenden chaotropen Substanz wurden 1,25 g NaI (Natriumjodid von Merck) in 25 ml L2-Puffer gelöst. Für eine auf Natriumthiocyanat basierende chaotrope Substanz wurden 6,1 g NaSCN (Baker) in 25 ml L2-Puffer gelöst.
Zur Herstellung einer KI und Harnstoff (8M) enthaltenden chaotropen Substanz wurden 12,45 KI und 12,0 g Harnstoff in L2-Puffer (25 ml) gelöst. Auf gleiche Weise wurden chaotrope Substanzen hergestellt, die Harnstoff mit NaI und Harnstoff mit NaSCN kombinieren.

D) Lysispuffer L5

Der Lysispuffer LS wurde aus 100 ml L2-Puffer durch Lösen von 120 g GuSCN (leichtes Schütteln in einem Warmwasserbad von ungefähr 60 ºC) hergestellt, dann wurden 26,0 g einer 40 %-igen (G/V) Dextran-Sulfat-Lösung (Pharmacia LKB), 22 ml 0,2 M EDTA, pH 8 und 2,6 g Triton X-100 (Packard) zugegeben und anschliessend wurde die Lösung homogenisiert. Die 0,2 M EDTA-Lösung, pH 8,0 wurde durch Lösen von 37,2 g EDTA (Titriplex von Merck) und 4,4 g NaOH (Merck) in 500 ml Wasser hergestellt.

E) Lysispuffer L6

Der Lysispuffer L6 wurde aus 100 ml L2-Puffer durch Lösen von 12,45 von 120 g GuSCN (unter leichtem Schütteln im Warmwasserbad bei 60 ºC) hergestellt, dann wurden 22 ml einer 0,2 M EDTA, pH 8,0 und 2,6 g Triton X-100 (Packard) zugegeben und die Lösung wurde dann homogenisiert.

Lysispuffer L6*

Der Lysispuffer L6* wurde von 25 ml L2-Puffer durch Lösen von 12,45 g KI (Kaliumjodid, Merck) (leichtes Schütteln in einem Wasserbad bei 40 ºC) gelöst und anschliessend werden 5,5 ml einer 0,2 M EDTA (pH 8,0) und 0,65 g Triton X-100 (Boehringer 789704) zugegeben und die Lösung anschliessend homogenisiert. Das gleiche Verfahren wurde zur Herstellung des Lysispuffers L6* mit NaI (Natriumjodid, Merck) und des Lysispuffers L6* mit NaSCN (Natriumcyanat, Baker) angewendet.
Der Lysispuffer L6* mit der Kombination KI und Harnstoff wurde aus 25 ml L2-Puffer durch Lösen von 12,45 g KI (Kaliumjodid, Merck) und 12,0 g Harnstoff (Gibco BRL) hergestellt. Anschliessend wurden 5,5 ml 0,2 M EDTA (pH 8,0) und 0,65 g Triton X-100 (Boehringer) zugegeben und die Lösung homogenisiert. Das gleiche Verfahren wurde für die Herstellung von NaI/Harnstoff und NaSCN/Harnstoff angewendet.

F) Lysispuffer GEDTA

GEDTA bedeutet eine Lösung aus 120 g GuSCN in 100 ml 0,2 M EDTA, pH 8,0.

G) TE-Puffer

Ein für die Elution geeigneter Puffer ist eine 10 mM Tris.Cl, 1 mM EDTA-Lösung mit einem pH vom 7,5 (TE-Puffer), der, falls erwunscht, 0,5 E/µl RNAsin (Promega) enthält.

H) Reaktionsgefässe

Die Reaktionsgefässe wurden am Tag des Extraktionsverfahrens durch Zugabe von 900 µl Lysispuffer und 40 µl eines NA-Trägerstoffs (Suspension aus grobem Silica, wie zum Beispiel SC oder Diatomeenerde) in Eppendorf-Zentrifugenröhrchen (Typ 3810, 1,5 ml) vorbereitet.

I) Waschverfahren

Ein Pellet wird durch Zugabe von 1 ml Waschlösung gewaschen, dann auf dem Vortexgerät geschüttelt bis das Pellet resuspendiert ist, 15 Sek. bei 12 000 x g zentrifugiert und der Überstand durch Absaugen verworfen.

J) Elutionsverfahren

Die Elution wird durch Zugabe von mindestens 25 µl, vorzugsweise mindestens 40 µl Elutionspuffer, kurzem Vortexen (2 Sek.) und 10- minütigem Inkubieren bei 56 ºC durchgeführt.

K) Protokoll B

Dieses Protokoll ist für die Isolierung ds-DNA aus komplexen Ausgangsmaterialien, wie menschliches Serum, Gesamtblut, wässrige Faeces oder Urin geeignet und verwendet Eppendorff-Reaktionsgefäss mit 900 µl GEDTA und 40 µl SC.
1. Das Reaktionsgefäss wird gevortext, bis das Pellet resuspendiert ist.
2. 50 µl des Ausgangsmaterials (z.B. Serum, Gesamtblut, wässrige Faeces oder Urin) werden zugegeben und sofort bis zur Homogenität gevortext.
3. 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und 5 Sekunden vortexen.
4. 15 Sekunden bei 12 000 x g zentrifugieren und den Überstand durch Absaugen verwerfen.
5. Pellet zweimal mit GEDTA waschen.
6. Pellet zweimal mit 70 %-igem Ethanol waschen.
7. Pellet einmal mit Aceton waschen.
8. Pellet 10 Minuten bei 56 ºC mit geöffnetem Deckel trocknen.
9. DNA mit 50 µl TE-Puffer ohne RNAsin eluieren.
10. 2 Minuten bei 12 000 x g zentrifugieren, der Überstand enthält DNA.

Protokoll Y

Diese Protokoll ist für die Isolierung von NA (gleichzeitige Reinigung von dsDNA, ssDNA, dsRNS und ssRNA) aus komplexen Ausgangsmaterialien, wie humanes Serum, Gesamtblut, wässrige Faeces oder Urin geeignet und verwendet Eppendorff-Reaktionsgefässe mit 900 µl L6 und 40 µl SC.
1. Das Reaktionsgefäss wird gevortext, bis das Pellet resuspendiert ist.
2. 50 µl des Ausgangsmaterials (z.B. Serum, Gesamtblut, wässrige Faeces oder Urin) werden zugegeben und sofort bis zur Homogenität gevortext.
3. 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und 5 Sekunden vortexen.
4. 15 Sekunden bei 12 000 x g zentrifugieren und den Überstand durch Absaugen verwerfen.
5. Pellet zweimal mit L2 waschen.
6. Pellet zweimal mit 70 %-igem Ethanol waschen.
7. Pellet einmal mit Aceton waschen.
8. Pellet 10 Minuten bei 56 ºC mit geöffnetem Deckel trocknen.
9. Na mit 50 µl TE-Puffer eluieren, gegebenenfalls in Anwesenheit von Rnasin.
10. 2 Minuten bei 12 000 x g zentrifugieren, der Überstand enthält NA.

