ES2085245T5 - Procedimiento de purificacion de acidos nucleicos. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para aislar ácido nucleico a partir de un material de partida biológico complejo que contenga ácido nucleico, caracterizado por la mezcla del material de partida biológico complejo, una sustancia caotrópica y una fase sólida que se une al ácido nucleico conteniendo sílice o un derivado de la misma, separando la fase sólida con el ácido nucleico unido a ella del líquido, después de lo cual los complejos fase sólida-ácido nucleico así obtenidos son lavados y, si se requiere, el ácido nucleico es eluido de dichos complejos, donde se selecciona el material de partida biológica de: sangre completa, suero sanguíneo, capa amarillenta, orina, heces, líquido cerebroespinal, esperma, saliva, tejidos y cultivos celulares, productos alimenticios, vacunas, leche infectada con un virus o una bacteria, material vegetal, bacterias gram positivas, levaduras, mohos, fluidos corporales y material biológico posiblemente infectado con virus o bacterias.
Description
Procedimiento de purificación de ácidos
nucleicos.
La invención se refiere a un proceso y a una
combinación de medios para aislar un ácido nucleico a partir de un
material de partida que contiene el ácido nucleico, así como a un
kit de ensayo para amplificar el ácido nucleico obtenido por dicho
proceso. Más en particular, la invención se refiere a un proceso y a
un kit para aislar un ácido nucleico a partir de un material
biológico que contiene el ácido nucleico, tal como sangre completa,
suero sanguíneo, capa amarillenta (la crusta phlogistica o fracción
de leucocitos de la sangre), orina, heces, líquido cerebroespinal,
esperma, saliva, tejidos, cultivos celulares y similares. El ácido
nucleico según es aislado del material biológico mencionado
anteriormente puede comprender también el ácido nucleico endógeno
del organismo del que deriva la muestra y cualquier ácido nucleico
foráneo (vírico, fúngico, bacteriano o de parásitos).
Los métodos conocidos para aislar un ácido
nucleico (AN) a partir de materiales de partida complejos como
sangre completa, suero sanguíneo, orina o heces comprenden
normalmente la lisis del material biológico por un detergente en
presencia de enzimas que degradan proteínas, seguido por varias
extracciones con disolventes orgánicos, por ejemplo, fenol y/o
cloroformo, precipitación con etanol y diálisis de los ácidos
nucleicos.
En Marko, M.A. y col., Analytical Biochemistry
121, 382-387, 1982 se describe un método en
el que ADN plasmídico es sometido a varias extracciones y a
tratamientos con detergente para lisar las células de las que se
obtiene el ácido nucleico plasmídico y para separar constituyentes
celulares así como otro material ácido nucleico. En una etapa
final, el ADN plasmídico puro es unido a polvo de vidrio en
presencia de una sustancia caotrópica. Estos métodos conocidos
para, por ejemplo, aislar ADN (de doble hebra) a partir de material
clínico son muy laboriosos y requieren mucho tiempo. El número
relativamente grande de etapas requeridas para purificar AN a
partir de tales materiales de partida incrementa el riesgo de
transmisión de AN de muestra a muestra en el procesamiento
simultáneo de varias muestras clínicas. Cuando se aísla el AN para
la detección posterior de la presencia de AN de, por ejemplo, un
patógeno (por ejemplo, un virus o una bacteria) por medio de un
método de amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo el más
sensible, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Saiki y
col., Science 230, 1985, 1350), el riesgo incrementado de tal
transmisión de AN entre muestras diferentes que causa resultados
positivos falsos es un serio inconveniente.
Un ejemplo de tal método conocido sensible a la
contaminación es el procedimiento descrito en Analytical
Biochemistry 162, 1987, 156 para aislar ARN total de tejidos
y cultivos celulares. De acuerdo con este método el ARN es sometido
a una única extracción con una mezcla ácida de tiocianato de
guanidinio-fenol-cloroformo a partir
del material biológico de partida. Después de la separación de
fases el ARN puede ser recuperado en una condición útil en 4 horas
por un procesamiento posterior de la fase acuosa.
En Analytical Biochemistry 162, 1987,
463, hay descrito un procedimiento para aislar ADN de tejidos y
líneas celulares, en el cual las células son dispersadas en un
tampón que contiene clorhidrato de guanidina y precipitadas con
etanol. Con este método conocido sensible a la contaminación puede
aislarse también un producto AN útil en pocas horas después de un
procesamiento posterior del ADN separado.
Estos procedimientos conocidos, sin embargo, no
pueden ser utilizados con éxito en materiales de partida complejos,
por ejemplo, sangre completa y suero sanguíneo.
Es un objeto de la invención proporcionar un
proceso que elimine los inconvenientes de los procesos
conocidos.
Más en particular, es un objeto de la invención
proporcionar un proceso con el que puede aislarse un ácido nucleico
(esto es, ADN y/o ARN) inmediatamente (sin pretratamientos) a partir
de materiales de partida complejos, tales como diferentes tipos de
materiales biológicos, de una manera sin precedentes rápida,
sencilla y reproducible, en condiciones tan intactas y con tan
elevada pureza que puede ser utilizado posteriormente como reactivo
en reacciones biológicas moleculares.
Es un objeto más de la invención proporcionar un
proceso que se diferencia de los procesos conocidos por un bajo
riesgo de contaminación comparado con otras muestras y personas,
esto es permite el procesamiento simultáneo de varias muestras
clínicas con un riesgo mínimo de transmisión de AN entre las
diferentes muestras, y significa también un riesgo lo más bajo
posible de contagio de las personas por virus o bacterias que pueden
estar presentes en las muestras que van a ser procesadas.
Estos objetos se llevan a cabo de acuerdo con la
invención por un procedimiento para aislar ácido nucleico a partir
de un material de partida biológico complejo que contenga ácido
nucleico, caracterizado por la mezcla del material de partida
biológico complejo, una sustancia caotrópica y una fase sólida que
se une al ácido nucleico conteniendo sílice o un derivado de la
misma, separando la fase sólida con el ácido nucleico unido a ella
del líquido, después de lo cual los complejos fase sólida-ácido
nucleico así obtenidos son lavados y, si se requiere, el ácido
nucleico es eluido de dichos complejos, donde se selecciona el
material de partida biológica de: sangre completa, suero
sanguíneo, capa amarillenta, orina, heces, líquido cerebroespinal,
esperma, saliva, tejidos y cultivos celulares, productos
alimenticios, vacunas, leche infectada con un virus o una bacteria,
material vegetal, bacterias gram positivas, levaduras, mohos,
fluidos corporales y material biológico posiblemente infectado con
virus o bacterias.
La invención arriba mencionada es aplicable a
cualquier material de partida que contenga ácidos nucleicos,
incluyendo alimentos y productos relacionados, vacunas y leche
infectada con un virus o una bacteria, la invención es
particularmente aplicable a un proceso en el que el material de
partida empleado es un material biológico que contiene ácidos
nucleicos, tal como sangre completa, suero sanguíneo, capa
amarillenta, orina, heces, líquido cerebroespinal, esperma, saliva,
tejidos y cultivos celulares (tales como cultivos de células de
mamífero y cultivos bacterianos). Sin embargo, algunos tipos de
materiales biológicos que contienen ácidos nucleicos, tales como
material vegetal, algunas bacterias gram positivas y algunas
levaduras y mohos, no pueden funcionar inmediatamente como material
de entrada en el proceso de acuerdo con la presente invención,
porque debido a su estructura de pared celular especial no lisan en
una sustancia caotrópica. Por tanto, tales materiales de partida
requieren un pretratamiento que convierta a las células en
accesibles, por ejemplo, una lisis celular precedente, después de
la cual el lisado resultante puede ser sometido al proceso de
acuerdo con la invención.
Con ácido nucleico (AN) se alude a ADN y ARN,
ambos en cualquier configuración posible, esto es en forma de ácido
nucleico de doble hebra (dh), o en forma de ácido nucleico de hebra
sencilla (hs), o como una combinación de los mismos (en parte de dh
o de hs).
Es esencial de acuerdo con la invención la
utilización de una fase sólida que se una a ácidos nucleicos, esto
es partículas de sílice capaces de unirse al AN en presencia de una
sustancia caotrópica. Por sílice se alude a cristales de SiO_{2}
y otras formas de óxido de silicona, tales como esqueletos de
diatomeas construidos de SiO_{2}, óxido de silicona amorfo y
polvo de vidrio. Son también adecuados como fase sólida que se une
a ácidos nucleicos de acuerdo con la invención alquilsílice,
silicato de aluminio (zeolita) o sílice activada con -NH_{2}.
En lo que se refiere a la utilización de
partículas de sílice, se sabía de PNAS 76, 1979, 615, que
ADNdh en una solución altamente concentrada de la sal caotrópica
NaI (yoduro de sodio) puede ser liberado de la agarosa y puede ser
unido a vidrio. Esta publicación describe dos procedimientos para
aislar ADN de un gel de agarosa, ambos utilizan en una primera
etapa una solución de NaI para disolver la agarosa. En un
procedimiento el ADN es precipitado en una segunda etapa con
acetona, mientras que según el otro procedimiento el ADN es unido
en una segunda etapa a partículas de vidrio y es luego eluido en un
tampón acuoso. Este método, sin embargo, no tiene utilidad para
materiales de partida más complejos, tales como fluidos corporales y
otros materiales biológicos de partida. En este artículo no hay
tampoco una descripción de un procedimiento de una etapa de acuerdo
con la invención.
Es recomendable de acuerdo con la invención
utilizar partículas de sílice que tengan un tamaño de partícula
seleccionado adecuadamente de modo que se obtiene inmediatamente un
grado elevado de pureza del ácido nucleico unido y posteriormente
eluido a partir de un material de partida impuro.
Una realización preferida de la invención se
caracteriza por la utilización de partículas de sílice que tienen
un tamaño práctico oscilando sustancialmente entre 0,05 y 500
\mum. Por el término "sustancialmente" se quiere representar
que el 80% o más, preferiblemente más del 90%, de las partículas de
sílice están dentro del rango de tamaño de partícula definido. Con
el fin de asegurar un procesamiento fácil del AN unido, se prefiere
que las partículas de sílice empleadas tengan un rango de tamaño de
partícula sustancialmente entre 0,1 y 200 \mum, mientras que se
prefiere mayormente un proceso en el que las partículas de sílice
empleadas tengan un tamaño de partícula que oscile sustancialmente
entre 1 y 200 \mum. Es cierto que la capacidad de unirse a AN de
las partículas de sílice es más grande a medida que las partículas
son más pequeñas, pero especialmente en el caso de un material de
entrada rico en AN y en el caso de moléculas de AN relativamente
largas, la utilización de partículas de sílice extremadamente
pequeñas tendría como resultado el que los complejos
AN-sílice formados ya no puedan ser redispersados
eficazmente. Esto significa que el AN unido no puede ser recuperado
de los complejos en forma pura. Cuando se utiliza sangre humana como
material de entrada, este problema ocurre algunas veces si se
utiliza una sílice no fraccionada con tamaños de partícula en el
rango de 0,2-10 \mum. La formación de agregados
que ya no pueden ser redispersados puede evitarse utilizando una
sílice fraccionada, cuyo tamaño de partícula esté en el rango de
1-10 \mum. Cuando se utiliza un material de
entrada rico en células, tal como cultivos bacterianos, se encuentra
sin embargo, que la utilización de una fracción de sílice tan
gruesa no es suficiente para evitar la formación de agregados
difícilmente redispersables y se obtienen resultados óptimos si se
utiliza una sílice incluso más gruesa, tal como una tierra de
diatomeas teniendo tamaños de partícula en el rango de
2-200 \mum.
De acuerdo con la invención es esencial utilizar
una sustancia caotrópica además de la fase sólida que se une a
ácidos nucleicos mencionada anteriormente tal como partículas de
sílice. Por sustancia caotrópica se quiere representar cualquier
sustancia capaz de alterar la estructura secundaria, terciaria y/o
cuaternaria de proteínas y ácidos nucleicos, pero que deja intacta
al menos la estructura primaria. Ejemplos de las mismas son
(iso)tiocianato de guanidinio y clorhidrato de guanidina.
También yoduro de sodio, yoduro de potasio, (iso)tiocianato
de sodio, urea o combinaciones mutuas con los mismos son muy
adecuados en combinación con fases sólidas que se unen a los ácidos
nucleicos para el aislamiento de AN a partir de un material de
partida que contenga ácidos nucleicos. De acuerdo con la invención
la sal de guanidinio caotrópica empleada es preferiblemente
tiocianato de guanidinio (GuSCN).
