DE19946597A1

DE19946597A1 - Stabilisiertes Guanidinlthiocyanat und dessen Verwendung

Info

Publication number: DE19946597A1
Application number: DE1999146597
Authority: DE
Inventors: Klaus-Peter Stengele; Winfried Kolbeck; Bernd Schulz
Original assignee: Nigu Chemie GmbH
Current assignee: Nigu Chemie GmbH
Priority date: 1999-09-29
Filing date: 1999-09-29
Publication date: 2001-04-12
Also published as: WO2001023348A1

Abstract

Es wird stabilisiertes Guanidinthiocyanat beschrieben, welches 5 bis 5000 ppm, bezogen auf das Gewicht des Guanidinthiocyanats, Thioharnstoff und/oder N-Acetylcystein enthält. Aufgrund seiner ausgezeichneten Licht- und Temperaturstabilität und der geringen Wechselwirkung mit den biochemischen Systemen eignet sich das erfindungsgemäß stabilisierte Guanidinthiocyanat hervorragend als chaotrope Substanz bei der Isolierung von Nucleinsäuren aus biologischem Material.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft stabilisiertes Guanidinthiocyanat und dessen Verwendung als chaotrope Substanz bei der Isolierung von Nucleinsäuren aus biologischem Material.

Aufgrund der steigenden Bedeutung von DNA- oder RNA-Analysen im medizinischen und biotechnischen Bereich ist die Nachfrage nach einfachen und effektiven Methoden zur Isolierung von Nucleinsäuren aus biologischem Material sehr stark angestiegen.

So wird bspw. in der EP-PS 389 063 ein Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren aus komplexem biologischem Ausgangsmaterial beschrieben, wobei man das Ausgangsmaterial mit einer chaotropen Substanz und einer Nucleinsäure bindenden Festphase (wie z. B. SiO₂) mischt, die Festphase-Nucleinsäure-Komplexe abtrennt und ggf. nach dem Waschen die Nucleinsäure von den entsprechenden Komplexen eluiert. Als chaotrope Substanz, welche die Sekundär-, Tertiär- oder Quarternärstruktur des Proteins oder der Nucleinsäure ändert und zumindest die Primärstruktur intakt läßt, werden vorzugsweise Guanidinsalze und insbesondere Guanidinthiocyanat empfohlen.

Auch entsprechend der Veröffentlichung von Piotr Chomczynski et al. in Biotechnics, Vol. 22, Nr. 3 (1997) wird Guanidinthiocyanat im Gemisch mit Detergenzien als chaotrope Substanz beschrieben. Guanidinthiocyanat wird üblicherweise hierbei im Form einer wäßrigen Lösung, sog. Kits, eingesetzt, die üblicherweise noch Puffersalze und Hilfsreagenzien enthalten.

Nachteilig bei der Verwendung von Guanidinthiocyanat bei der Isolierung von Nucleinsäuren aus biologischem Material ist die Tatsache, daß Guanidinthiocyanat, insbesondere in Form der wäßrigen Lösungen, äußerst licht- und temperaturempfindlich ist. Vor allem im schwach sauren Medium (pH 4,5 bis 7,0) kommt es zu unerwünschten Redoxreaktionen, wobei elementarer Schwefel als Zersetzungsprodukt entsteht. Durch die Zersetzungsreaktion, die sich durch eine intensive Gelbfärbung bemerkbar macht, wird das eingesetzte Material in kürzester Zeit unbrauchbar.

Zur Lösung dieses Problems wurde bereits vorgeschlagen, den Guanidinthiocyanat-Lösungen Stabilisatoren in Form von Komplexbildnern, wie z. B. EDTA, zuzusetzen. Es hat sich jedoch gezeigt, daß derartige Komplexbildner mit dem biologischen Material unerwünschte biochemische Interaktionen eingehen.

Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein stabilisiertes Guanidinthiocyanat bereitzustellen, welches eine ausreichende Licht- und Temperaturstabilität aufweist und mit dem gleichzeitig keinerlei biochemische Wechselwirkungen mit den biologischen Ausgangsmaterialien festzustellen ist.

Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Guanidinthiocyanat 5 bis 5000 ppm bezogen auf das Gewicht des Guanidinthiocyanats, Thioharnstoff und/oder N-Acetylcystein enthält.

Es hat sich hierbei überraschenderweise gezeigt, daß durch diesen Zusatz die Licht- und Temperaturstabilität von Guanidinthiocyanat erheblich verbessert wird, ohne dessen Produkteigenschaften, insbesondere die spektroskopischen Eigenschaften, negativ zu beeinflussen.

Das erfindungsgemäß stabilisierte Guanidinthiocyanat enthält also 5 bis 5000 ppm, vorzugsweise 10 bis 100 ppm, (bezogen auf das Gewicht des Guanidinthiocyanats) Thioharnstoff und N-Acetylcystein. Das Guanidinthiocyanat kann hierbei sowohl in fester Form als auch als wäßrige Lösung vorliegen, die vorzugsweise eine Konzentration von 30 bis 70 Gew.-% aufweist und einen pH-Wert von 4,5 bis 7,0 besitzt.

Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung ohne weiteres möglich, daß die wäßrige Lösung noch die üblichen Puffersalze und Hilfsreagenzien enthält, die bei der Nucleinsäuren-Isolierung aus biologischen Materialien erforderlich sind. Vorzugsweise enthält die wäßrige Guanidinthiocyanat- Lösung noch 5 bis 50 mmol Puffersalze ausgewählt aus der Gruppe Natriumacetat, Natriumphosphat und Tris-Hydrochlorid. Als Hilfsreagenzien werden vorzugsweise Dithiothreid (DTT), Dithioerythrit (DTE) sowie Mercaptoethanol in einer Menge von 50 bis 100 mmol eingesetzt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die wäßrige Guanidinthiocyanat-Lösung noch 1 bis 10 Gew.-% an SiO₂-Partikeln, die bei der Nucleinsäuren-Isolierung als Festphase benötigt wird.

Die Herstellung des erfindungsgemäß stabilisierten Guanidinthiocyanats ist relativ unproblematisch, indem bspw. festes Guanidinthiocyanat mit den entsprechenden Mengen an Thioharnstoff und/oder N-Acetylcystein versetzt und anschließend homogen vermischt wird. Zur Herstellung von wäßrigen Guanidinthiocyanat-Lösungen kann bereits stabilisiertes Guanidinthiocyanat in die wäßrige Phase übergeführt werden oder wäßrige Guanidinthiocyanat-Lösungen mit den entsprechenden Mengen an Thioharnstoff und/oder N-Acetylcystein versetzt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des mit Thioharnstoff und/oder N-Acetylcystein stabilisierten Guanidinthiocyanats als chaotrope Substanz bei der Isolierung von Nucleinsäuren aus biologischem Material, wobei das Guanidinthiocyanat in Form einer wäßrigen Lösung ggf. mit den üblichen Zusätzen an Puffersalzen, Hilfsreagenzien und Festphasenmaterialien eingesetzt wird.

Aufgrund ihrer ausgezeichneten Licht- und Temperaturstabilität von mindestens 4 Monaten und der geringen Wechselwirkung mit den wichtigsten biochemischen Systemen hat sich das erfindungsgemäß stabilisierte Guanidinthiocyanat hervorragend in der Praxis bewährt.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiele Beispiel 1

Je 50 g festes Guanidinthiocyanat (Reinheit 99,6%) wird in eine Laborglasflasche (Schott, Duran, hell) gefüllt. Probe A1 wird unter Lichtausschluß gelagert, Probe A3 mit 1 mg Thioharnstoff (ca. 20 ppm) versetzt und intensiv durchmischt, Probe A4 mit 1 mg N-Acetyl-L-Cystein (ca. 20 ppm) versetzt und ebenfalls intensiv durchmischt, Proben A2, A3 und A4 sodann unter üblicher Tageslichteinstrahlung am Fenster gelagert. Die Proben wurden optisch auf Färbungen untersucht.

Beispiel 2

Je 50 g festes Guanidinthiocyanat (Reinheit 99,6%) wird in eine Laborglasflasche (Schott, Duran, hell) gefüllt und in 50 g vollentsalztem Wasser (Millipore Laborreinswassererzeugungs-anlage) gelöst. Probe A5 wird unter Lichtausschluß gelagert, Probe A7 mit 1 mg Thioharnstoff (ca. 10 ppm) versetzt und intensiv durchmischt, Probe A8 mit 1 mg N-Acetylcystein (ca. 10 ppm) versetzt und ebenfalls intensiv durchmischt, Proben A6, A7 und A8 sodann unter üblicher Tageslichteinstrahlung am Fenster gelagert. Die Proben wurden optisch auf Färbungen und nach intensivem Durchmischen auf Trübungen untersucht.

Beispiel 3

Je 2 g Lösungen wie unter Beispiel 2 hergestellt werden mit 100 mg SiO₂ (Aerosil, Akzo) versetzt. Probe B1 wird unter Lichtausschluß gelagert. Proben B2, B3 und B4 werden sodann unter üblicher Tageslichteinstrahlung am Fenster gelagert. Die Proben wurden optisch auf Färbungen und nach intensivem Durchmischen nach Absetzen der Silica Partikel auf Trübungen untersucht.

Claims

1. Stabilisiertes Guanidinthiocyanat, dadurch gekennzeichnet, daß es 5 bis 5000 ppm, bezogen auf das Gewicht des Guanidinthiocyanats, Thioharnstoff und/oder N-Acetylcystein enthält.

2. Guanidinthiocyanat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt an Thioharnstoff und/oder N-Acetylcystein 10 bis 100 ppm beträgt.

3. Guanidinthiocyanat nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in fester Form vorliegt.

4. Guanidinthiocyanat nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form einer wäßrigen Lösung mit einer Konzentration von 30 bis 70 Gew.-% vorliegt.

5. Guanidinthiocyanat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung einen pH-Wert von 4,5 bis 7,0 aufweist.

6. Guanidinthiocyanat nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung noch 5 bis 50 mmol Puffersalze, ausgewählt aus der Gruppe Natriumacetat, Natriumphosphat und Tris- Hydrochlorid, enthält.

7. Guanidinthiocyanat nach den Ansprüchen 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung noch mit 50 bis 100 mmol an Hilfsreagenzien, wie z. B. Dithiothreid (DTT), Dithioerythrit (DTE) sowie Mercaptoethanol, versetzt sind.

8. Guanidinthiocyanat nach den Ansprüchen 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung noch 1 bis 10 Gew.-% an SiO₂-Partikeln enthält.

9. Verwendung des stabilisierten Guanidinthiocyanats nach den Ansprüchen 1 bis 8 als chaotrope Substanz bei der Isolierung von Nucleinsäuren aus biologischem Material.