Protokoll Y*

Dieses Protokoll ist zur Isolierung von NA aus komplexen Ausgangsmaterialien , wie menschliches Serum, Urin oder Bakterienkulturen geeignet.
Verfahren:
Es werden Eppendorff-Reaktionsgefässe mit 900 µl L6* und 40 µl SC verwendet.
1. Das Reaktionsgefäss wird auf dem Vortexgerät geschüttelt bis das Pellet resuspendiert ist.
2. 50 µl des Ausgangsmaterials (z.B. Serum-Plasmid, Urin- Plasmid-Mischungen oder bakterielle Übernachtkulturen) werden zugegeben und sofort bis zur Homogenität gevortext (5 Sekunden).
3. 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und mischen.
4. 15 Sekunden mit 14 000 x g zentrifugieren und den Überstand durch Absaugen verwerfen.
5. Pellet einmal mit L2*-Waschlösung waschen.
6. Pellet zweimal mit 70%-igem Ethanol waschen.
7. Pellet einmal mit Aceton waschen.
8. Pellet 10 Minuten bei 56 ºC mit geöffnetem Deckel trocknen.
9. NA mit 50 µl TE-Puffer (10 mM Tris-1mM EDTA, pH 8,0) gegebenenfalls in Anwesenheit von RNAsin eluieren.
10. 2 Minuten bei 14 000 x g zentrifugieren; der Überstand enthält NA.

M) Protokoll Z

Dieses Protokoll ist für die Isolierung von NA aus komplexen Ausgangsmaterialien, wie menschliches Serum, Gesamtblut, wässrige Faeces oder Urin geeignet und verwendet Eppendorff- Reaktionsgefässe mit 900 µl L5 und 40 µl SC. Die isolierte NA kann für Hybridisierungsreaktionen verwendet werden, ist jedoch weniger als Substrat für Restriktionsenzyme geeignet. T4 DNA-Ligase ist jedoch aktiv. Im Vergleich zu Protokoll Y führt dieses Protokoll zu höheren NA-Ausbeuten.
1. Das Reaktionsgefäss wird auf dem Vortexgerät geschüttelt, bis das Pellet resuspendiert ist.
2. 50 µl des Ausgangsmaterials (Serum, Gesamtblut, wässrige Faeces oder Urin) werden zugegeben und sofort bis zur Homogenität gevortext (ungefähr 5 Sek.).
3. 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und 5 Sekunden vortexen.
4. 15 Sekunden bei 12 000 x g zentrifugieren und den Überstand durch Absaugen verwerfen.
5. Pellet zweimal mit L2 waschen.
6. Pellet zweimal mit 70 %-igem Ethanol waschen.
7. Pellet einmal mit Aceton waschen.
8. Pellet 10 Minuten bei 56 ºC mit geöffnetem Deckel trocknen.
9. Na mit 50 µl TE-Puffer eluieren, gegebenenfalls in Anwesenheit von RNAsin.
10. 2 Minuten bei 12 000 x g zentrifugieren, der Überstand enthält NA.

N) Ausgangsmaterialien

Die Beispiele sind wie folgt in Abschnitte unterteilt, inter alia (Abschnitte A-D) der Art des Ausgangsmaterials entsprechend:
Abschnitt A: menschliches Serum
Abschnitt B: menschliches Gesamtblut
Abschnitt C: menschlicher Urin
Diese Abschnitte A, B und C sollen insbesondere zeigen, dass sowohl dsDNA als auch ssRNA in reiner Form isoliert werden können.
Abschitt D: menschliche Faeces
Dieser Abschnitt D zeigt, unter anderem, dass auch dsRNA isoliert werden kann.
Abchnitt E: Einzelstrang DNA
Dieser Abschnitt E umfasst Versuche, die zeigen ,dass die Erfindung zur Isolierung von ssDNA angewendet werden kann.
Abschnitt F: Diatomeen-Erde
Dieser Abschnitt zeigt, dass Diatomeen-Skelette sehr geeignet sind, um gemäss der Erfindung als Silicapartikel verwendet zu werden. Es wird auch gezeigt, dass die Erfindung für die Isolierung von NA aus verschiedenen gram-negativen Bakterien angewendet werden kann.
Abschnitt G zeigt, dass die NA aus Bakterienzellen unter Verwendung verschiedener chaotroper Substanzen isoliert werden kann. Abschnitte H und I zeigen die Isolierung von DNA mit Hilfe einer alternativen festen Phasen.
Es wurde immer eine Menge von 50 µl verwendet. Das in Abschnitt B und F verwendete Blut war immer frisches Blut, das in Anwesenheit von EDTA entnommen wurde, um Gerinnung zu verhindern (das Venoject-System von Terumo N.V., Louvain, Belgien, Sammelröhrchen des Typs VT-574 TKZ) verwendend. Die in den anderen Abschnitten verwendeten Ausgangsmaterialien (Serum, Urin und Faeces) waren gefroren. In Beispiel A1, A2, A3, B1, B2, B5, B7 und F1 war das Serum oder Blut von derselben Versuchsperson.