El proceso de acuerdo con la invención se
llevará a cabo normalmente de tal forma que el material de partida
es mezclado con cantidades suficientemente grandes de la sustancia
caotrópica, por ejemplo sal de guanidinio y por ejemplo partículas
de sílice, para liberar esencialmente todo el ácido nucleico
presente en el material de partida y unirlo a dichas partículas de
sílice. Un protocolo adecuado es, por ejemplo, la adición de una
suspensión de partículas de sílice a una solución tamponada de GuSCN
presente en un recipiente de reacción, seguido por la adición de la
muestra y un mezclado completo. Posteriormente tendrá lugar la lisis
de las células y opcionalmente de los virus presentes, y el AN que
se libera se unirá a las partículas de sílice casi instantáneamente.
Los complejos sílice-ácido nucleico resultantes serán luego
separados del líquido, por ejemplo, por sedimentación rápida
(centrifugación) y eliminación del sobrenadante (por ejemplo, por
succión) y posteriormente los complejos (por ejemplo, en forma de
una pella de sílice-ácido nucleico) serán lavados (redispersión u
homogeneización), por ejemplo, con un tampón de lavado conteniendo
una sal de guanidinio caotrópica utilizando, por ejemplo, un
mezclador vórtex, y sedimentados de nuevo. Preferiblemente, los
complejos sílice-ácido nucleico lavados con el tampón de lavado son
lavados posteriormente sucesivamente con una solución de
alcohol-agua (más preferiblemente con etanol al 70%
aproximadamente para limitar las pérdidas en el rendimiento) y con
acetona, seguido por secado para eliminar la acetona (por ejemplo,
mientras se calientan). Posteriormente el AN presente en los
complejos de sílice-ácido nucleico lavados y secados es eluido por
medio de un tampón de elución acuoso. La selección del tampón de
elución está codeterminada por la utilización del AN aislado
contemplada. Ejemplos de tampones de elución adecuados son el
tampón TE, agua bidestilada y tampón para PCR (ver la parte
"Materiales y Métodos"). Preferiblemente, todas estas etapas
se llevan a cabo en un único recipiente de reacción (por ejemplo,
en un tubo de polipropileno Eppendorff de 1,5 ml), y el AN
purificado es recuperado en un volumen relativamente pequeño, por
ejemplo menos de 100 \mul. El AN así aislado está libre de enzimas
que degradan ácidos nucleicos y tiene una pureza tan elevada que
puede servir inmediatamente como sustrato para diferentes enzimas,
tales como ADN polimerasas (por ejemplo, ADN polimerasa-Taq),
enzimas de restricción de ADN, ADN ligasa y transcriptasa inversa
(tal como la transcriptasa inversa de VMA).
En el proceso de acuerdo con la invención, por
ejemplo, una cantidad suficiente de AN puede ser aislada a partir
de 50 \mul de sangre completa sin una separación previa de plasma
y células, en 45 minutos aproximadamente para demostrar las
secuencias del AN por medio de un método de amplificación tal como
el método de PCR o el método llamado NASBA según está descrito en
EP 0329822 (NASBA = amplificación basada en la secuencia del ácido
nucleico). La invención sin embargo, es también aplicable a otros
materiales biológicos diferentes que contengan AN, tales como
suero, heces, orina, etc. Por esta razón la invención es útil en el
diagnóstico de infecciones bacterianas y víricas, así como en un
estudio de polimorfismos génicos dentro del ámbito del diagnóstico
prenatal y del diagnóstico de la predisposición a tumores
hereditarios.
En el método de aislamiento de AN de acuerdo con
la invención el riesgo de contaminación es muy bajo, debido a que
el procedimiento completo puede llevarse a cabo en un único
recipiente de reacción y el AN liberado del material de partida
crudo en la primera etapa del proceso está al menos unido en su
mayoría a la fase sólida durante todo el procedimiento de
purificación posterior. Los riesgos para el personal, inherentes al
procesamiento de material posiblemente infectado con virus o
bacterias, quedan limitados esencialmente a la primera etapa del
procedimiento de aislamiento en la que la muestra es colocada en el
recipiente de reacción. En este primer tratamiento los patógenos
presentes potencialmente son inactivados eficazmente. El proceso no
requiere un equipamiento periférico especial (un mezclador vórtex,
una centrífuga del tipo Eppendorff de 12.000 g y un baño de agua o
un bloque de calentamiento Eppendorff pertenecientes al equipo
estándar de laboratorio) y no requiere un conocimiento bioquímico
especialista, de tal forma que el proceso es muy adecuado para el
aislamiento de AN de rutina a partir de grandes números de muestras,
en otras palabras, para automatización. Por el proceso de acuerdo
con la invención pueden procesarse más de 10 e incluso 24 o más
muestras diferentes en 1 hora aproximadamente.
La invención no sólo se refiere a un proceso
para aislar ácidos nucleicos a partir de un material de partida que
contenga ácidos nucleicos, sino para amplificar la obtención de
ácido nucleico por dicho proceso.
En una realización, una combinación de medios
para uso en el proceso de la invención comprende (a) un tampón de
lisis que contiene (iso)tiocianato de guanidinio, (b) una
suspensión acuosa de partículas de sílice teniendo un tamaño de
partícula que oscila sustancialmente entre 0,05 y 500 \mum,
preferiblemente entre 0,1 y 200 \mum y más preferiblemente entre
1 y 200 \mum, (c) un tampón de lavado conteniendo
(iso)tiocianato de guanidinio, y si se requiere (d) un
tampón de elución.
De este modo, una combinación de medios para uso
en el proceso de la invención puede estar compuesta de, por
ejemplo, los 4 componentes siguientes:
- componente 1:
- una solución tamponada de (iso)tiocianato de guanidinio;
- componente 2:
- una suspensión de partículas de sílice;
- componente 3:
- un tampón de lavado; y (opcionalmente)
- componente 4:
- un tampón de elución.
Si se requiere, los componentes 1 y 2 podrían
combinarse, lo cual, sin embargo, conduce a una vida de
almacenamiento limitada.
Otros reactivos que son utilizados
preferiblemente en el método del aislamiento de AN de acuerdo con la
invención, tales como etanol y acetona, pertenecen al equipamiento
estándar del laboratorio.
\newpage
Se ilustrará ahora la invención por varios
ejemplos. En la parte precedente se describirán los materiales y
métodos empleados.
Se utilizó dióxido de silicona (SiO_{2}),
suministrado por Sigma, teniendo una distribución de tamaños de
partícula de 0,5-10 \mum, el 80% de las cuales
oscilaba entre 1 y 5 \mum.
Se suspendieron 60 g de sílice en agua
bidestilada (hasta un volumen de 500 ml) en una probeta que tenía un
diámetro de 5 cm; la altura de la columna acuosa era de 27,5 cm.
Después de una sedimentación a 1x g durante 25 horas a temperatura
ambiente el sobrenadante se retiró por succión, hasta que quedaron
70 ml. Se añadió agua bidestilada hasta 500 ml, y las partículas
fueron resuspendidas agitando la probeta. Después de una
sedimentación a 1x g durante 5 horas el sobrenadante se eliminó por
succión, hasta que quedaron 60 ml. Después de la adición de 600
\mul de HCl al 32% (p/v) las partículas fueron resuspendidas por
agitación en vórtex. La suspensión se preparó en alícuotas de 4 ml
en botellas de 6 ml, que fueron cerradas herméticamente y calentadas
en un autoclave a 121ºC durante 20 minutos. Este protocolo de
sedimentación condujo a un enriquecimiento de las partículas de
sílice más grandes, esto es las partículas que tenían un tamaño de
partícula por encima de 1 \mum, según fue establecido por un
examen con microscopio electrónico. Además, el tratamiento en
autoclave de una suspensión de sílice ácida (pH 2 aproximadamente)
tiene como resultado el que el ácido nucleico opcionalmente
presente es degradado completamente. La suspensión de Sílice Gruesa
así obtenida será referida de aquí en adelante como
SG.
SG.
La sílice fue derivatizada con silicondióxido de
metilacrilamida que tenía colas de alquilo con una longitud de 2 a
18 átomos de C. El tamaño de las partículas de sílice derivatizadas
variaba desde 63 hasta 200 \mum. El tamaño de poro de las
partículas utilizadas era de 500 Å. Estos derivados de sílice (12
MAAMC_{2}-C_{18}) fueron suministrados por
Diosynth, Oss.
Para el aislamiento de AN (ejemplo H1) se
suspendieron 0,5 g de las partículas de sílice derivatizadas en 1
ml de agua bidestilada. Estas suspensiones de sílice fueron
pretratadas con 120 \mul de HCl al 32% (p/v) durante 30 minutos a
90ºC.
Se preparó tampón L2 (Tris.Cl 0,1 M pH 6,4)
disolviendo 12,1 g de Tris (Boehringer) en 800 ml de agua
bidestilada, añadiendo 8,1 ml de HCl al 37% (p/v) y llevando el
volumen a 1 litro con agua bidestilada.
El líquido de lavado L2 fue preparado
disolviendo 120 g de GuSCN (tiocianato de guanidina de Fluka) en 100
ml de tampón L2.
El líquido de la lavado L2* fue preparado
disolviendo 12,45 g de KI (yoduro de potasio de Merck) en 25 ml de
tampón L2.
Para preparar una sustancia caotrópica basada en
NaI, se disolvieron 11,25 g de NaI (yoduro de sodio de Merck) en 25
ml de tampón L2. Para una sustancia caotrópica basada en tiocianato
de sodio, se disolvieron 6,1 g de NaSCN (Baker) en 25 ml de tampón
L2.
Para preparar una sustancia caotrópica
conteniendo KI y urea (8 M) se disolvieron 12,45 g de KI y 12,0 g de
urea en tampón L2 (25 ml). De forma similar se prepararon
sustancias caotrópicas combinando urea con NaI y urea con
NaSCN.
El tampón de lisis L5 fue preparado a partir de
100 ml de tampón L2 disolviendo en ellos 120 g de GuSCN (agitando
suavemente en un baño de agua caliente a 60ºC aproximadamente),
añadiendo luego 26,0 g de una solución de Dextran sulfato al 40%
(p/v) (Pharmacia LKB), 22 ml de EDTA 0,2 M pH 8, y 2,6 g de Triton®
X-100 (Packard), y homogeneizando posteriormente la
solución. La solución de EDTA 0,2 M pH 8 fue preparada disolviendo
37,2 g de EDTA (Titriplex de Merck) y 4,4 g de NaOH (Merck) en 500
ml de agua.
\newpage
El tampón de lisis L6 fue preparado a partir de
100 ml de tampón L2 disolviendo en ellos 120 g de GuSCN (agitando
suavemente en un baño de agua a 60ºC), añadiendo luego 22 ml de EDTA
0,2 M pH 8, y 2,6 g de Triton® X-100 (Packard) y
homogeneizando posteriormente la solución.
El tampón de lisis L6* fue preparado a partir de
25 ml de tampón L2 disolviendo en ellos 12,45 g de KI (yoduro de
potasio, Merck) (agitando suavemente en un baño de agua a 40ºC)
añadiendo posteriormente 5,5 ml de EDTA 0,2 M (pH 8,0) y 0,65 g de
Triton® X-100 (Boehringer 789704) y homogeneizando
finalmente la solución. El mismo procedimiento fue aplicado para el
tampón de lisis L6* con NaI (yoduro de sodio, Merck) y para el
tampón de lisis L6* con NaSCN (tiocianato de sodio, Baker).
El tampón de lisis L6* en combinación con KI y
urea fue preparado a partir de 25 ml de tampón L2 disolviendo en
ellos 12,45 g de KI (yoduro de potasio, Merck) y 12,0 g de urea
(Gibco BRL). Posteriormente se añadieron 5,5 ml de EDTA 0,2 M (pH
8,0) y 0,65 g de Triton® X-100 (Boehringer) y se
homogeneizó la mezcla. Se siguió el mismo método para la
preparación de NaI/urea y NaSCN/urea.
Por GEDTA se quiere representar una solución de
120 g de GuSCN en 100 ml de EDTA 0,2 M pH 8.
Un tampón adecuado para la elución es una
solución de Tris.Cl 10 mM, EDTA 1 mM con pH 7,5 (tampón TE),
conteniendo si se desea 0,5 U/\mul de RNasin (Promega).
Los tubos de ensayo fueron preparados el mismo
día que el procedimiento de extracción añadiendo 900 \mul de
tampón de lisis y 40 \mul de una sílice transportadora de AN, tal
como SG (suspensión de Sílice Gruesa) o tierra de diatomeas a tubos
de centrífuga Eppendorff (tipo 3810, 1,5 ml).