O) Weitere Verfahren

Für gelelektrophoretische Untersuchungen wurden Teile der eluierten NA-Menge auf ein neutrales Agarpose-Gel geladen, das 1 µg/ml Ethidium-Bromid im Puffer-System enthielt, wie von Aij und Borst (Biochim. Biophys. Acta 269, 1972, 192) beschrieben. Fotos wurden unter UV-Belichtung des Gels gemacht.
In einigen Versuchen wurde ein bekannte Menge gereinigter DNA (Input-DNA) zu der klinischen Probe gegeben. In diesen Fällen wurde eine Menge der Input-DNA auf das gleiche Gel geladen, die einer Extraktionseffizienz von 100 % entsprach.
Bakterielle Plasmid-DNA wurde wie von Ish-Horowicz und Burke (Nucleic Acid Res. 9, 1981, 2989) aus Escherichia coli HB101 gereinigt, gefolgt von einer Säulenchromatographie mit Sepharose CL 2B (Pharmacia Inc.) und Ethanol-Fällung. Bakterielle Plasmid-DNA wurde aus Escherichia coli JM101 (J.Messing, Rec. DNA Techn. Bull. 2, 43-48 (1979)) wie von Birnboim und Doly (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, CSH, New York) beschrieben, gereinigt.
Das pMCV-E enthält ein 0,4 kb grosses ches Cytomegalievirus-DNA- Fragment, das in den 2 kb Vektor pHC 624 (Boros in Gene 30, 1984, 257) kloniert wurde; pEBV-10 enthält ein 0,9 kb Epstein-Barr- Virus-DNA-Fragment, das in den gleichen Vektor kloniert wurde. Um eine mit relaxierten zirkulären (CII) Molekülen angereicherte Präparation zu erhalten, wurde pEBV-10-DNA (2,9kb) mit DNAse 1 behandelt. Die Moleküle der Komponente II dienen als Modell für die Reinigung von viraler Hepatitis B-DNA, die in Virionen als ein 3,2 kb grosses relaxiertes zirkuläres Molekül vorhanden ist.
pGem2p24 enthält eine 1,45 kb grosse HIV-Sequenz; die Konstruktion von pGem3p24 wird unten beschrieben.
Die Sequenz von HIV HxB2-DNA wurde von verschiedenen Autoren beschrieben (J. Virol. 61, 633-637 (1987), Nature 326, 711-713 (1987), Aids Res. Hum. Retrovirus 3, 41-55 (1987); Aids Res. Hum. Retrovirus 3, 33-39 (1987) und Science 237, 888-893 (1987)).
HIV Hx2B-DNA wurde teilweise mit FokI an den Stellen 1189 und 2613 der ursprünglichen HIV HxB2-Sequenz geschnitten. Die Nukleotidnummern beziehen sich auf die Genbank-Bestimmung.
Die FokI-Stellen dieses Fragments wurden unter Verwendung der Klenow DNA-Polymerase aufgefüllt (Maniatis, vide supra) und in die Polylinker-SmaI-Stelle des Plasmids pUC-19 kloniert (Maniatis, vide supra). Das daraus resultierende Plasmid, das das HIV HxB2-DNA- Fragment enthält, wurde als pUC19-p24 bezeichnet.
Um das Plasmid pGem3p24 zu erhalten, wurde das 1450 bp grosse Eco- RI-BamHI-Fragment von pUC19-p24 in den mit EcoRI-BamHI verdauten Vektor pGem3 (2867 bp; Promega Corporation, Madison USA) kloniert.
Die im PCR-Verfahren verwendeten Primer wurden mit mit einem Oligo-Synthetisiergerät (von Applied Biosystems) synthetisiert. Die Nukleotidsequenzen der Primer ES47 (25-mer) und ES75 (47-mer) sind unten angegeben. ES47 ES75
In den meisten der RNA-Isolierungsexperimeten (Beispiele A3, B5, B6, B7, C2, D1, E1, F1 und F2) wurden keine Vorsichtsmassnahmen ausser der Verwendung von Rnasin in dem Elutionspuffer getroffen, um einen RNA-Abbau während des Reinigungsverfahrens zu verhindern. Nur während der Zugabe der klinischen Proben in die Reaktionsgfässe wurden Handschuhe getragen; es wurden keine RNAs- Inhibitoren für die Herstellung der Reagenzien verwendet; und es wurden nicht-autoklavierte Eppendorff-Gefässe und Pipettenspitzen verwendet. Beispiele F1 und F2 haben unter anderem gezeigt, dass die Anwesenheit von Rnasin während der Elution nicht dringend notwendig ist.
Die verwendten Enzyme waren käuflich erhältlich und wurden wie von dem Hersteller empfohlen angewendet. Alle Restriktionsenzyme, wie auch RNAse A, T4-Ligase und AMV Reverse Transkriptase waren von Boehringer (Mannheim). Taq-DNA-Polymerase war von Cetus Inc. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde mit einem Perkin-Elmer Cetus DNA-Thermal Cycler durchgeführt.
Es ist für die verschiedenen Anwendungen von wesentlicher Bedeutung, dass die in dem erfindungsgemässen Verfahren verwendten Reagenzien, insbesondere die NA-Träger (zum Beispiel Silicapartikel) und die Lysis- und Waschpuffer, die die chaotrope Substanz enthalten, nicht durch Nukleinsäure (z.B. durch NA enthaltende Bakterien oder Viren) verunreinigt sind. Dies kann im Falle des NA-Trägers durch 20-minütiges Erhitzen bei 121 ºC in einem Autoklaven gewährleistet werden.
Dieses Verfahren ist jedoch bei den GuSCN-enthaltenden Lysis- und Waschpuffer (GEDTA, L5, L6 und L2) nicht hilfreich, sowohl aufgrund eines möglichen Aktivitätsverlusts und aufgrund des bestehenden Umweltrisikos. Um diese Reagenzien (so gut wie möglich) nukleinsäurefrei zu machen, werden sie über eine der Erfindung gemässe Säule mit Silicapartikeln gegeben. Wegen der Lysiseigenschaften der GuSCN-enthaltenden Puffer und der Eigenschaft des Silica NA in Anwesenheit der chaotropen Substanz GuSCN zu binden, führt ein solches Verfahren zu einem NA-freien Puffer. Die Säule selbst kann durch Erhitzen für zum Beispiel eine oder mehrere Stunden bei zum Beispiel 500 oder mehr ºC nukleinsäurefrei gemacht werden.

P) DNA-Arten

CI :Covalent geschlossene zirkuläre DNA (Plasmid)
CII :relaxierte (mit Einzelstrangbruch, Nick)) zirkuläre DNA
CIII Lineare DNA (linearisiertes Plasmid)
LMW :Niedermolekulargewichts-DNA (< 0,5 kb); HpaII-Verdau von pHC 624, Fragmente mit 471 bp, 404 bp, 242 bp (zwei Fragmente), 190 bp, 147 bp, 110 bp, 67 bp und einige kleinere Fragmente unbestimmter Grösse.
MMW :DNA mit mittlerem Molekulargewicht (0,5-29 kb); HindIII- Verdau von Lambda-Phagen-DNA, Fragmente von 23 kb, 9,4 kb, 6,7 kb, 4,4 kb, 2,3 kb, 2,0 kb und 0,56 kb.
HMW :DNA höheren Molekulargewichts (> 29 kb).
ssDNA:Einzelstrang-DNA des Phagen Lambda (Boehringer).

ABSCHNITT A: DNA/RNA-Reinigung aus menschlichem Serum

In menschlichem Serum können zum Beispiel Viren oder Bakterien anwesend sein. Diese Organismen können frei oder gebunden in Form von Immunkomplexen auftreten. Die NA-Mengen sind gewöhnlich so gering, dass ein Nachweis durch ein Agarose-Gel und UV-Belchtung der NA-Ethidiumbromid-Komplexe unmöglich ist. Um zu zeigen, dass DNA aus menschlichen Serum gereinigt werden kann, wurden Mikrogramm-Mengen an gereinigter DNA dem Serum zugegeben und anschliessend wurde die DNA gemäss Protokoll B (Beispiele A1 und A2) isoliert. Um zu zeigen, dass DNA und RNA gleichzeitig aus menschlichem Serum gereinigt werden kann, wurden Säugetierzellen aus Kulturen oder Bakterien (die ein kleines Plasmid trugen) zugegeben und die NA wurde gemäss dem Protokoll Y (Beispiel 3 A) isoliert. Beispiel 4 zeigt schliesslich, dass mit dem Protokoll Y in menschlichem Serum vorhandene HIV-RNA (Human Immun Deficiency Virus) gereinigt werden und mit dem PCR-Verfahren nachgewiesen werden kann. Beispiel A5 zeigt, dass mit dem Protokoll Y* DNA aus menschlichem Serum unter Verwendung verschiedener chaotroper Substanzen in Kombination mit Silica als Nukleinsäure bindende feste Phase gereinigt werden kann.

Beispiel A1: DNA-Reinigung aus menschlichem Serum

Menschliches Serum (500 µl) wurde mit bekannten Mengen gereinigter DNA [100 µl LMW (45 µg), 20 µl MMW (20 µg), 40 µl CI/CII (20 µg)] gemischt und 10 Proben 66 µl wurden als Input-Material für 10 Extraktionen gemäss Protokoll B verwendet. Die Menge SC (Suspension aus grobem Silica) variierte in diesem Experiment zwischen 2,5 und 40 µl. Die Extraktionen wurden im Doppel ausgeführt und die Hälfte der eluierten DNA von jeder Probe wurde auf ein 1 %-iges Agarosegel gegeben. Zum Vergleich wurde die Hälfte Input- DNA auf das gleiche Gel in Kontrollspuren gegeben.
Doppelstrang-DNA, sowohl linear (im Bereich von 23 kb bis ungefähr 60 bp), kovalent geschlossene (CI) und relaxierte zirkuläre (CII) DNA wurden hinreichend isoliert, wenn die Menge SC mehr als 10 µl betrug. Die Ausbeute des grössten MMW-Fragments (ungefähr 23 kb) scheint im Vergleich zu den kleineren Fragmenten, relativ gering zu sein, was im Hinblick auf andere Experimente auf ein Scheren der Fragmente mit hohem Molekulargewicht zurückgeführt werden kann.
Die Kontrollspuren zeigen jeweils die Menge LMW-, CII/CI- und MMW- DNA, die bei einer Extraktionseffizienz von 100 % erreicht werden sollte. Wie zuvor bemerkt, wurde ein CII-reich (DNAse I behandeltes) 3 kb-Plasmid (pEBV-10) als Input-Material verwendet.