Una pella es lavada añadiendo 1 ml de líquido de
lavado, agitando posteriormente en un vórtex hasta que la pella se
resuspenda, centrifugando durante 15 segundos a 12000x g, y
retirando el sobrenadante por succión.
La elución tiene lugar añadiendo al menos 25
\mul, preferiblemente al menos 40 \mul de tampón de elución,
agitando en vórtex brevemente (2 segundos) e incubando durante 10
minutos a 56ºC.
Este protocolo es adecuado para aislar ADNdh a
partir de materiales de partida complejos, tales como suero humano,
sangre completa, heces acuosas u orina y utiliza tubos de ensayo
Eppendorff con 900 \mul de GEDTA y 40 \mul de SG.
- 1.
- Agitar en vórtex el tubo de ensayo hasta que se resuspenda la pella.
- 2.
- Añadir 50 \mul de material de partida (por ejemplo, suero, sangre completa, heces u orina) y agitar en vórtex inmediatamente hasta que esté homogéneo (5-10 segundos).
- 3.
- Dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos y agitar en vórtex 5 segundos.
- 4.
- Centrifugar durante 15 segundos a 12000x g y retirar el sobrenadante por succión.
- 5.
- Lavar la pella una vez con GEDTA.
- 6.
- Lavar la pella dos veces con etanol al 70%.
- 7.
- Lavar la pella una vez con acetona.
- 8.
- Secar la pella durante 10 minutos a 56ºC con la tapa abierta.
- 9.
- Eluir el ADN con 50 \mul de tampón TE sin RNasin.
- 10.
- Centrifugar durante 2 minutos a 12000x g; el sobrenadante contiene ADN.
Este protocolo es adecuado para aislar AN
(purificación simultánea de ADNdh, ADNhs, ARNdh y ARNhs) a partir
de materiales de partida complejos, tales como suero humano, sangre
completa, heces acuosas u orina y utiliza tubos de ensayo
Eppendorff con 900 \mul de L6 y 40 \mul de SG.
- 1.
- Agitar en vórtex el tubo de ensayo hasta que se resuspenda la pella.
- 2.
- Añadir 50 \mul de material de partida (suero, sangre completa, heces u orina) y agitar en vórtex inmediatamente hasta que esté homogéneo (5 segundos aproximadamente).
- 3.
- Dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos y agitar en vórtex 5 segundos.
- 4.
- Centrifugar durante 15 segundos a 12000x g y retirar el sobrenadante por succión.
- 5.
- Lavar la pella dos veces con L2.
- 6.
- Lavar la pella dos veces con etanol al 70%.
- 7.
- Lavar la pella una vez con acetona.
- 8.
- Secar la pella durante 10 minutos a 56ºC con la tapa abierta.
- 9.
- Eluir el AN con 50 \mul de tampón TE, opcionalmente en presencia de RNasin.
- 10.
- Centrifugar durante 2 minutos a 12000x g; el sobrenadante contiene AN.
Este protocolo es adecuado para aislar AN a
partir de materiales de partida complejos, tales como suero humano,
orina o cultivos bacterianos.
Procedimiento:
Se utilizaron tubos Eppendorff con 900 \mul de
L6* y 40 \mul de SG.
- 1.
- Agitar en vórtex el tubo de ensayo hasta que se resuspenda la pella.
- 2.
- Añadir 50 \mul de material de partida (mezclas suero-plásmido, orina-plásmido o cultivo bacteriano de una noche) y agitar en vórtex inmediatamente hasta que esté homogéneo (5 segundos).
- 3.
- Dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos mientras se mezcla.
- 4.
- Centrifugar durante 15 segundos a 14.000 g, retirar el sobrenadante por succión.
- 5.
- Lavar la pella dos veces con líquido de lavado L2*.
- 6.
- Lavar la pella dos veces con etanol al 70%.
- 7.
- Lavar la pella una vez con acetona.
- 8.
- Secar la pella durante 10 minutos a 56ºC con la tapa abierta.
- 9.
- Eluir el AN con 50 \mul de tampón TE (Tris 10 mM-EDTA 1 mM pH 8,0) opcionalmente en presencia de RNasin.
- 10.
- Centrifugar durante 2 minutos a 14.000 g; el sobrenadante contiene AN.
Este protocolo es adecuado para aislar AN a
partir de materiales de partida complejos, tales como suero humano,
sangre completa, heces acuosas u orina y utiliza tubos de ensayo
Eppendorff con 900 \mul de L5 y 40 \mul de SG. El AN aislado
puede ser utilizado para reacciones de hibridación pero es menos
adecuado como sustrato para enzimas de restricción. La ADN ligasa
T4, sin embargo, es activa. Comparado con el protocolo Y, este
protocolo Z conduce a un mayor rendimiento de AN.
- 1.
- Agitar en vórtex los tubos de ensayo hasta que se resuspenda la pella.
- 2.
- Añadir 50 \mul de material de partida (suero, sangre completa, heces u orina) y agitar en vórtex inmediatamente hasta que esté homogéneo (5 segundos aproximadamente).
- 3.
- Dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos y agitar en vórtex 5 segundos.
- 4.
- Centrifugar durante 15 segundos a 12000x g y retirar el sobrenadante por succión.
- 5.
- Lavar la pella dos veces con L2.
- 6.
- Lavar la pella dos veces con etanol al 70%.
- 7.
- Lavar la pella una vez con acetona.
- 8.
- Secar la pella durante 10 minutos a 56ºC con la tapa abierta.
- 9.
- Eluir el AN con 50 \mul de tampón TE, opcionalmente en presencia de RNasin.
- 10.
- Centrifugar durante 2 minutos a 12000x g; el sobrenadante contiene AN.
Los ejemplos están divididos en secciones según
sigue, inter alia (secciones A-D) de acuerdo con la
naturaleza del material de partida:
- sección A:
- suero humano
- sección B:
- sangre completa humana
- sección C:
- orina humana
Estas secciones A, B y C están dirigidas
especialmente para mostrar que ADNdh y ARNhs pueden ser aislados
ambos en forma pura.
- sección D:
- heces humanas
Esta sección D muestra, entre otras cosas, que
el ARNdh puede ser también aislado.
- sección E:
- ADN de hebra sencilla
Esta sección E comprende experimentos que
muestran que la invención puede ser utilizada para aislar ADNhs.
- sección F:
- tierra de diatomeas
Esta sección F muestra que los esqueletos de
diatomeas son muy útiles como partículas de sílice para ser
utilizadas de acuerdo con la invención. Se muestra también que la
invención puede ser utilizada para aislar AN de diferentes
bacterias gram negativas.
La sección G muestra que puede ser purificado AN
a partir de células bacterianas utilizando diferentes sustancias
caotrópicas.
La sección H e I muestran el aislamiento de ADN
con la ayuda de fases sólidas alternativas.
Siempre se utilizó una cantidad de 50 \mul. La
sangre utilizada en la sección B y F era siempre sangre fresca
extraída en presencia de EDTA para impedir la coagulación
(utilizando el sistema Venoject de Terumo N.V., Louvain, Bélgica,
tubos colectores del tipo VT-574 TKZ). Los
materiales de partida utilizados en las otras secciones (suero,
orina y heces) estaban congelados. En los ejemplo A1, A2, A3, B1,
B2, B5, B7 y F1 el suero o sangre era del mismo sujeto.
Para el examen electroforético en gel, parte de
la cantidad eluida de AN fue cargada en un gel de agarosa neutra
conteniendo 1 \mug/ml de bromuro de etidio en el sistema de
tampones descrito por Aaij y Borst (Biochim. Biophys. Acta
269, 1972, 192). Las fotografías se tomaron bajo iluminación
UV del gel.
En algunos experimentos se añadió una cantidad
conocida de ADN purificado (ADN de entrada) a la muestra clínica.
En estos casos una cantidad de ADN de entrada correspondiente a una
eficacia de extracción del 100% fue también cargada en el mismo
gel.
ADN plasmídico bacteriano fue purificado según
está descrito por Ish-Horowicz y Burke (Nucleic
Acids Res. 9, 1981, 2989) de Escherichia coli HB101, seguido
por cromatografía en columna con Sepharosa® CL 2B (Pharmacia, Inc.)
y precipitación con etanol. ADN plasmídico bacteriano fue purificado
a partir de Escherichia coli JM101 (J. Messing, Rec. DNA
Techn. Bull. 2:43-48 (1979)) según está
descrito por Birnboim y Doly (Maniatis, T. y col., Molecular
Cloning, CHS, New York). El pCMV-E contiene un
fragmento de ADN de citomegalovirus humano de 0,4 kb clonado en el
vector pHC 624 de 2 kb (Boros en Gene 30, 1984, 257); el
pEBV-10 contiene un fragmento de ADN del virus de
Epstein Barr de 0,9 kb clonado en el mismo vector. Para obtener una
preparación de plásmido enriquecida para las moléculas circulares
relajadas (CII), el ADN de pEBV-10 (2,9 kb) fue
tratado con ADNasa I. Las moléculas del componente II sirven como
modelo para la purificación del ADN del virus de la Hepatitis B que
está presente en viriones como una molécula de ADN circular relajado
de 3,2 kb.
El pGem3p24 contiene una secuencia del VIH de
1,45 kb; la construcción de pGem3p24 se describe posteriormente.
La secuencia del ADN de VIH HxB2 ha sido
descrita por varios autores (J. Virol. 61,
633-637 (1987); Nature 326,
711-713 (1987); Aids Res. Hum. Retrovirus 3,
41-45 (1987); Aids Res. Hum. Retrovirus 3,
33-39 (1987) y Science 237,
888-893 (1987)).
El ADN de VIH HxB2 fue cortado parcialmente con
FokI en los sitios 1189 y 2613 de la secuencia original del VIH
HxB2. Los números de los nucleótidos se refieren a la designación
del Genebank.
Los sitios de FokI de este fragmento fueron
rellenados utilizando ADN polimerasa Klenow (Maniatis, vide
supra) y clonados (Maniatis, vide supra) en el sitio de
SmaI del poliadaptador del plásmido pUC-19. El
plásmido resultante que lleva el fragmento de ADN del VIH HxB2 se
denominó pUC19-p24.
Para obtener el plásmido pGem3p24, el fragmento
EcoRI-BamHI de 1450 pb de pUC19-p24
fue clonado en el vector pGem3 (2867 pb; Promega Corporation,
Madison, EE.UU.) digerido con EcoRI-BamHI.
Los cebadores utilizados en el métodos de PCR
fueron sintetizados en un aparato sintetizador de oligos (de
Applied Biosystem). Las secuencias de nucleótidos de los cebadores
ES47 (25 mero) y ES75 (47 mero) se dan a continuación.
En la mayoría de los experimentos de aislamiento
de ARN (ejemplos A3, B5, B6, B7, C2, D1, E1, F1 y F2) no se tomaron
más precauciones que la utilización opcional de RNasin en el tampón
de elución para evitar la degradación del ARN durante el
procedimiento de purificación. Sólo se llevaron guantes durante la
adición de las muestras clínicas a los tubos de ensayo; no se
utilizaron inhibidores de ARNasa para la preparación de los
reactivos; y se utilizaron recipientes y puntas de pipeta
Eppendorff no autoclavados. Los ejemplos F1 y F2, entre otros, han
mostrado que la presencia de ARNasin durante la elución no es
estrictamente necesaria.
Los enzimas utilizados estaban disponibles
comercialmente y se emplearon según estaba recomendado por el
fabricante. Todos los enzimas de restricción, así como la RNasa A,
la ligasa T4 la transcriptasa inversa de VMA eran de Boehringer
(Mannheim). La ADN polimerasa-Taq era de Cetus Inc. Las
reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se realizaron con un
ciclador térmico de ADN Perkin Elmer Cetus.
Para las diferentes utilizaciones es de esencial
importancia que los reactivos utilizados en el proceso de acuerdo
con la invención, especialmente el transportador de AN (por ejemplo
partículas de sílice) y los tampones de lisis y de lavado que
contienen la sustancia caotrópica, no estén impurificados por ácido
nucleico (por ejemplo, por bacterias o virus que contienen AN).
Esto puede ser asegurado para el transportador de AN calentándolo
en un autoclave durante 20 minutos a 121ºC. Sin embargo, este método
no es útil en los tampones de lisis y de lavado que contienen GuSCN
(GEDTA, L5, L6 y L2), por la razón de una posible pérdida de
actividad y debido al riesgo concomitante para el entorno. Con el
fin de hacer a estos reactivos (en tanto como sea posible) libres
de ácidos nucleicos, pueden ser pasados a través de una columna de
partículas de sílice de acuerdo con la invención. Debido a las
propiedades líticas de los tampones que contienen GuSCN y a la
propiedad de la sílice para unirse a AN en presencia de la
sustancia caotrópica GuSCN, tal procedimiento conduce a un tampón
libre de AN. La propia columna puede hacerse libre de ácidos
nucleicos calentándola durante, por ejemplo, una o más horas a, por
ejemplo, 500ºC o más.
- CI
- : ADN circular cerrado covalentemente (plásmido)
- CII
- : ADN circular relajado (cortado) (plásmido)
- CIII
- : ADN lineal (plásmido linealizado)
- LMW
- : ADN de bajo peso molecular (< 0,5 kb); digesto de pHC 624 con HpaII, fragmentos de 471 pb, 404 pb, {}\hskip0,1cm 242 pb (2 fragmentos), 190 pb, 147 pb, 110 pb, 67 pb y algunos fragmentos más pequeños de longitudes {}\hskip0,1cm no determinadas.
- MMW
- : ADN de peso molecular medio (0,5-29 kb); digesto del ADN del fago lambda con HindIII, fragmentos de {}\hskip0,1cm 23 kb, 9,4 kb, 6,7 kb, 4,4 kb, 2,3 kb, 2,0 kb y 0,56 kb.
- HMW
- : ADN de alto peso molecular (> 29 kb).
- ADNhs
- : ADN de hebra sencilla del fago M13mp9 (Boehringer).
Sección
A
En el suero humano puede estar presente AN, por
ejemplo en virus o bacterias. Estos organismos pueden presentarse
en forma libre y también unidos a complejos inmunes. Las cantidades
de AN son normalmente tan bajas que la detección mediante
electroforesis en gel de agarosa e iluminación con UV de los
complejos bromuro de etidio/AN es imposible. Para mostrar que puede
purificarse ADN a partir de suero humano, se añadieron cantidades
del orden de microgramos de ADN purificado al suero, y
posteriormente se aisló el ADN de acuerdo con el protocolo B
(ejemplos A1 y A2). Para mostrar que ADN y ARN pueden ser
purificados simultáneamente a partir de suero humano, se añadieron
al suero células de mamífero cultivadas o bacterias (que llevaban un
pequeño plásmido), y luego se aisló el AN según el protocolo Y
(ejemplo A3). Finalmente, el ejemplo 4, muestra que, con el
protocolo Y, el ARN presente en suero humano puede ser purificado a
partir de VIH (Virus de la Inmunodeficiencia Humana) y puede ser
detectado por el método de PCR. El ejemplo A5 muestra que, con el
protocolo Y*, el ADN del suero humano puede ser purificado
utilizando varias sustancias caotrópicas en combinación con sílice
como fase sólida que se une al ácido nucleico.
Ejemplo
A1
Se mezcló suero humano (500 \mul) con
cantidades conocidas de ADN purificado [100 \mul de LMW (45
\mug), 20 \mul de MMW (20 \mug), 40 \mul de CI/II (20
\mug)] y se utilizaron 10 muestras de 66 \mul como material de
entrada para 10 extracciones de ADN según el protocolo B. La
cantidad de SG (suspensión de Sílice Gruesa) presente en los tubos
de ensayo fue variada en este experimento entre 2,5 y 40 \mul. Las
extracciones se levaron a cabo por duplicado y la mitad (30 \mul)
del ADN eluido de cada muestra fue sometida a electroforesis a
través de un gel de agarosa al 1%. Para comparación, la mitad de la
cantidad de los ADNs de entrada se cargó también en el mismo gel en
las calles control.
ADN de doble hebra, lineal (oscilando desde 23
kb hasta aproximadamente 60 pb), cerrado covalentemente (CI) y ADN
circular relajado (CII) eran aislados eficazmente si la cantidad de
SG excedía de 10 \mul. El rendimiento del fragmento de MMW más
grande (23 kb aproximadamente) parece relativamente bajo cuando se
compara con los fragmentos más pequeños, lo que en vista de otros
experimentos, puede ser atribuido al corte de fragmentos de alto
peso molecular.
Las calles control muestran respectivamente la
cantidad de ADN LMW, CII/CI y MMW que podría encontrarse en una
eficacia de extracción del 100%. Según se expuso previamente, un
plásmido (pEBV-10) de 3 kb rico en CII (tratado con
ADNasa I) fue utilizado como material de entrada.
Ejemplo
A2
Se añadieron preparaciones de ADN purificado a
12 muestras de suero humano de 50 \mul. Se aisló ADN a partir de
estas 12 mezclas de acuerdo con el protocolo B; la elución fue
efectuada con 50 \mul de TE. La mitad del ADN eluido fue tratada
(por duplicado) con uno de los tres enzimas de restricción
siguientes: EcoRI, BamHI y BglII (éstos son
activos en tampones con bajo contenido de sal, medio contenido de
sal y elevado contenido de sal, respectivamente), o bien fue
tratada con ADN ligasa T4, o no fue tratada. Las muestras de ADN
fueron sometidas a electroforesis a través de un gel de agarosa al
1% y visualizadas por iluminación UV.
Los resultados del tratamiento con la ligasa T4
(1 hora a 37ºC, 3 unidades de ligasa T4 en un volumen de reacción
de 30 \mul) muestran un desplazamiento del peso molecular de los
fragmentos de ADN e indican que el ADN aislado del suero humano no
es afectado significativamente por degradación exonucleolítica.
Los resultados para 8 muestras de suero a las
que se añadió un plásmido purificado (pCMV-E; 3,3
\mug; 1,5 \mul) muestran respectivamente que para los digestos
de EcoRI, BamHI y BglII todos los enzimas de
restricción linealizaron el plásmido. Todas las incubaciones con
los enzimas de restricción fueron realizadas en un volumen de
reacción de 30 \mul durante 1 hora a 37ºC con 9 unidades de
enzima.
Ejemplo
A3
Debido a que en el suero humano están presentes
solamente niveles muy bajos de ARN (por ejemplo, en virus,
bacterias o células) que no son detectables por iluminación UV de
los geles teñidos con bromuro de etidio, se añadieron a las
muestras de suero humano fuentes de ARN exógeno. Se utilizaron
células de mamífero o bacterias como fuentes de ARN exógeno. El AN
fue aislado de las muestras de acuerdo con el protocolo Y y eluido
en 50 \mul de TE con 0,5 U de RNasin por \mul en ausencia o en
presencia de RNasa A (40 ng por \mul del tampón de elución). Los
resultados de la electroforesis subsiguiente a través de un gel de
agarosa al 1% muestran que ARN y ADN pueden ser detectados. Las
células de mamífero añadidas eran por 50 \mul de muestra de suero,
5 x 10^{5} células 10B de rata (Boom y col., J. Gen. Virol.
69, 1988, 1179) mientras que las bacterias añadidas fueron
por 50 \mul de suero, la pella celular de un cultivo de una noche
de 100 \mul de la cepa HB101 de E. coli que contenía el
plásmido pCMV-E.
Ejemplo
A4
Se aisló AN (75 \mul) de 2 muestras de suero
humano de 50 \mul cada una (pacientes F y H) de acuerdo con el
protocolo Y. El suero del paciente F contenía un nivel elevado (2700
pg/ml) del antígeno P24 del VIH (según el inmunoensayo en fase
sólida del antígeno P24 del VIH de Abbott Laboratories) pero era
negativo para anticuerpos hacia el VIH (según el ELISA para
anticuerpos hacia el VIH de Abbott Laboratories), y el suero del
paciente H fue negativo en ambos ensayos.
Parte del AN aislado (43 \mul) fue tratado con
ADNasa libre de RNasa (Boehringer; 1 U de ADNasa/\mul) durante 90
minutos a 37ºC. Después de precipitación con etanol y de
inactivación por calor durante 15 minutos a 68ºC, el ARN fue
suspendido en 15 \mul de tampón TE. Una porción de 5 \mul de
esta preparación de ARN fue tratada o no tratada con 0,4 U/\mul
de transcriptasa inversa de VMA (30 minutos a 42ºC; 20 \mul de
volumen de reacción) en presencia de cebadores específicos para el
VIH. Posteriormente el volumen de reacción se completó hasta 100
\mul añadiendo 80 \mul de tampón para PCR concentrado 1,25 x que
incluía dNTPs, se añadió 1 U de ADN polimerasa-Taq, y se
inició la amplificación (1 ciclo comprendía 1 minuto a 95ºC, 1
minuto a 55ºC, 2 minutos a 72ºC). Se tomaron alícuotas de 10 \mul
de las mezclas de reacción a 20, 25, 30 y 35 ciclos y se aplicaron
a un gel de agarosa al 2%. El fragmento amplímero del VIH de 330 pb
esperado fue observado ya después de 25 ciclos para el ARN del
paciente F que había sido tratado con transcriptasa inversa,
sugiriendo que estaba presente en su suero ARN de VIH.
Ejemplo
A5
Diez muestras de 50 \mul de suero humano
fueron mezcladas con cada 10 \mug de ADN de pGem3p24 purificado
que constaba de la forma CI y CII (ver métodos). Estas 10 mezclas
plásmido/suero fueron utilizadas como material de entrada para
extracciones de acuerdo con el protocolo Y*. Para las
concentraciones de las sustancias caotrópicas utilizadas ver la
Tabla A5.1.
Después de la extracción, un 25% del ADN eluido
de cada muestra fue analizado en un gel de agarosa al 0,8%. Para
permitir la cuantificación de la recuperación del ADN plasmídico se
cargó también ADN de entrada directamente en el mismo gel.
Después de la electroforesis los geles fueron
fotografiados bajo iluminación UV y la eficacia de la recuperación
de ADN fue estimada visualmente en base a las intensidades de las
bandas plasmídicas (ver la leyenda de la Tabla A5.1).
Se llevaron a cabo experimentos similares
utilizando NaI y NaSCN como sustancias caotrópicas (ver la
descripción de la muestra posteriormente).
Se analizaron 10 muestras detectables preparadas
según se describió anteriormente y utilizando las sustancias
caotrópicas indicadas en la Tabla.
- -: no recuperación
- \pm: recuperación pequeña
- +: recuperación visible
- ++: recuperación cuantitativa
Los resultados resumidos en la Tabla A5.1
muestran que se aislaron eficazmente ADN de pGem3p24 cerrado
covalentemente (CI) y circular relajado (CII) cuando se utilizaron
como sustancias caotrópicas KI 3 M, NaI 3 M o NaSCN 3 M en
combinación con urea 8 M. El rendimiento de CII parece relativamente
elevado cuando se compara con CI.
Sección
B
Un ml de sangre humana contiene 5 x 10^{9}
eritrocitos aproximadamente que no son nucleados y que por tanto no
contribuyen a la cantidad de AN de la sangre. La cantidad de AN de
la sangre está determinada mayormente por los glóbulos blancos
sanguíneos (4-10 x 10^{6} por ml aproximadamente).
Estas células están inmersas en un medio acuoso (plasma) que
contiene grandes cantidades de proteínas (70 mg/ml de sangre
aproximadamente). De este modo, la sangre completa es una fuente
extremadamente impura para la purificación de AN. Los ejemplos de
la sección B muestran que a pesar de ello pueden aislarse AN a
partir de sangre completa por los protocolos B e Y.
Ejemplo
B1
Se mezcló sangre humana (500 \mul) con
cantidades conocidas de ADN purificado, 100 \mul de LMW (45
\mug), 80 \mul de CI/II (40 \mug) y se utilizaron 10 muestras
de 68 \mul como material de entrada para 10 extracciones de ADN
de acuerdo con el protocolo B. En este experimento la cantidad de SG
(suspensión de Sílice Gruesa) presente en los tubos de ensayo
variaba entre 2,5 y 40 \mul. Las extracciones se llevaron a cabo
por duplicado y la mitad (30 \mul) del ADN eluido de cada muestra
fue sometida a electroforesis a través de un gel de agarosa al 1%.
Para comparación, la mitad de la cantidad de los ADNs de entrada fue
también cargada en el mismo gel.
ADN de doble hebra, lineal, cerrado
covalentemente (CI), y ADN circular relajado (CII), fue aislado
eficazmente a partir de sangre humana completa si se utilizaban más
de 10 \mul de SG. La cantidad de ADN recuperado de la sangre
completa era proporcional a la cantidad de SG hasta 10 \mul
aproximadamente. Cantidades mayores parecían estar saturándose.