Beispiel A2: Aus menschlichem Serum isolierte DNA ist ein gutes Substrat für Restriktionsenzyme und T4-DNA-Ligase

Gereinigte DNA-Präparationen wurden 12 menschlichen Serumproben 50 µl zugegeben. Die DNA wurde aus diesen 12 Mischungen gemäss Protokoll B isoliert; die Elution wurde mit 50 µl TE durchgeführt.
Die Hälfte der eluierten DNA wurde (im Doppel) entweder mit einem der folgenden Restriktionsenzyme: EcoRI, BamHI und BglII (diese sind jeweils in Niedrig-, Mittel- und Hochsalzpuffern aktiv) oder mit T4 DNA-Ligase behandelt oder nicht behandelt. Die DNA-Proben wurden einer Elektrophorese in einem 1 %-igen Agarosegel unterzogen und durch UV-Belichtung sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse der T4-Ligasebehandlung (1 h bei 37 ºC, 3 Einheiten der T4-Ligase in einem 30 µl Reaktionsvolumen) zeigt eine Verschiebung des Molekulargewichts der DNA-Fragmente und zeigt an, dass die aus dem menschlichen Serum isolierte DNA nicht wesentlich durch exonukleären Abbau beeinträchtigt ist.
Die Ergebnisse für 8 Serumproben, denen ein gereinigtes Plasmid (pCMV-E; 3,3 µg; 1,5 µl) zugegeben wurde, zeigten jeweils, dass die Verdaue mir EcoRI, BamHI und BglII alle Plasmide linearisierten. Alle Inkubationen mit Restriktionsenzymen wurden in einem 30 µl Reaktionsvolumen 1 h bei 37 ºC mit 9 Einheiten Enzym durchgeführt.

Beispiel A3: Gleichzeitige Isolierung von DNA und ssRNA aus menschlichem Serum

Da im menschlichen Serum nur sehr niedrige Mengenn RNA vorhanden sind (z.B. in Viren, Bakterien oder Zellen), die durch UV- Belichtung Ethidiumbromid-gefärbter Gele nicht nachweisbar sind, wurden den menschlichen Serumproben RNA-Quellen zugegeben. Als exogene RNA-Quellen wurden Säugetier- oder Bakterienzellen verwendet. Die NA wurde gemäss Protokoll Y aus den Proben isoliert und in 50 µl TE mit 0,5 µl RNAsin pro µl in Ab- oder Anwesenheit von RNAse A (40 ng pro µl Elutionspuffer) eluiert. Die Ergebnisse der anschliessenden Elektrophorese durch ein 1%-iges Agarosegel zeigen, dass RNA und DNA nachgewiesen werden können. Die zugegebenen Säugetiertierzellen betrugen pro 50 µl Probe 5x10&sup5; 10B- Rattenzellen (Boom et al., J. Gen. Virol. 69, 1988, 1179), während die zugegebenen Bakterien pro 50 µl Serum das Zellpellet von 100 µl einer Übernachtkultur des das Plasmid pCMV-E enthaltende E.coli-Stamms HB101 waren.

Beispiel A4: Polymerase-Kettenreaktion für den Nachweis der aus menschlichem Serum isolierten RNA des menschlichen Immmundefizienz-Virus

Aus zwei menschlichen Serumproben von jeweils 50 µl (Patienten F und H) wurde gemäss Protokoll Y NA (75 µl) isoliert. Das Serum des Patienten F wies grosse Mengen des HIV-Antigens P24 (gemäss dem Festphasenimmunassay für das HIV P24-Antigen der Abbott Laboratories) auf, war jedoch negativ bezüglich HIV- Antigenen (gemäss dem HIV-Antikörper-ELISA der Abott Laboratories) und das Serum des Patienten H war in beiden Tests negativ.
Teile der isolierten NA (43 µl) wurden mit RNAse freier DNAse (Boehringer, 1 E DNAse/µl) 90 Minuten bei 37 ºC inkubiert. Nach der Ethanolfällung und 15-minütigem Erhitzen bei 68 ºC wurde die RNA in 15 µl TE-Puffer resuspendiert. Ein 5 µl grosser Teil dieser RNA-Präparation wurde mit 0,4 E/µl AMV Reverse Transkriptase (30 Minuten bei 42 ºC, Reaktionsvolumen 20 µl) in der Gegenwart HIV- spezifischer Primer behandelt oder nicht behandelt. Dann wurde das Reaktionsvolumen auf 100 µl durch Zugabe von 80 µl eines 1,25 x konzentrierten PCR-Puffer einschliesslich dNTPS gebracht, 1 E Taq- DNA-Polymerase wurde zugegeben und die Amplifikation wurde gestartet (1 Zyklus umfasste 1 Minute bei 95ºC, 1 Minute bei 55 ºC, 2 Minuten bei 72 ºC). Der Reaktionsmischung wurden Aliquots von 10 µl nach 20, 25, 30 und 35 Zyklen entnommen und auf ein 2%-iges Agarose-Gel gegeben. Das erwartete 330 bp grosse amplifizierte HIV- Fragment wurde für die RNA des Patienten F, die mit Reverser Transkriptase behandelt wurde, bereits nach 25 Zyklen beobachtet, was darauf hinweist, dass sich HIV-RNA im Serum befand.

Beispiel A5: DNA-Reinigung mit verschiedenen chaotropen Substan zen

Zehn Proben 50 µl menschlichen Serums wurden jeweils mit 10 µg gereinigter, aus der CI- und CII-Form bestehender pGEM3p24-DNA (siehe Methoden) gemischt. Diese 10 µl Plasmid/Serum-Mischungen wurden als Input-Material für Extraktionen gemäss Protokoll Y* verwendet. Die verwendeten Konzentrationen chaotroper Substanzen sind Tabelle A.5.1 zu entnehmen.
Nach der Extraktion wurden 25 % der eluierten DNA von jeder Probe auf einem 0,8 %-igen Agarosegel analysiert. Zur Mengenbestimmung der wiedergewonnenen Plasmid-DNA wurde die Input-DNA auch auf das gleiche Gel geladen.
Nach der Elektrophorese wurden die Gele unter UV-Belichtung fografiert und die Effizienz der DNA-Rückgewinnung visuell auf der Basis der Intensität der Plasmidbanden beurteilt (siehe Legende zu Tabelle A5.1)
Gleich Experimente wurden unter Verwendung von NaI und NaSCN als chaotrope Substanzen durchgeführt (siehe Probenbeschreibung unten). Tabelle A 5.1. Effizienz der Rückgewinnung der Plasmid-DNA aus Proben menschlichen Serums unter Verwendung verschiedener chaotroper Substanzen in Kombination mit Silica.