Ejemplo
B2
Se añadieron preparaciones de ADN purificado a
12 muestras de sangre humana de 50 \mul. El ADN fue aislado de
estas 12 mezclas de acuerdo con el protocolo B; la elución tuvo
lugar con 50 \mul de TE. La mitad del ADN eluido fue tratada con
uno de los tres enzimas de restricción siguientes: EcoRI,
BamHI y BglII (éstos son activos en tampones con bajo
contenido de sal, medio contenido de sal y elevado contenido de sal,
respectivamente), o fue tratada con ADN ligasa T4 o no fue tratada.
Las muestras de ADN fueron sometidas a electroforesis a través de
un gel de agarosa al 1% y visualizadas por iluminación UV.
Los resultados del tratamiento con ligasa T4 (1
hora a 37ºC, 3 unidades de ligasa T4 en un volumen de reacción de
30 \mul) muestran un desplazamiento hacia un peso molecular más
alto de los fragmentos de ADN e indican que el ADN aislado de
sangre humana no es afectado significativamente por degradación
exonucleolítica.
Los resultados para 8 muestras de sangre a las
que se añadió un plásmido purificado (pCMV-E; 3,3
\mug; 1,5 \mul) muestran que para los digestos de EcoRI,
BamHI y BglII todos los enzimas de restricción
linealizaron el plásmido. Todas las incubaciones con los enzimas de
restricción se realizaron en un volumen de reacción de 30 \mul
durante 1 hora a 37ºC con 9 unidades de enzima.
Ejemplo
B3
En este ejemplo se utilizan como material de
partida 10 muestras diferentes de sangre humana elegidas al azar de
un banco de sangre. Se conocía el número de glóbulos blancos
sanguíneos (WBC) de cada una de las muestras. Se purificó ADN a
partir de 50 \mul de las muestras de acuerdo con el protocolo B, y
la elución tuvo lugar con 75 \mul de TE. Un tercio del ADN
aislado fue aplicado directamente a un gel de agarosa al 1% y parte
del restante (2 \mul) fue utilizada para una PCR.
Las mismas muestras fueron sometidas al mismo
procedimiento de aislamiento después de que se añadieran 3 \mul
de ADN-LMW (6 \mug) a cada muestra de 50 \mul.
Aquí también se aplicaron directamente al gel 25 \mul del eluato
(75 \mul); otra porción de 25 \mul del eluato fue tratada
primeramente con ADN ligasa T4 (1 hora a 37ºC, 2 U en un volumen de
reacción de 30 \mul) y luego se aplicó al mismo gel.
El contenido de glóbulos blancos sanguíneos
(WBC) de las muestras de sangre 1-10 fue según
sigue:
Ejemplo
B4
Para mostrar que el ADN aislado de sangre
completa humana de acuerdo con el protocolo B es un buen sustrato
para la ADN polimerasa-Taq, 2 \mul del ADN aislado de diez
muestras de sangre diferentes según el ejemplo B3 fueron sometidos
a PCR con cebadores específicos para la
beta-globina. La PCR comprendía 32 ciclos, siendo
cada ciclo 1 minuto a 94ºC y luego 3 minutos a 65ºC. Parte de los
amplímeros (50%) fueron sometidos a electroforesis a través de un
gel de agarosa al 2%. Pudieron detectarse un amplímero de 120 pb y
las bandas de los cebadores.
Ejemplo
B5
Para mostrar que ADN y ARN pueden ser
purificados a partir de sangre humana de una manera reproducible, se
sometieron 6 muestras de sangre de 50 \mul cada una procedentes
de una persona al protocolo Y, siendo eluidos los AN en 75 \mul
de TE con RNasin (0,5 U/\mul). Una porción de 25 \mul del eluato
fue aplicada a un gel de agarosa al 1% neutro y sometida a
electroforesis. Los resultados muestran que pueden detectarse ADN y
ARN.
Ejemplo
B6
Muestras de sangre de 50 \mul procedentes de
10 personas diferentes (ver ejemplo B3) fueron sometidas al
protocolo Y, siendo eluidos los AN con 40 \mul de TE con 0,5
U/\mul de RNasin. Porciones de eluato de 30 \mul fueron
sometidas a electroforesis a través de un gel de agarosa al 1%
neutro. El resultado muestra que ADN y ARN pueden ser ambos
detectados.
Ejemplo
B7
Se añadieron fuentes de ARN exógeno a muestras
de sangre humana. Se utilizaron células de mamífero o bacterias
como fuentes de ARN exógeno. El AN fue aislado de las muestras de
acuerdo con el protocolo Y y eluido en 50 \mul de TE + 0,5
U/\mul de RNasin en ausencia o en presencia de RNasa A (40 ng por
\mul del tampón de elución). Por cada 50 \mul de muestra de
sangre se añadieron 5 x 10^{5} células 10B de rata (Boom y col.,
J. Gen. Virol. 69, 1988, 1179) como células de mamífero, y
por cada 50 \mul de sangre se añadió la pella celular de un
cultivo de una noche de 100 \mul de la cepa HB101 de E.
coli que contenía el plásmido pCMV-E como
bacterias.
Los resultados muestran que ARNhs de mamífero
(ARNs ribosómicos de 18S y 28S) y ARNhs bacteriano (ARNs ribosómicos
de 16S y 23S) pueden ser purificados ambos a partir de sangre
humana completa.
Además, el ADN genómico y el ADN plasmídico
(forma I) son recuperados eficazmente.
Sección
C
En la orina humana, puede estar presente AN, por
ejemplo, en virus o bacterias y en células del tracto urinario. Las
cantidades son normalmente tan bajas que la detección mediante
electroforesis en gel de agarosa e iluminación UV de los complejos
bromuro de etidio/AN es imposible. Para mostrar que puede
purificarse ADN a partir de orina humana, se añadieron a la orina
cantidades del orden de microgramos de ADN purificado, y el ADN fue
aislado posteriormente de acuerdo con el protocolo B (ejemplo C1).
Para mostrar que pueden purificarse simultáneamente ADN y ARN a
partir de orina humana, se añadieron a la orina bacterias cultivadas
(que llevaban un plásmido pequeño), y se aisló posteriormente el AN
de acuerdo con el protocolo Y (ejemplo C2).
El ejemplo C3 muestra que puede purificarse ADN
a partir de orina humana con sustancias caotrópicas alternativas
tales como KI, NaI y NaSCN en lugar de GuSCN con sílice como fase
sólida que se une al ácido nucleico de acuerdo con el protocolo
Y*.
Ejemplo
C1
Se añadieron 3 \mul de ADN LMW (6 \mug) a 10
muestras de orina humana de 50 \mul elegidas al azar con turbidez
variable (las muestras 4, 5, 6 y 7 eran claras, las muestras 1, 2, 3
y 8 eran ligeramente turbias, y las muestras 9 y 10 eran muy
turbias). El ADN fue aislado de acuerdo con el protocolo B y eluido
con 75 \mul de tampón TE. Un tercio de cada eluato fue aplicado a
un gel de agarosa al 1%. Otra parte de 25 \mul fue tratada con
1,8 U de ADN ligasa T4 (1 hora a 37ºC en un volumen de reacción de
30 \mul) y se aplicó al mismo gel. Las calles de marcadores
contenían ADN LMW y ADN MMW respectivamente. La cantidad de ADN LMW
(2 \mug) en una calle de los marcadores representa la cantidad que
se observaría con una eficacia de extracción del 100%.
Los resultados muestran que ADN puede ser
purificado eficazmente a partir de orina humana con el protocolo B
y que es un buen sustrato para la ADN ligasa T4.
El ADN LMW aislado de la muestra de orina Nº 10
ha sido degradado claramente. Se esperaba, sin embargo, que el ADN
desnudo (según se utilizó en este experimento) sería degradado si
una muestra de orina era rica en nucleasas. Es probable por tanto
que la degradación haya tenido lugar previamente durante la
preparación de las mezclas orina/ADN en lugar de durante la
purificación. El siguiente ejemplo (C2) muestra que el ADN e
incluso el ARNhs presentes en las células (al contrario que los
desnudos) pueden ser recuperados eficazmente de la muestra de orina
Nº 10.
Ejemplo
C2
En este experimento las mismas 10 muestras de
orina que las utilizadas en el ejemplo C1 fueron mezcladas con
bacterias que llevaban un plásmido de 2,4 kb
(pCMV-E). El AN fue aislado de estas mezclas de
acuerdo con el protocolo Y y eluido en 75 \mul de tampón TE con
0,5 U/\mul de RNasin. Un tercio del eluato fue sometido a
electroforesis a través de un gel de agarosa al 1%. Otra porción de
25 \mul del eluato fue tratada con 10 U del enzima de restricción
EcoRI que linealiza pCMV-E (1 hora a 37ºC en un
volumen de reacción de 30 \mul). Este tratamiento se llevó a cabo
en presencia de 40 ng/\mul de RNasa A. El resultado de la
electroforesis muestra los ARNs ribosómicos de 23S y 16S así como
la forma cerrada covalentemente (CI) y la forma lineal (CIII) del
ADN plasmídico.
Ejemplo
C3
Se mezcló orina humana (50 \mul) con 400
\mul de sustancia caotrópica, tampón de lisis L6* y 1 \mug de
ADN de pGem3p24. Esta suspensión total fue mezclada y se añadió a
500 \mul de sustancia caotrópica (ver la Tabla C3.1) y a 40
\mul de SiO_{2} para la purificación de ADN de acuerdo con el
protocolo Y*. La cantidad de ADN aislado de la orina fue analizada
utilizando electroforesis en gel de agarosa. La eficacia de la
recuperación de ADN fue estimada según se describió en el ejemplo
A5 y los resultados están resumidos en la Tabla C3.1.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla C3.1 muestra que los rendimientos para
el ADN plasmídico de tipo CI y de tipo CII de las bandas de ADN
eran los mismos.
\newpage
Ejemplo
D1
Los miembros de la familia de virus Reoviridiae
poseen un genoma consistente en ARN de doble hebra. Patógenos
importantes que pertenecen a esta familia son los Rotavirus que
pueden causar diarreas graves y que por tanto están presentes en
grandes cantidades en muestras de heces. El genoma rotavírico
consiste en 11 segmentos de ARNdh (ver Hishino en J. Clin.
Microbiol. 21, 1985, 425) que pudieron ser aislados del
sobrenadante de las heces de acuerdo con el protocolo B. Se
utilizaron para el aislamiento 100 \mul del sobrenadante obtenido
por centrifugación durante 2 minutos de la muestra de diarrea a
12000x g.
Los resultados utilizando muestras de 6
pacientes diferentes con infección por rotavirus demostrada
(verificada por el ensayo del látex para Rotavirus de Wellcome y
por el sistema de detección de antígeno directo de Rotavirus
Kallestad Pathfinder) confirmaron que el ARNdh puede ser
extraído.
Se obtuvieron resultados similares (normalmente
con rendimientos de ARNdh rotavírico mayores) cuando se omitió la
primera etapa de centrifugación y se utilizaron las muestras de
heces directamente como material de entrada para el protocolo B o
Y.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
E1
Para mostrar que ADN de hebra sencilla puede ser
aislado también de muestras clínicas, se añadió 1 \mug (4 \mul)
de ADN del fago M13 purificado (ADN de M13mp9, Boehringer) a 50
\mul de suero humano, sangre humana u orina humana y se purificó
de acuerdo con el protocolo B o de acuerdo con el protocolo Y. Todas
las extracciones se llevaron a cabo por cuadruplicado. El ADN fue
eluido en 50 \mul de tampón TE y 25 \mul fueron sometidos a
electroforesis a través de un gel de agarosa al 1%. Una calle de los
marcadores contiene 500 ng de ADNhs de M13.
Los resultados muestran que ADN de hebra
sencilla puede ser aislado a partir de sangre, suero u orina humanos
por el protocolo Y y, en menor grado, por el protocolo B.
\vskip1.000000\baselineskip
Sección
F
Debido a que los esqueletos de las tierras de
diatomeas constan casi completamente de SiO_{2} se examinó si
podrían servir como sílice para ser utilizada. Se mezclaron 10 g de
cada uno de cinco productos de diatomeas diferentes disponibles
comercialmente [Celatom® FW14, Celatom® FW50, Celatom® FW60, Celite®
(AK) y Celite® 521, Janssen Biochimica, Louvain, Bélgica] con 50 ml
de agua bidestilada y 500 \mul de HCl al 37%, seguido por
calentamiento de las suspensiones resultantes en un autoclave a
121ºC durante 20 minutos. En los ejemplos F1 y F2 las suspensiones
así obtenidas fueron utilizadas para extracciones de AN de acuerdo
con el protocolo Y.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
F1
Se mezcló sangre humana con bacterias E.
coli HB101, que llevaban el plásmido pCMV-E, y
se añadió la pella bacteriana de 100 \mul de un cultivo de una
noche a 50 \mul de sangre. Se utilizaron muestras de 50 \mul
como material de entrada para extracciones de AN de acuerdo con el
protocolo Y. En lugar de 40 \mul de SG, se utilizaron 40 \mul
de las suspensiones de tierra de diatomeas anteriores. El AN fue
eluido en 75 \mul de tampón TE, sin utilizar inhibidor de RNasa,
y 20 \mul del eluato fueron aplicados directamente al gel. Otra
porción de 20 \mul del eluato fue tratada con RNasa A (40
ng/\mul) junto con 9 U de BamHI durante 1 hora a 37ºC en
un volumen de reacción de 25 \mul y luego se aplicó al gel.