Legende:

10 nachweisbare Proben wurden wie oben beschrieben hergestellt und unter Verwendung der in der Tabelle aufgeführten chaotropen Substanzen analysiert.
-: keine Rückgewinnung
±: geringe Rückgewinnung
+: sichtbare Rückgewinnung
++: quantitative Rückgewinnung
Die in Tabelle A5.1 zusammenmgefassten Ergebnisse zeigen, dass kovalent geschlossene (CI) und relaxierte (CII) pGEM3p24-DNA effizient isoliert wurden, wenn 3M KI, 3M NaI oder 3M NaSCN in Kombination mit 8M Harnstoff als chaotrope Substanzen verwendet wurden. Die Ausbeute an CII scheint im Vergleich zu CI relativ hoch zu sein.

Abschitt B: DNA/RNA-Reinigung aus menschlichem Gesamtblut

Ein ml menschlichen Bluts enthält ungefähr 5 x 10&sup9; Erythrozyten, die keinen Kern haben und daher nicht zu der NA-Menge im Blut beitragen. Die NA-Menge des Bluts ist weitestgehend durch die weissen Blutzellen bestimmt (ungefähr 4-10 x 10&sup6;/ml) . Diese Zellen sind in ein wässriges Medium (Plasma) eingebettet, das grosse Mengen Protein (ungefähr 70 mg/ml Blut) enthält. Gesamtblut ist daher eine extrem unreine Quelle für NA-Reinigungen. Die Beispiele unter Abschitt B zeigen, dass NA dennoch mit den Protokollen B und Y aus Gesamtblut isoliert werden kann.

Beispiel B1: DNA-Isolierung aus menschlichem Gesamtblut

Menschliches Blut (500 µl) wurde mit bekannten Mengen gereinigter DNA, 100 µl LMW (45 µg), 80 µl CI/CII (40 µg) gemischt und 10 Proben 68 µl wurden als Input-Material für 10 DNA-Extraktionen gemäss Protokoll B verwendet. In diesem Experiment variierte die Menge des verwendeten SC (Suspension aus grobem Silica) zwischen 2,5 und 40 µl. Die Extraktionen wurden im Doppel durchgeführt und die Hälfte (30 µl ) der eluierten DNA von jeder Probe wurde einer Elektrophorese in einem 1 %-igen Agarosegelen unterzogen. Zum Vergleich wurde die Hälfte der Input-DNA ebenfalls auf dasselbe Gel geladen.
Doppelstrang-DNA, sowohl lineare, kovalent geschlossene (CI) als auch relaxierte zirkuläre DNA (CII), wurde effizient aus menschlichem Blut isoliert, wenn mehr als 10 µl SC verwendet wurden. Die Menge der zurückgewonnenen DNA aus dem Gesamtblut war bis ungefähr 10 µl proportional der Menge des verwendeten SC. Höhere Mengen schienen zu einer Sättigung zu führen.

Beispiel B2: Aus menschlichem Blut isolierte DNA ist ein gutes Substrat für Restriktionsenzyme und T4-DNA-Ligase

12 menschlichen Blutproben 50 µl wurden gereinigte DNA- Präparationen zugegeben. Die DNA wurde aus diesen 12 Mischungen gemäss Protokoll B isoliert; die Elution wurde mit 50 µl TE durchgeführt. Die Hälfte der eluierten DNA wurde jeweils mit einem der drei Restriktionsenzyme EcoRI, BamHI und BglII behandelt (diese sind in niedrig-, mittel- oder hoch-konzentrierten Salzpuffer aktiv) oder mit T4-DNA-Ligase behandelt oder nicht behandelt. Die DNA-Proben wurden in einem 1 %-igen Agarosegel aufgetrennt und durch UV-Belichtung sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse der T4-Ligase-Behandlung (1 St. bei 37 ºC, 3 Einheiten T4-Ligase in einem Reaktionsvolumen von 30 µl) zeigt einen Übergang zu einem höheren Molekulargewicht der DNA-Fragmente und weist darauf hin, dass die aus dem menschlichen Blut isolierte DNA nicht wesentlich von einem Exonukeasabbau betroffen ist.
Die Ergebnisse der 8 Blutproben, denen ein gereinigtes Plasmid (pCMV-E; 3,3 µg; 1,5 µl) zugegeben wurde, zeigt, dass die Verdaue mit den Restrikrionsenzymen EcoRI, BamHI und BglII das Plasmid linearisierten. Alle Inkubationen mit Restriktionsenzymen wurden in einem 30 µl Reaktionsvolumen 1 Stunde bei 37 ºC mit 9 Einheiten Enzym durchgeführt.

Beispiel B3: DNA-Isolierung aus 10 verschiedenen Blutproben

In diesem Beispiel wurden 10 verschiedenen Proben menschlichen Bluts als Ausgangsmaterial gewählt. Von jeder dieser Proben war die Anzahl der weissen Blutzellen (WBC) bekannt. Die DNA wurde aus 50 µl der Probe gemäss Protokoll B isoliert und die Elution mit 75 µl TE durchgeführt. Ein Drittel der idolierten DNA wurde direkt auf ein 1 %-iges Agarosegel aufgetragen und ein Teil des Rests (2 µl) wurde für eine PCR verwendet.
Die gleichen Proben wurden den gleichen Isolierungsverfahren unterzogen, nachdem 3 µl LMW-DNA (6 µg) zu jeder 50 µl-Probe gegeben wurden. Auch hier wurden 25 µl des Eluats direkt auf ein Gel gegeben; ein anderer 25 µl-Teil des Eluats wurde zuerst mit T4-DNA- Ligase behandelt (1 Stunde bei 37 ºC, 2 Einheiten in einem Reaktionsvolumen von 30 µl) und dann auf das gleiche Gel gegeben.
Der Inhalt an weissen Blutzellen (WBC) der Proben 1-10 war wie folgt:

Beispiel B4: Polymerase-Kettenreaktion zum Nachweis des menschli chen beta-Globingens in menschlichen weissen Blut zellen

Um zu zeigen, dass aus menschlichem Gesamtblut gemäss Protokoll B isolierte DNA ein gutes Substrat für die Taq-DNA-Polymerase ist, wurden 2 µl der gemäss Beispiel B3 aus 10 verschiedenen Blutproben isolierten DNA einer PCR mit beta-Globin spezifischen Primern unterzogen. Die PCR umfasst 32 Zyklen, jeder Zyklus dauerte 1 Minute bei 94 ºC und dann 3 Minuten bei 65 ºC. Ein Teil des Amplimers (50 %) wurde in einem 2 %-igen Agarosegel aufgetrennt. Ein 120 bp grosses Amplimer und die Primer-Banden konnten nachgewiesen werden.

Beispiel B5: Gleichzeitige Reinigung von DNA und ssRNA aus menschlichem Blut (Wiederholbarkeit)

Um zu zeigen, dass DNA und RNA aus menschlichem Blut auf wiederholbare Weise gereinigt werden kann, wurden 6 Blutproben von einer Person dem Protokoll Y unterzogen, die NA wurde in 75 µl TE mit RNAsin (0,5 E/µl) eluiert. Ein Teil des Eluats von 25 µl wurde auf ein neutrales 1 %-iges Agarosegel gegeben und aufgetrennt. Die Ergebnisse zeigen, dass DNA und RNA nachgewiesen werden können.