Una calle de los marcadores contiene 1 \mug de
ADN MMW.
Los resultados muestran que las suspensiones de
tierra de diatomeas tienen propiedades de unión a AN similares a
SG. Se unieron ambos, ADNdh (moléculas de componente I) y ARNhs
(ARNrs de 23S y 16S). El ADN plasmídico era suficientemente puro
para ser linealizado completamente (componente III) por
BamHI.
\newpage
Ejemplo
F2
Se cultivaron 9 especies diferentes de bacterias
gram negativas que se sabe que causan enfermedad en humanos en
placas de agar sólido. De cada una de estas especies bacterianas se
recogieron de 5 a 10 \mul por raspado de las placas y se
utilizaron como material de entrada para extracciones de AN de
acuerdo con el protocolo Y, y 40 \mul de SG o 40 \mul de la
suspensión de Celita® 521 se utilizaron como transportador de
AN.
Las extracciones en las que se utilizó SG
tuvieron que ser paradas durante el primer lavado debido a que los
complejos de AN-sílice no pudieron ser
homogeneizados más tiempo, ni siquiera incluso después de agitar en
vórtex durante largo tiempo (más de 3 minutos). Por otra parte, las
extracciones en las que se utilizó Celita® 521 prosiguieron sin
problemas, debido presumiblemente a los tamaños de partícula más
grandes de la tierra de diatomeas con relación a las partículas de
SG. El AN fue eluido con 70 \mul de tampón TE sin RNasin y parte
del eluato (20 \mul) fue sometida a electroforesis a través de un
gel de agarosa al 1%.
Las calles de marcadores contienen 1 \mug de
ADN MMW. Se obtuvieron resultados para los tipos de bacterias
siguientes:
- 1
- : Campylobacter pylori
- 2
- : Yersinia enterolytica tipo 3
- 3
- : Neisseria meningitidis
- 4
- : Neisseria gonorrhoeae
- 5
- : Haemophilus influenzae tipo b
- 6
- : Klebsiella pneumoniae
- 7
- : Salmonella typhimurium
- 8
- : Pseudomonas aeruginosa
- 9
- : Escherichia coli K1-083
ADN HMW bacteriano y ARNrs pudieron ser
detectados utilizando este procedimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Sección
G
El aislamiento de AN de bacterias gram negativas
es posible de acuerdo con esta invención. En las células
bacterianas están presentes niveles elevados de ADN de elevado peso
molecular (ADN HMW) y de ARN ribosómico. El ejemplo G1 muestra que
puede purificarse AN a partir de células bacterianas utilizando
varias sustancias caotrópicas con sílice como fase sólida que se
une al AN.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
G1
Se aisló AN a partir de 50 \mul de un cultivo
bacteriano de una noche de JM101 en presencia de 900 \mul de
sustancia caotrópica y 40 \mul de SiO_{2}. El elevado nivel de
ADN HMW y de ARN ribosómico endógeno (16S y 23S) permite la
detección del AN aislado por iluminación UV de geles teñidos con
bromuro de etidio. Los aislamientos se llevaron a cabo de acuerdo
con el protocolo Y*, y un 25% del AN eluido (porciones de 40
\mul) fue analizado en un gel de
agarosa.
agarosa.
La Tabla G1 resume los resultados del análisis
en gel de agarosa. La cuantificación de la recuperación de ADN HMW
y ARNr ha sido comparada con el procedimiento en el que se utilizó
GuSCN como sustancia caotrópica en combinación con sílice: 1 en la
Tabla G1 indica una recuperación de ADN o ARN igualmente eficaz.
>1 En la Tabla G1 indica una mejor recuperación.
Se tomó como referencia el marcador de ARNr de
E. coli (Boehringer) para el aislamiento de ARN endógeno de
células bacterianas.
\vskip1.000000\baselineskip
Sección
H
Para mostrar que el aislamiento/purificación de
AN puede ser realizado con GuSCN y varios derivados de sílice (ver
Materiales y Métodos) se añadió plásmido puro en un tampón con bajo
contenido de sal (Tris 10 mM-EDTA 1 mM pH 8,0) y se
aisló posteriormente de acuerdo con el protocolo Y, sin embargo las
etapas 7 y 9 fueron omitidas (no se realizó la elución con TE). Las
partículas de sílice con AN unido se llevaron a la mezcla de
reacción para PCR. El ADN aislado puede ser detectado por el método
de PCR. El ejemplo H1 muestra que puede purificarse AN utilizando
fases sólidas alternativas en combinación con GuSCN como sustancia
caotrópica y detección por el método de
PCR.
PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
H1
0,5 \mug de pGem3p24 presentes en 50 \mul de
Tris 10 mM/EDTA 1 mM pH 8,0 fueron mezclados con 80 \mul de
suspensión de sílice (ver Materiales y Métodos) y 900 \mul de
tampón de lisis L6.
Después de lavar y secar a 56ºC de acuerdo con
el protocolo Y (sin etapa de elución) la pella fue resuspendida en
50 \mul de agua. Se utilizó una porción de 20 \mul de la
suspensión plásmido-sílice en la mezcla de PCR en
presencia de cebadores específicos para el VIH (Materiales y
Métodos), se añadieron 5 \mul de tampón para PCR concentrado 10x,
1 \mul de dNTPs 10 mM, 2 Unidades de ADN polimerasa-Taq y
agua hasta un volumen final de 50 \mul y comenzó la reacción de
amplificación (1 ciclo comprendía 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 37ºC
y 3 minutos a 72ºC).
Se recogieron alícuotas de 10 \mul de las
mezclas de reacción después de 30 ciclos y se analizaron en un gel
de agarosa al 2%. El aislamiento de AN con partículas de látex
(análisis comparativos) no obtuvo pellas como el aislamiento de AN
con sílice.
- \text{*}
- Ensayos comparativos
Los resultados están resumidos en la Tabla H1.
El fragmento amplímero del VIH de 290 pb esperado se observó en
todos los casos después de 30 ciclos. El tamaño de los fragmentos se
comparó con el marcador digesto de HaeIII del ADN de
\varphix 174 RF (Pharmacia) también cargado en el gel.
- ++ :
- indica la detección del fragmento de 290 pb específico del VIH en el gel de agarosa a un nivel igual que utilizando Sílice Gruesa como fase sólida (control).
- + :
- indica un nivel detectable del fragmento de 290 pb, inferior que el control Sílice Gruesa.
Claims (10)
1. Un proceso para aislar ácido nucleico a
partir de un material de partida biológico complejo que contenga
ácido nucleico, caracterizado por la mezcla del material de
partida biológico complejo, una sustancia caotrópica y una fase
sólida que se une al ácido nucleico conteniendo sílice o un derivado
de la misma, separando la fase sólida con el ácido nucleico unido a
ella del líquido, después de lo cual los complejos fase sólida-ácido
nucleico así obtenidos son lavados y, si se requiere, el ácido
nucleico es eluido de dichos complejos, donde se selecciona el
material de partida biológica de: sangre completa, suero sanguíneo,
capa amarillenta, orina, heces, líquido cerebroespinal, esperma,
saliva, tejidos y cultivos celulares, productos alimenticios,
vacunas, leche infectada con un virus o una bacteria, material
vegetal, bacterias gram positivas, levaduras, mohos, fluidos
corporales y material biológico posiblemente infectado con virus o
bacterias.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado en que la sustancia caotrópica empleada es
una sal de guanidinio, yoduro de sodio, yoduro de potasio,
(iso)tiocianato de sodio, urea o combinaciones mutuas de los
mismos.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
2, caracterizado en que la sal de guanidinio empleada es
(iso)tiocianato de guanidinio.
4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado en que la fase sólida que se une al ácido
nucleico comprende partículas de sílice.
5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
4, caracterizado en que dichas partículas de sílice tienen
un tamaño de partícula que oscila de 0,1-500
micrometros.
6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
4, caracterizado en que dichas partículas de sílice tienen
un tamaño de partícula que oscila de 1-200
micrometros.
7. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, caracterizado por la
separación de los complejos fase sólida-ácido nucleico resultantes
del líquido por sedimentación y eliminación del sobrenadante, y por
el posterior lavado de los complejos con un tampón de lavado que
contiene una sustancia caotrópica.
8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
7, caracterizado en que los complejos fase sólida-ácido
nucleico lavados con el tampón de lavado son lavados posteriormente
sucesivamente con uno o más solventes orgánicos, seguido por
secado.
9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
8, caracterizado en que el ácido nucleico presente en los
complejos fase sólida-ácido nucleico lavados y secados es eluido por
medio de un tampón de elución.
10. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado en que los complejos fase sólida-ácido
nucleico así obtenidos son puestos en contacto con una mezcla en la
que están presentes componentes para amplificar el ácido nucleico
unido a dicha fase sólida o eluido a partir de ella.