Beispiel B6: Gleichzeitige Reinigung von DNA und ssRNA aus menschlichem Blut (10 verschiedene Proben)

50 µl Blutproben von 10 verschiedenen Personen (siehe Beispiel B3) wurden dem Protokoll Y unterzogen, die NA mit 40 µl TE mit 0,5 E/µl RNAsin eluiert. Teile des Eluats von 30 µl wurden in einem neutralen 1 %-igen Agarosegel aufgetrennt. Das Ergebnis zeigt, dass sowohl DNA als auch RNA nachgewiesen werden kann.

Beispiel B7: Gleichzeitige Reinigung von DNA und ssRNA aus menschlichem Blut

Proben menschlichen Bluts wurden exogene RNA-Quellen zugegeben. Als exogene Quellen wurden Säugetierzellen oder Bakterien verwendet. Die NA wurde gemäss Protokoll Y aus den Proben isoliert und in 50 µl TE + 0,5 E/µl RNAsin in Ab- oder Anwesenheit von RNAseA (40 ng/µl im Elutionspuffer) eluiert. Pro 50 µl Blutprobe wurden 5x10&sup5; 10B-Rattenzellen (Boom et al., J. Gen Virol. 69, 1988, 1179) als Säugetierzellen zugegeben und pro 50 µl Blutprobe ein Zellpellet von 100 µl einer Übernachtkultur des E.coli-Stamms HB101, der das Plasmid pCMV-E enthält, als Bakterien.
Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl ssRNA von Säugetieren (18S und 28S ribosomale RNA) und bakterielle ssRNA (16S und 23S ribosomale RNA) aus menschlichem Gesamtblut isoliert werden kann.
Ausserdem konnte genomische DNA und Plasmid-DNA (Form I) ausreichend zurückgewonnen werden.

ABSCHNITT C; DNA/RNA-Reinigung aus menschlichem Urin

In menschlichem Urin kann NA zum Beispiel in Viren oder Bakterien oder in Zellen des Harntrakts vorhanden sein. Die Mengen sind gewöhnlich so niedrig, dass ein Nachweis durch Agarosegelelektrophorese und UV-Belichtung der Ethidiumbromid/NA-Komplexe unmöglich ist. Um zu zeigen, dass DNA aus menschlichem Urin gereinigt werden kann, wurden dem Urin Mikrogrammmengen gereinigter DNA zugegeben und die DNA anschliessend gemäss Protokoll B (Beispiel C1) isoliert. Um zu zeigen, dass DNA und RNA gleichzeitig aus menschlichem Urin gereinigt werden kann, wurden gezüchtete Bakterien (die ein kleines Plasmid tragen) dem Urin zugegeben und die Na anschliessend gemäss Protokoll Y (Beispiel C2) isoliert.
Beispiel C3 zeigt, DNA aus menschlichem Urin mit alternativen chaotropen Subszanzen, wie KI, NaI und NaSCN anstelle von GuSCN mit Silica als Nukleinsäure bindende feste Phase gemäss Protokoll Y* isoliert werden kann.

Beispiel C1: DNA-Reinigung aus menschlichem Urin

10 willkürlich ausgesuchten 50 µl-Proben menschlichen Urins mit unterschiedlicher Trübung (Proben 4, 5, 6 und 7 waren klar, Proben 1,2,3 und und 8 waren leicht trüb und Proben 9 und 10 waren sehr trüb) wurden 3 µl LMW-DNA (6 µg) zugegeben. Die DNA wurde gemäss Protokoll B isoliert und mit 75 µl TE-Puffer isoliert. Ein Drittel eines jeden Eluats wurde auf ein 1 %-iges Agarosegel gegeben. Ein weiterer Teil von 25 µl wurde mit 1,8 E T4-DNA-Ligase (1 Stunde bei 37 ºC in einem 30 µl Reaktionsvolumen ) behandelt und auf das gleiche Gel aufgetragen. Marker-Spuren enthielten LMW-DNA beziehungsweise MMW-DNA. Die Menge an LMW-DNA (2 µg) in einer Markerspur stellt die zu beobachtende Menge bei einer Extraktionseffizienz von 100 % dar.
Die Ergebnisse zeigen, dass die DNA mit dem Protokoll B aus menschlichem Urin effizient gereinigt werden kann und ein gutes Substrat für die T4-DNA-Ligase ist.
Die aus der Urinprobe Nr. 10 isolierte LMW-DNA war eindeutig abgebaut. Es wurde jedoch erwartet, dass die nackte DNA (wie hier im Versuch verwendet) abgebaut werden würde, wenn die Urinprobe reich an Nukleasen ist. Es ist daher wahrscheinlich, dass der Abbau bereits zuvor während der Herstellung der Urin/DNA-Mischungen stattgefunden hat und nicht während der Reinigung. Das nächste Beispiel (C2) zeigt, dass die DNA und sogar die in den Zellen anwesende ssRNA (im Gegensatz zur nackten) effizient aus Urinprobe Nr. 10 isoliert werden kann.

Beispiel C2: Gleichzeitige Reinigung von DNA und ssRNA aus menschlichem Urin

In diesem Experiment wurden die gleichen 10 Urinproben wie in Beispiel C1 verwendet und mit Bakterien, die ein 2,4 kb grosses Plasmid (pMCV-E) tragen, gemischt. Die Na wurde aus diesen Mischungen gemäss Protokoll Y isoliert und in 75 µl TE-Puffer mit 0,5 E/µl RNAsin eluiert. Ein Drittel des Eluats wurde in einem 1 %-igen Agarosegel aufgetrennt. Ein weiterer 25 µl Teil des Eluats wurde mit 10 E des Restriktionsenzyms EcoRI behandelt, das pCMV-E linearsiert (1 Stunde bei 37 ºC in einem Reaktionsvolumen von 30 µl). Diese Behandlung wurde in Gegenwart von 40 ng/µl RNAseA durchgeführt. Die Ergebnisse der Elektrophorese zeigen die 23S und 16S ribosomal RNA als auch die kovalent geschlosseneen (CI) und linearen Formen (CIII) der Pasmid-DNA.

Beispiel C3: DNA-Reinigung mit anderen chaotropen Substanzen

Menschlicher Urin (50 µl) wurde mit 400 µl einer chaotropen Substanz, Lysispuffer L6* und 1 µg pGEM3p24-DNA gemischt. Diese Gesamtsuspension wurde gemischt und zu 500 µl einer chaotropen Substanz (siehe Tabelle C3.1) und 40 µl SiO&sub2; für die DNA-Reinigung gemäss Protokoll Y* gegeben. Die Menge der aus dem Urin isolierten DNA wurde mit Hilfe der Gelelektrophorese analysiert. Die Effizienz der DNA-Rückgewinnung wurde wie Beispiel A5 beschrieben beurteilt und die Ergebnisse sind in Tabelle C3.1 zusammengefasst. Tabelle C3.1 Rückgewinnung von Plasmid-DNA aus menschlichen Urinproben unter Verwendung verschiedener chaotroper Substanzen in Kombination mit Silica (siehe auch Legende zu Tabelle A5.1)
Tabelle C3.1 zeigt, dass die Ausbeute an DNA-Banden des CI- und CII-Typ-DNA gleich war.

Beispiel D1: Reinigung von Rotavirus-ds-DNA aus menschlichem Faeces

Mitglieder der Familie der Reoviridae besitzen ein Genom aus doppelsträngiger RNA. Zu der Famile der Reoviridae gehören wichtige Krankheitserreger, die schwere Diarrhoen verursachen können und dann in grossen Mengen in Faeces-Proben vorhanden sind. Das Rotavirusgenom besteht aus 11 ds-RNA-Segmenten (siehe Hishino in J. Clin. Microbiol. 21, 1985, 425), die gemäss Protokoll B aus Faeces-Überstand isoliert werden konnten. 100 µl Faeces-Überstand, die durch 2-minütige Zentrifugation der Diarrhoe-Probe bei 12000xg erhalten wurden, wurden für die Isolierung verwendet.
Die Ergebnisse haben gezeigt, dass unter Verwendung der Proben von 6 verschiedenen Patienten mit nachgewiesener Rotavirusinfektion (nachgewiesen mit dem Wellcome Rotavirus Latex-Test und mit dem Kallestad-Pathfinder Rotavirus-Antigen gerichtete Nachweissystem) ds-RNA extrahiert werden kann.
Gleiche ergebnisse (gewöhnlich mit höheren Rotavirus-Ausbeuten) wurden erhalten, wenn der erste Zentrifugationsschritt weggelassen wurde und die Faeces-Proben direkt als Input-Material für das Protokoll B oder Y verwendet wurde.

Beispiel E1: ssDNA-Reinigung aus menschlichem Blut, Serum und Urin

Um zu zeigen, dass auch einzelsträngige DNA aus klinischen Proben isoliert werden kann, wurde 1 µg (4 µl) gereinigte M13-Phagen-DNA (M13mp9, Boehringer) 50 µl menschlichem Serum, menschlichem Blut oder menschlichem Urin zugegeben und gemäss Protokoll B oder gemäss Protokoll Y gereinigt. Alle Extraktion wurden vierfach durchgeführt. Die DNA wurde in 50 µl TE-Puffer eluiert und 25 µl wurden in einem 1 %-igen Agarosegel aufgetrennt. Eine Marker-Spur enthält 500 ng M13-ssDNA.
Die Ergebnisse zeigen, dass einzelsträngige DNA aus menschlichem Blut, Serum oder Urin mit dem Protokoll Y und in einem geringeren Mass mit dem Protokoll B isoliert werden kann.

ABSCHNITT F: NA-Bindung an Diatomeen-Erde

Da die Skelette der Diatomeen-Erde nahezu vollständig aus SiO&sub2; bestehen, wurde untersucht, ob sie als Silica verwendet werden könnten. Von jedem der fünf käuflich erhältlichen Diatomeen-Produkte [Celatom FW14, Celatom FW50, Celatom FW60, Celite (AK) und Celite 521, Janssen Biochemica, Louvain, Belgien] wurden 10 g mit 50 ml Aqua bidest und 500 µl 37 %-iger HCL gemischt, gefolgt vom 20-minütigen Erhitzen der resultierenden Suspension auf 121 ºC in einem Autoklaven. In Beispiel F1 und F2 wurden die so erhaltenen Suspensionen für NA-Extraktionen gemäss Protokoll Y verwendet.

Beispiel F1: NA-Isolierung aus menschlichem Blut

Menschliches Blut wurde mit E.coli HB101-Bakterien gemischt, die das Plasmid pCMV-E tragen und das Bakterien-Pellet von 100 µl einer Übernachtkultur wurde 50 µl Blut zugegeben. Proben von 50 µl wurden als Input-Material für NA-Extraktionen gemäss Protokoll Y verwendet. Anstelle von 40 µl SC wurde die oben genannten Suspensionen aus Diatomeenerde verwendet. Die NA wurde in 75 µl TE- Puffer ohne Verwendung eines RNAse-Inhibitos eluiert und 20 µl des Eluats wurden direkt auf das Gel aufgetragen. Ein anderer 20 µl- Teil wurde mit RNAse A (40 ng/µl) zusammen mit 9 E BamHI in einem Reaktionsvolumen von 25 µl behandelt und dann auf das Gel aufgetragen.
Eine Marker-Spur enthält 1 µl MMW-DNA.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Suspensionen aus Diatomeenerde gleiche Bindungseigenschaften wie SC haben. Sowohl dsDNA (Moleküle der Komponente I) als auch ssRNA (23 S und 16 S rRNA) wurde gebunden. Die Plasmid-DNA war ausreichend rein, um durch BamHI vollständig linearisiert (Komponente III) zu werden.

Beispiel F2: Na-Reinigung aus gram-negativen Bakterien

9 verschiedene Spezies gram-negativer Bakterien, die dafür bekannt sind, Krankheiten bei Menschen zu verursachen, wurden auf festen Agar-Platten gezüchtet. 5 bis 10 µl wurden von jeder dieser Bakterien-Spezies von den Platten gekratzt und als Input-Material für DNA-Extraktionen gemäss Protokoll Y verwendet und 40 µl SC oder 40 µl einer Celite 521 -Suspension wurden als NA-Träger verwendet.
Die Extraktionen, in denen SC verwendet wurden, mussten nach dem ersten Waschen gestoppt werden, da die NA-Silica-Komplexe nicht weiter homogenisiert werden konnten, auch nicht nach längerem Schütteln auf einem Vortexgerät (über 3 Minuten). Andererseits konnten Extraktionen, in denen Celite 521 verwendet wurde, problemlos weiterverarbeitet werden, vermutlich auf Grund der höheren Diatomeen-Partikelgrösse im Verhältnis zu den SC-Partikeln. Die Na wurde in 70 µl TE-Puffer ohne RNAsin eluiert und Teile des Eluats (20 µl) wurden auf ein 1 %-iges Agarose-Gel gegeben.
Die Marker-Spuren enthalten 1 µl MMW-DNA. Für die folgenden Bakterien-Typen wurden Ergebnisse erhalten:
1 : Campylobacter pylori
2 : Yersinia enterolytica Typ 3
3 : Neisseria meningitidis
4 : Neisseria gonorrhoeae
5 : Haemophilus influenzae Typ B
6 : Klebsiella pneumoniae
7 : Salmonella typhimurium
8 : Pseudomonas aeroginosa
9 : Escherichia coli K1-083
Mit diesem Verfahren konnte HMW-DNA und rRNA aus Bakterien nachgewiesen werden.

ABSCHNITT G: DNA/RNA-Reinigung von Escherichia coli JM101

Gemäss dieser Erfindung ist die Isolierung von NA aus gram- negativen Bakterien möglich. In Bakterienzellen ist eine grosse Menge DNA mit hohem Molekulargewicht (HMW-DNA) und ribosomale RNA vorhanden. Beispiel G1 zeigt, dass NA aus Bakterienzellen unter Verwendung verschiedener chaotroper Substanzen mit Silica als NA- bindende feste Phase gereinigt werden kann.