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Families Citing this family (181)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992018514A1 (en) * | 1991-04-12 | 1992-10-29 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Purification of nucleic acids using metal oxide supports |
| US5329000A (en) * | 1991-10-31 | 1994-07-12 | Becton, Dickinson And Company | Purification of DNA with silicon tetrahydrazide |
| DE4143639C2 (de) * | 1991-12-02 | 2002-10-24 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren |
| DE4321904B4 (de) * | 1993-07-01 | 2013-05-16 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen |
| GB9314249D0 (en) * | 1993-07-09 | 1993-08-18 | Proofname Ltd | Purification method and apparatus |
| AU7375794A (en) * | 1993-07-28 | 1995-02-28 | Akzo Nobel N.V. | Process for isolating nucleic acid from gram positive microorganisms |
| JP3451667B2 (ja) * | 1993-08-24 | 2003-09-29 | 東ソー株式会社 | 核酸抽出及び特定核酸配列の検出方法 |
| WO1995006652A1 (en) * | 1993-08-30 | 1995-03-09 | Promega Corporation | Nucleic acid purification compositions and methods |
| US6043032A (en) * | 1993-09-22 | 2000-03-28 | Tosoh Corporation | Method of extracting nucleic acids and method of detecting specified nucleic acid sequences |
| GB2282138B (en) * | 1993-09-28 | 1997-09-03 | Tosoh Corp | Method of extracting nucleic acids and method of detecting specified nucleic acid sequences |
| GB9323305D0 (en) * | 1993-11-11 | 1994-01-05 | Medinnova Sf | Isoaltion of nucleic acid |
| EP0743950B1 (de) | 1994-02-11 | 2001-12-12 | QIAGEN GmbH | Verfahren zur trennung von doppelstrang/einzelstrangnukleinsäurestrukturen |
| EP0765335B1 (de) * | 1994-06-14 | 1999-09-01 | Invitek GmbH | Universelles verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren aus extrem geringen mengen sowie sehr stark verunreinigten unterschiedlichsten ausgangsmaterialien |
| DE4420732A1 (de) | 1994-06-15 | 1995-12-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe |
| DE4420900A1 (de) | 1994-06-15 | 1995-12-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur mehrmaligen Entnahme von Flüssigkeiten |
| WO1996006850A1 (en) * | 1994-08-29 | 1996-03-07 | Akzo Nobel N.V. | Device for use in the isolation of a biological material such as nucleic acid |
| GB9425138D0 (en) | 1994-12-12 | 1995-02-08 | Dynal As | Isolation of nucleic acid |
| NL9402122A (nl) * | 1994-12-14 | 1996-07-01 | Univ Nijmegen | Werkwijze voor het bereiden van aan kunststof gekoppelde niet-eiwitachtige macrobiomoleculen welke sterk negatief geladen zijn, aan kunststof gekoppelde negatief geladen niet-eiwitachtige macrobiomoleculen alsmede een microtiterplaat waarvan de putjes zijn bekleed met negatief geladen niet-eiwitachtige macrobiomoleculen. |
| US5576196A (en) * | 1995-01-13 | 1996-11-19 | Vical Incorporated | Process for reducing RNA concentration in a mixture of biological material using diatomaceous earth |
| DE19512368A1 (de) * | 1995-04-01 | 1996-10-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | System zur Freisetzung und Isolierung von Nukleinsäuren |
| US6919175B1 (en) | 1995-04-01 | 2005-07-19 | Roche Diagnostics Gmbh | System for releasing and isolating nucleic acids |
| DE19520398B4 (de) * | 1995-06-08 | 2009-04-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetisches Pigment |
| KR100463475B1 (ko) | 1995-06-08 | 2005-06-22 | 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 | 자기성피그먼트 |
| JP2965131B2 (ja) | 1995-07-07 | 1999-10-18 | 東洋紡績株式会社 | 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法 |
| DE69636553T2 (de) * | 1995-07-07 | 2007-05-31 | Toyo Boseki K.K. | Nukleinsäuren bindender magnetischer Träger und Verfahren für die Nukleinsäureisolierung unter dessen Verwendung |
| DE19530132C2 (de) * | 1995-08-16 | 1998-07-16 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien |
| US5783686A (en) * | 1995-09-15 | 1998-07-21 | Beckman Instruments, Inc. | Method for purifying nucleic acids from heterogenous mixtures |
| WO1997030062A1 (en) * | 1996-02-14 | 1997-08-21 | Akzo Nobel N.V. | Isolation and amplification of nucleic acid materials |
| DE19607202A1 (de) * | 1996-02-26 | 1997-08-28 | Uwe Dr Michel | Reagenzienkit zur Präparation von Nukleinsäuren |
| NL1002781C1 (nl) * | 1996-04-03 | 1997-10-06 | Amsterdam Support Diagnostics | Isolatie en/of amplificatie van hepatitis-C-virus-(HCV) -nucleïnezuren uit monsters waarvan vermoed wordt dat zij HCV bevatten. |
| EP0814156B1 (en) * | 1996-06-18 | 2003-03-05 | The Institute Of Physical & Chemical Research | Method for the purification of DNA |
| US5990302A (en) * | 1996-07-12 | 1999-11-23 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Method for isolating ribonucleic acid |
| US6210881B1 (en) | 1996-12-30 | 2001-04-03 | Becton, Dickinson And Company | Method for reducing inhibitors of nucleic acid hybridization |
| US5763185A (en) * | 1996-12-30 | 1998-06-09 | Becton Dickinson And Company | Method for reducing inhibitors of nucleic acid hybridization |
| GB9709728D0 (en) | 1997-05-13 | 1997-07-02 | Dynal As | Single step method |
| JP2002511147A (ja) * | 1997-06-27 | 2002-04-09 | ライフ テクノロジーズ インク． | 生体分子の濃縮および精製のための一工程装置および方法 |
| WO1999007898A1 (en) | 1997-08-08 | 1999-02-18 | Akzo Nobel N.V. | Nucleic acid sequences that can be used as primers and probes in the amplification and detection of all subtypes of hiv-1 |
| JP2001516731A (ja) | 1997-09-17 | 2001-10-02 | ジエントラ・システムズ・インコーポレーテツド | 核酸を単離するための装置および方法 |
| JP4304348B2 (ja) * | 1997-09-22 | 2009-07-29 | 独立行政法人理化学研究所 | Ｄｎａの単離方法 |
| DE19746874A1 (de) * | 1997-10-23 | 1999-04-29 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren an hydrophoben Oberflächen - insbesondere unter Verwendung hydrophober Membranen |
| JP4025399B2 (ja) | 1997-10-28 | 2007-12-19 | 株式会社日立製作所 | 核酸の回収方法及び装置 |
| US6914137B2 (en) | 1997-12-06 | 2005-07-05 | Dna Research Innovations Limited | Isolation of nucleic acids |
| EP1037973A2 (de) * | 1997-12-18 | 2000-09-27 | Invitek GmbH | Verfahren zur isolierung von kurz- und langkettigen nukleinsäuren |
| ZA99493B (en) | 1998-01-30 | 1999-07-22 | Akzo Nobel Nv | Method for the isolation of nucleic acid. |
| EP2290099B1 (en) * | 1998-02-02 | 2012-10-10 | QIAGEN North American Holdings, Inc. | Processes for isolating, amplifying and characterizing DNA |
| EP1053357B1 (en) * | 1998-02-02 | 2008-05-21 | QIAGEN North American Holdings, Inc. | Processes for isolating, amplifying and characterizing dna |
| DE69937631T2 (de) * | 1998-02-02 | 2008-10-30 | Qiagen North American Holdings, Inc. | Zusammensetzung und methoden betreffend der verwendung einer lysismatrix zur isolation von dna |
| CA2319691C (en) * | 1998-02-02 | 2012-12-18 | Gentra Systems, Inc. | Eluting reagents, methods and kits for isolating dna |
| JPH11266864A (ja) * | 1998-03-19 | 1999-10-05 | Hitachi Ltd | 核酸の精製方法および精製用装置 |
| DE19818485B4 (de) * | 1998-04-24 | 2005-03-24 | IBL Gesellschaft für Immunchemie und Immunbiologie mbH | Reaktionsgefäße, beschichtet mit einem cis-Diol-spezifischen Affinitätsmedium, sowie Verfahren zu deren Herstellung |
| DE19836559A1 (de) | 1998-08-12 | 2000-03-23 | Antigen Gmbh | Gefäß zur Entnahme von Blut |
| AU764494B2 (en) * | 1998-09-10 | 2003-08-21 | Whatman Plc | Product and method for separation of a sample containing multiple sources of genetic material using a solid medium |
| US6958392B2 (en) * | 1998-10-09 | 2005-10-25 | Whatman, Inc. | Methods for the isolation of nucleic acids and for quantitative DNA extraction and detection for leukocyte evaluation in blood products |
| US6492162B1 (en) | 1998-10-27 | 2002-12-10 | Hitachi, Ltd. | Apparatus for the recovery of nucleic acids |
| JP2000166556A (ja) * | 1998-12-10 | 2000-06-20 | Hitachi Ltd | 核酸の回収方法及び装置 |
| US7790865B1 (en) | 1999-02-02 | 2010-09-07 | Qiagen North American Holdings, Inc | Eluting reagents, methods and kits for isolating DNA |
| CA2270106C (en) * | 1999-04-23 | 2006-03-14 | Yousef Haj-Ahmad | Nucleic acid purification and process |
| AU6281200A (en) * | 1999-08-09 | 2001-03-05 | Bilatec Ag | Laboratory robot and method and reagent kit for isolating nucleic acids |
| DE19943374A1 (de) | 1999-09-10 | 2001-03-29 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zum Anbinden von Nukleinsäuren an eine Festphase |
| US6383783B1 (en) | 1999-09-21 | 2002-05-07 | 3M Innovative Properties Company | Nucleic acid isolation by adhering to hydrophobic solid phase and removing with nonionic surfactant |
| DE19946597A1 (de) * | 1999-09-29 | 2001-04-12 | Nigu Chemie Gmbh | Stabilisiertes Guanidinlthiocyanat und dessen Verwendung |
| CZ20021608A3 (cs) | 1999-11-17 | 2003-06-18 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetické skleněné částice, metody jejich přípravy a použití |
| GB0001450D0 (en) | 2000-01-21 | 2000-03-08 | Genpoint As | Cell isolation method |
| DE10004927C2 (de) * | 2000-02-04 | 2003-02-06 | Qiagen Gmbh | Nukleinsäure-Isolierung aus Stuhlproben und anderen biologischen Materialien, die reich an Inhibitoren sind |
| DE10006662A1 (de) | 2000-02-15 | 2001-08-23 | Antigen Produktions Gmbh | Gefäß zur Nukleinsäureanalytik |
| US6815215B2 (en) | 2000-02-28 | 2004-11-09 | Hitachi, Ltd. | Method of recovering a plurality of nucleic acids by an identical stationary phase and an apparatus thereof |
| CA2400724C (en) | 2000-03-24 | 2009-11-24 | Qiagen Gmbh | Porous ferro- or ferrimagnetic glass particles for isolating molecules |
| GB0009771D0 (en) | 2000-04-19 | 2000-06-07 | Angiomed Ag | Method for linking nucleic acids |
| GB0013658D0 (en) | 2000-06-05 | 2000-07-26 | Dynal Asa | Nucleic acid isolation |
| WO2002078847A1 (fr) * | 2001-03-28 | 2002-10-10 | Hitachi, Ltd. | Instrument et procede permettant de recuperer de l'acide nucleique |
| US6818762B2 (en) * | 2001-05-25 | 2004-11-16 | Maine Molecular Quality Controls, Inc. | Compositions and methods relating to nucleic acid reference standards |
| JP2002191351A (ja) * | 2001-10-19 | 2002-07-09 | Hitachi Ltd | 核酸の精製用装置および核酸捕捉用チップ |
| ATE449186T1 (de) | 2001-11-28 | 2009-12-15 | Applied Biosystems Llc | Zusammensetzungen und verfahren zur selektiven nukleinsäureisolierung |
| CN100422342C (zh) | 2002-01-07 | 2008-10-01 | 诺奇普公司 | 检测人乳头瘤病毒mRNA的方法 |
| DE60316660T3 (de) | 2002-01-08 | 2016-01-28 | Roche Diagnostics Gmbh | Verwendung eines silikamaterials bei der amplifikation |
| JP2005538929A (ja) | 2002-01-16 | 2005-12-22 | ダイナル バイオテック エイエスエイ | 単一サンプルからの核酸及びタンパク質の単離方法 |
| GB0205455D0 (en) | 2002-03-07 | 2002-04-24 | Molecular Sensing Plc | Nucleic acid probes, their synthesis and use |
| DE10231659B4 (de) * | 2002-07-12 | 2006-01-19 | Preanalytix Gmbh | Zusammensetzung zum Binden von Nukleinsäure an eine Festphase |
| US9394332B2 (en) | 2002-08-29 | 2016-07-19 | Epigenomics Ag | Method for bisulfite treatment |
| WO2004079333A2 (en) * | 2003-01-15 | 2004-09-16 | Ic & G Co., Ltd. | Method and kit for extracting rna from sputum |
| US7413855B2 (en) | 2003-01-29 | 2008-08-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Method for bisulfite treatment |
| US7601491B2 (en) | 2003-02-06 | 2009-10-13 | Becton, Dickinson And Company | Pretreatment method for extraction of nucleic acid from biological samples and kits therefor |
| EP1605261B1 (en) | 2003-03-19 | 2009-12-09 | Hamamatsu Foundation for Science and Technology Promotion | Method of detecting colon cancer marker |
| ATE514791T1 (de) * | 2003-07-09 | 2011-07-15 | Genvault Corp | Raumtemperatur-eluierung der nukleinsäuren |
| JP4633627B2 (ja) * | 2003-07-16 | 2011-02-16 | 東洋紡績株式会社 | 生体成分分離用デバイス、およびそれを用いた生体成分の分離方法 |
| US20050059024A1 (en) | 2003-07-25 | 2005-03-17 | Ambion, Inc. | Methods and compositions for isolating small RNA molecules |
| ATE554166T1 (de) † | 2003-07-25 | 2012-05-15 | Life Technologies Corp | Verfahren und zusammensetzungen zur herstellung von rna aus einer fixierten probe |
| GB0319671D0 (en) * | 2003-08-21 | 2003-09-24 | Secr Defence | Apparatus for processing a fluid sample |
| EP1692315A1 (en) | 2003-12-02 | 2006-08-23 | Roche Diagnostics GmbH | Improved method for bisulfite treatment |
| US20050130177A1 (en) | 2003-12-12 | 2005-06-16 | 3M Innovative Properties Company | Variable valve apparatus and methods |
| DE10358137A1 (de) * | 2003-12-12 | 2005-07-07 | Merck Patent Gmbh | Verfahren und Kit zur Isolierung von RNA |
| WO2005064010A1 (de) * | 2003-12-19 | 2005-07-14 | Preanalytix Gmbh | Zusammensetzung zum binden von nukleinsäure an eine festphase |
| US7939249B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-05-10 | 3M Innovative Properties Company | Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step |
| US7727710B2 (en) | 2003-12-24 | 2010-06-01 | 3M Innovative Properties Company | Materials, methods, and kits for reducing nonspecific binding of molecules to a surface |
| EP1719816B1 (en) | 2004-02-12 | 2011-06-01 | GL Sciences Incorporated | Mechanism of separating and purifying dna |
| AU2005200670B2 (en) * | 2004-02-20 | 2007-05-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Adsorption of nucleic acids to a solid phase |
| JP4539125B2 (ja) * | 2004-03-08 | 2010-09-08 | ブラザー工業株式会社 | 核酸単離部材 |
| US20050208501A1 (en) * | 2004-03-16 | 2005-09-22 | Ambion, Inc. | Process and reagents for extraction of RNA from fractionated blood leukocytes |
| US7897378B2 (en) | 2004-03-18 | 2011-03-01 | Roche Molecular Systems, Inc. | Method and device for purifying nucleic acids |
| JP4080462B2 (ja) * | 2004-07-09 | 2008-04-23 | 株式会社日立製作所 | 核酸の回収方法 |
| DE102004034433A1 (de) | 2004-07-15 | 2006-02-02 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Nukleinsäuren unter Verwendung kationischer Detergentien |
| EP1632578A1 (en) | 2004-09-03 | 2006-03-08 | Roche Diagnostics GmbH | DNA decontamination method |
| JP2006166711A (ja) * | 2004-12-13 | 2006-06-29 | Okayama Univ | 糞便由来遺伝子の簡便増幅方法 |
| JP4764966B2 (ja) * | 2005-03-30 | 2011-09-07 | 独立行政法人科学技術振興機構 | メッセンジャーｒｎａの分離方法 |
| DE102005040259A1 (de) | 2005-08-24 | 2007-03-01 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Gewinnung von Nukleinsäuren aus Blut |
| JP4699868B2 (ja) | 2005-11-04 | 2011-06-15 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸精製方法及び核酸精製器具 |
| US7981606B2 (en) | 2005-12-21 | 2011-07-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Control for nucleic acid testing |
| JP5169826B2 (ja) | 2006-06-20 | 2013-03-27 | 日立金属株式会社 | 金属微粒子及び生体物質抽出用の磁気ビーズ、並びにそれらの製造方法 |
| US20080102493A1 (en) * | 2006-06-29 | 2008-05-01 | Millipore Corporation | Isolation of RNA and DNA from a biological sample |
| JP2008005781A (ja) * | 2006-06-29 | 2008-01-17 | Olympus Corp | 試料処理方法 |
| US10131935B2 (en) * | 2006-07-11 | 2018-11-20 | Aj Innuscreen Gmbh | Method for parallel isolation of viral nucleic acids |
| EP1911844A1 (en) | 2006-10-10 | 2008-04-16 | Qiagen GmbH | Methods and kit for isolating nucleic acids |
| EP1932913B1 (en) | 2006-12-11 | 2013-01-16 | Roche Diagnostics GmbH | Nucleic acid isolation using polidocanol and derivatives |
| CA2614069C (en) | 2006-12-11 | 2016-05-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleic acid isolation using polidocanol and derivatives |
| JP2011503244A (ja) * | 2006-12-21 | 2011-01-27 | インヴィトロジェン ダイナル エーエス | 核酸の単離方法またはリン酸化タンパク質の単離方法における粒子およびその使用 |
| DE102007009347B4 (de) | 2007-02-27 | 2009-11-26 | Agowa Gmbh | Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren |
| DE102007016707A1 (de) | 2007-04-04 | 2008-10-09 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Aufreinigung von Biomolekülen |
| CA2629589C (en) * | 2007-04-20 | 2016-03-29 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Isolation and purification of nucleic acid molecules with a solid phase |
| CA2629586C (en) * | 2007-04-20 | 2016-05-24 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Adsorption of nucleic acids to solid phases under low-salt conditions |
| DE102007035250A1 (de) * | 2007-07-27 | 2009-01-29 | Qiagen Gmbh | Verfahren zum Abtrennen von nicht-proteinhaltigen Biomolekülen, insbesondere Nukleinsäuren aus proteinhaltigen Proben |
| EP2036988A1 (en) | 2007-09-12 | 2009-03-18 | Siemens Healthcare Diagnostics GmbH | A method for predicting the response of a tumor in a patient suffering from or at risk of developing recurrent gynecologic cancer towards a chemotherapeutic agent |
| JP4097687B2 (ja) * | 2007-09-21 | 2008-06-11 | 株式会社日立製作所 | 核酸の回収方法 |
| EP2065399A1 (en) | 2007-11-30 | 2009-06-03 | Siemens Healthcare Diagnostics GmbH | The present invention relates to methods for prediction of the therapeutic success of breast cancer therapy |
| ATE468917T1 (de) | 2007-10-31 | 2010-06-15 | Hoffmann La Roche | Verfahren und vorrichtung zur reinigung von nukleinsäuren |
| EP2065474A1 (en) | 2007-11-28 | 2009-06-03 | Siemens Healthcare Diagnostics GmbH | A method to assess prognosis and to predict therapeutic response to endocrine treatment |
| WO2009068423A2 (en) | 2007-11-30 | 2009-06-04 | Siemens Healthcare Diagnostics Gmbh | Method for predicting therapy responsiveness in basal like tumors |
| EP2065475A1 (en) | 2007-11-30 | 2009-06-03 | Siemens Healthcare Diagnostics GmbH | Method for therapy prediction in tumors having irregularities in the expression of at least one VEGF ligand and/or at least one ErbB-receptor |
| EP2071034A1 (en) | 2007-12-12 | 2009-06-17 | bioMérieux | Method for treating a solution in order to destroy any ribonucleic acid after amplification |
| DE102008010692A1 (de) | 2008-02-22 | 2009-08-27 | Qiagen Gmbh | Neue Matrices, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen |
| DE102008010693A1 (de) | 2008-02-22 | 2009-08-27 | Qiagen Gmbh | Neue Matrixmaterialien, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen |
| EP2128169A1 (de) | 2008-05-30 | 2009-12-02 | Qiagen GmbH | Verfahren zur Isolierung von kurzkettigen Nukleinsäuren |
| DE102008029356A1 (de) | 2008-06-20 | 2009-12-24 | Siemens Healthcare Diagnostics Gmbh | Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, insbesondere aus fixiertem Gewebe |
| US8158405B2 (en) | 2008-06-30 | 2012-04-17 | General Electric Company | Process for concentrating and processing fluid samples |
| US8546127B2 (en) | 2008-06-30 | 2013-10-01 | General Electric Company | Bacteria/RNA extraction device |
| WO2010012464A1 (en) | 2008-08-01 | 2010-02-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Improved lysis and reverse transcription for mrna quantification |
| EP2157181A1 (de) | 2008-08-13 | 2010-02-24 | AGOWA Gesellschaft für molekularbiologische Technologie mbH | Verfahren zur Isolation von Nukleinsäuren und Testkit |
| DE102008047790A1 (de) | 2008-09-17 | 2010-04-15 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Normierung des Gehalts von Biomolekülen in einer Probe |
| CA2682439A1 (en) | 2008-10-17 | 2010-04-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Cell monitoring and molecular analysis |
| DE102008061714A1 (de) * | 2008-12-12 | 2010-06-17 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Deerfield | Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, inbesondere aus fixiertem Gewebe |
| FR2940805B1 (fr) | 2009-01-05 | 2015-10-16 | Biomerieux Sa | Procede d'amplification et/ou de detection d'acides nucleiques, kits et utilisations de ce procede |
| WO2010082631A1 (ja) | 2009-01-16 | 2010-07-22 | アークレイ株式会社 | 核酸試料の製造方法、および、それを用いた核酸増幅物の製造方法 |
| DE102009022513A1 (de) | 2009-05-25 | 2010-12-02 | Qiagen Gmbh | Verfahren zum Schutz von Membranen |
| AU2010279676A1 (en) * | 2009-08-04 | 2012-02-02 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process and device for collecting nucleic acids of microorganisms from a particulate sample |
| FR2959312B1 (fr) | 2010-04-23 | 2023-01-20 | Biomerieux Sa | Dispositif de preparation et/ou de traitement d'un echantillon biologique |
| JP5454338B2 (ja) | 2010-04-28 | 2014-03-26 | 株式会社島津製作所 | 液滴操作によるリアルタイム核酸増幅法 |
| CN102276937B (zh) * | 2010-06-12 | 2013-06-05 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种抗菌聚苯乙烯组合物及其制备方法 |
| GB201010237D0 (en) | 2010-06-18 | 2010-07-21 | Lgc Ltd | Methods and apparatuses |
| US9725754B2 (en) | 2010-07-29 | 2017-08-08 | Sean F. Boyle | Generic sample preparation |
| CN107058617A (zh) | 2010-07-29 | 2017-08-18 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 通用样品制备 |
| DE102010043015B4 (de) * | 2010-10-27 | 2019-12-19 | Robert Bosch Gmbh | Verfahren zur Konzentration von Probenbestandteilen und Amplifikation von Nukleinsäuren |
| WO2012054975A1 (en) | 2010-10-28 | 2012-05-03 | Clinical Genomics Pty. Ltd. | Method of microvesicle enrichment |
| JP5455878B2 (ja) | 2010-11-30 | 2014-03-26 | シスメックス株式会社 | 被検物質の電気化学的検出方法 |
| WO2012086243A1 (ja) | 2010-12-21 | 2012-06-28 | 株式会社 島津製作所 | 管内で対象成分を操作するためのデバイス及び方法 |
| KR101193765B1 (ko) * | 2011-05-16 | 2012-10-24 | (주)나노헬릭스 | 초고속 핵산의 정제방법 |
| EP2546199A1 (en) | 2011-07-14 | 2013-01-16 | Université Catholique De Louvain | Solid iron oxide support for isolation of microorganisms |
| JP5807542B2 (ja) | 2011-12-22 | 2015-11-10 | 株式会社島津製作所 | 対象成分を操作するためのチップデバイス及びそれを用いた方法 |
| WO2013181651A1 (en) * | 2012-06-01 | 2013-12-05 | Omega Bio-Tek, Inc. | Selective nucleic acid fragment recovery |
| DE102012012523B4 (de) | 2012-06-26 | 2015-02-12 | Magnamedics Gmbh | Reinigung von Nukleinsäuren |
| JP6024266B2 (ja) * | 2012-08-01 | 2016-11-16 | セイコーエプソン株式会社 | Ｄｎａの抽出方法 |
| JP6093530B2 (ja) * | 2012-09-24 | 2017-03-08 | 東芝メディカルシステムズ株式会社 | 乳中の微生物を濃縮および乳中の微生物の核酸を回収する方法 |
| EP2931661B1 (en) | 2012-12-11 | 2017-11-08 | Qiagen GmbH | Preparation of silica particles |
| WO2014122288A1 (en) | 2013-02-08 | 2014-08-14 | Qiagen Gmbh | Method for separating dna by size |
| AU2013202805B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-07-16 | Gen-Probe Incorporated | System and method for extending the capabilities of a diagnostic analyzer |
| ES2865124T3 (es) | 2013-03-15 | 2021-10-15 | Abbott Molecular Inc | Procedimiento en una etapa para la purificación de ácidos nuncleicos |
| CN105358688B (zh) | 2013-07-03 | 2019-01-18 | 株式会社岛津制作所 | 粒子操作方法以及粒子操作器件 |
| EP3124608B1 (en) * | 2014-03-26 | 2019-09-18 | Universal Bio Research Co., Ltd. | Method and reagent for extracting nucleic acid |
| EA201691696A1 (ru) | 2014-04-25 | 2017-03-31 | Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. | Способы очистки матричной рнк |
| EP3174970A1 (en) | 2014-07-30 | 2017-06-07 | F. Hoffmann-La Roche AG | Automated system for processing particles |
| JP6437250B2 (ja) | 2014-09-03 | 2018-12-12 | 株式会社ミズホメディー | 前処理方法及びそれに用いられる核酸抽出キット |
| JP7007197B2 (ja) | 2015-06-05 | 2022-01-24 | キアゲン ゲーエムベーハー | サイズによってｄｎａを分離する方法 |
| JP6815334B2 (ja) | 2015-06-09 | 2021-01-20 | バイオカーティス エヌ ヴイ | 核酸の単離のための自動化可能な方法 |
| CN113122535A (zh) | 2015-09-10 | 2021-07-16 | 株式会社钟化 | 从含有核酸的样品中分离核酸的方法及用于该方法的样品处理试剂 |
| WO2017114844A1 (en) | 2015-12-28 | 2017-07-06 | Koninklijke Philips N.V. | Nucleic acid purification system using a single wash and elution buffer solution |
| TWI694146B (zh) * | 2016-02-02 | 2020-05-21 | 日商美之賀美蒂股份有限公司 | 前處理方法及用於其之核酸萃取套組 |
| DK3205722T3 (en) * | 2016-02-11 | 2018-11-26 | Sarstedt Ag & Co Kg | Device and methods for isolating nucleic acids from blood |
| MX2018012880A (es) * | 2016-04-22 | 2019-03-28 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Metodos para proporcionar arn de hebra sencilla. |
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| CN108130325A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-06-08 | 苏州优卡新材料科技有限公司 | 一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱 |
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