Beispiel G1: NA-Isolierung/Reinigung (endogen) aus Bakterienzellen mit verschiedenen chaotropen Substanzen und Silica als NA-bindende feste Phase

NA wurde aus 50 µl einer bakteriellen JM101-Übernachtkultur in Gegenwart von 900 µl einer chaotropen Substanz und 40 µl SiO&sub2; isoliert. Die grosse Menge an HMW-DNA und endogener ribosomaler RNA (16S und 23S) erlaubt den Nachweis der isolierten NA durch UV- Belichtung Ethidiumbromid-gefärbter Gele. Die Isolierungen wurden gemäss Protokoll Y* durchgeführt und 25 % der eluierten NA (40 µl- Teile) wurden in einem Agarosegel analysiert. Tabelle G1: Relative Effizienz der BMW-DNA- und rRNA-Isolierung aus Bakterienzellproben unter Verwendung verschiedener chaotroper Substanzen in Kombination mit Silica

Legende:

Die Tabelle G1 fasst die Ergebnisse der Agarosegel-Analyse zusammen. Die Quantifizierung der HMW-DNA- und rRNA-Rückgewinnung wurde mit dem Verfahren verglichen, in dem GuSCN als chaotrope Substanz in Kombination mit Silica verwendet wurde: 1 in Tabelle G1 zeigt gleich effiziente DNA- oder RNA-Rückgewinnung. > 1 in Tabelle G1 zeigt bessere Rückgewinnung.
Die E. coli-RNA-Marker (Boehringer) wurden als Referenz für die Isolierung endogener RNA aus Bakterienzellen verwendet.

ABSCHNITT H: DNA-Reinigung mit alternativen festen Phasen , die fähig sind NA zu binden und Guanidiniumthiocyanat als chaotrope Substanz

Um zu zeigen, dass die NA-Reinigung/Isolierung mit GuSCN und verschiedenen Silica-Derivaten (siehe Material und Methoden) durchgeführt werden kann, wurde reines Plasmid in einem Niedrigsalzpuffer (Tris 10mM-EDTA 1 mM, pH 8,0) zugegeben und dann gemäss Protokoll Y isoliert; die Schritte 7 und 9 wurden jedoch ausgelassen (die Elution mit TE wurde nicht durchgeführt). Die Silica-Partikel mit der gebundenen NA wurden in die PCR-Reaktionsmischung gegeben. Die isolierte DNA kann mit dem PCR-Verfahren nachgewiesen werden. Beispiel H1 zeigt, dass die NA unter Verwendung alternativer fester Phasen in Kombination mit GuSCN als chaotrope Substanz gereinigt und mit dem PCR-Verfahren nachgewiesen werden kann.

Beispiel H1: DNA-Reinigung mit alternativen festen Phasen und GuSCN

In 50 µl Tris 10 mM/EDTA 1 mM, pH 8,8 vorhandene 0,5 µg pGEM3p24 wurde mit 80 µl einer Silicasuspension (siehe Material & Methoden) und 900 µl Lysispuffer L6 gemischt.
Nach dem Waschen und Trocknen bei 56 ºC gemäss dem Protokoll Y (kein Elutionsschritt) wurde das Pellet in 50 µl Wasser resuspendiert. Ein 20 µl-Anteil der Plasmid-Silica-Suspension wurde in der PCR-Mischung in Gegenwart von HIV-spezifischen Primern (Material & Methoden) verwendet, 5 µl eines 10x konzentrierten PCR-Puffers, 1 µl 10 mM dNTP, 2 Einheiten Taq-DNA-Polymerase und Wasser bis zu einem Endvolumen von 50 µl wurden zugegeben und die Amplifikationsreaktion wurde gestartet (1 Zyklus umfasste 1 Minute bei 95 ºC; 1 Minute bei 37 ºC und 3 Minuten bei 72 ºC).
Nach 30 Zyklen wurden den Reaktionsmischungen 10 µl-Aliquots entnommen und auf einem 2 %-igen Agarosegel analysiert. Die Isolierung der NA mit Latexpartikeln (als Vergleichstests) ergab keine Pellets wie bei der Isolierung der NA mit Silica. Tabelle H1: Nachweis isolierter DNA unter Verwendung alternativer fester Phasen in Kombination mit Guanidiniumthiocyanat als chaotrope Substanz unter Verwendung der PCR-Amplifikation und Gel-Analyse für den Nachweis

Legende:

Die Ergebnisse sind in Tabelle H1 zusammengefasst. Das erwartete 290 bp grosse Amplimer-Fragment wurde in allen Fällen nach 30 Zyklen beobachtet. Die Grösse der Fragmente wurde mit dem Marker bestehend aus einem φx 174 RF-DNA HaeII-Verdau (Pharmacia) verglichen, der ebenfalls auf das Gel geladen wurde.
++: zeigt den Nachweis des HIV-spezifischen 290 bp grossen Fragments in dem Agarosegel in gleicher Menge an, wie bei Verwendung von grobem Silica als fester Phase (Kontrolle).
+: zeigt eine nachweisbare Menge an 290 bp grossen Fragmenten an, weniger als in der Kontrolle mit dem groben Silica.

Claims

1. Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäure aus Nukleinsäure enthaltendem komplexem biologischem Ausgangsmaterial, gekennzeichnet durch Mischen des komplexen biologischen Ausgangsmaterials mit einer chaotropen Substanz und einer Nükleinsäure bindenden festen Phase, die Siliciumdioxid oder ein Derivat davon umfasst, Trennen der festen Phase mit der daran gebundenen Nukleinsäure von der Flüssigkeit, wonach die so erhaltenen feste Phase-Nukleinsäure- Komplexe gewaschen werden und falls erforderlich, die Nukleinsäure von den genannten Komplexen eluiert wird.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete komplexe biologische Ausgangsmaterial Gesamtblut, Blutserum, Buffy Coat, Urin, Faeces, Cerebrospinalflüssigkeit, Sperma, Speichel, ein Gewebe oder eine Zellkultur ist.

3. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet dass die verwendete chaotrope Substanz Guanidiniumsalz, Natriumjodid, Kaliumjodid, Natrium(iso)thiocyanat, Harnstoff oder gemeinsame Kombinationen davon ist.

4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Guanidiniumsalz Guanidinium(iso)thiocyanat ist.

5. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure bindende feste Phase Siliciumdioxid-Partikel umfasst.

6. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Siliciumdioxidpartikel eine Partikelgrösse von 0,1 - 500 Mikrometer haben.

7. Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Siliciumdioxidpartikel eine Partikelgrösse von 1 - 200 Mikrometer haben.

8. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-7, gekennzeichnet durch Trennen der resultierenden feste Phase-Nukleinsäure-Komplexe von der Flüssigkeit durch Sedimentation und Verwerfen des Überstands und anschliessendem Waschen der Komplexe mit einem eine chaotrope Substanz enthaltenden Waschpuffer.

9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase-Nukleinsäure-Komplexe, die mit Waschpuffer gewaschen wurden, weiterhin nacheinander mit einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln gewaschen und anschliessend getrocknet werden.

10. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die in den gewaschenen und getrockneten feste Phase-Nukleinsäure- Komplex enthaltene Nukleinsäure mit einem Elutionspuffer eluiert wird.

11. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die so erhaltenen feste Phase-Nukleinsäure-Komplexe in Kontakt mit einer Mischung gebracht werden, in der Komponenten vorhanden sind, um die Nukleinsäure, die entweder an die feste Phase gebunden oder davon eluiert ist, zu vermehren.