DE2517545A1 - Verfahren zur spektrometrischen bestimmung von anorganischem phosphat und waessrige loesung zur durchfuehrung desselben - Google Patents
Verfahren zur spektrometrischen bestimmung von anorganischem phosphat und waessrige loesung zur durchfuehrung desselbenInfo
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Description
» I
DIl-INt. OI»„..fN·. M. JC. t
OI^L.-rHY·. ON. OI^
Π PATENTANWÄLTE IN STUTTQART
A 41 192 b
US SN 463 405 18. April 1975
23. April 1974 le C/R
Pierce Chemical Company Rockford 111. V.St.A.
Verfahren zur cpektrometrisehen Bestimmung von
anorganischem Phosphat und wässrige Lösung zur Durchführung desselben
Die Erfindung betrifft die quantitative Bestimmung von anorganischem
Phosphor, vor allem die Bestimmung von Phosphor in biologischen Flüssigkeiten, welche Proteine enthalten können.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Einstufenverfahren zur Bestimmung der Phosphorkonzentration in menschlichen .Seren ohne
die Notwendigkeit Protein zu entfernen.
Es ist seit vielen Jahren bekannt, Molybdänsäure zur spektrophotometrischen
Bestimmung der Phosphorkonzentration anzuwenden (siehe Review vonR.G. Henry, Clinical Chemistry, Principals
and Techniques, Harper & Row, Hew York, 1964, Seiten 409 - 411
und R.J. Martinek, J. Am. Mod. Technol., 32, 337 (197O)).
Das Verfahren umfaßt im allgemeinen' die Zugabe eines Molybdatsalzes
wie Ammoniuinrnolybdat, einer Säure v/ie Schwefelsäure zur
Bildung von Molybdänsäure und einen Reduktionsmittel.^ wie p-Methyl-ammonium-phenol-sulfat zu der zu analysierenden Probe.
Unter saueren Bedingungen geht die Kolybdänaäure mit anorganischem
Phosphat eine komplexe Bindung unter Bildung von Phosphormolybdat ein, welches anschliessend unter Erzielung der charakteristischen
Molybdänblau-Farbe reduziert wird (wahrscheinlich Mo (VI) zu Mo (V)). Die Farbintensität kann dazu verwendet
werden, die Konzentration des Phosphormolybdatkoniplexes anzuzeigen
und damit die Konzentration den Phosphors in der Probe.
Um den Phosphormolybdatkomplex zu erhalten und anschliessend das Molybdän zu reduzieren sind saure Bedingungen erforderlich.
Ein großer Nachteil dieses Verfahrens besteht jedoch darin, daß unter sauren Bedingungen Molybdänsäure und Phosphormolybdat
Protein ausfällen, was eine unerwünschte Trübung der au analysierenden
Probe zur Folge hat. Dieser Nachteil wird verstärkt, wenn andere Protein ausfällende Reagenzien, wie z.B. Kupfer-II-sulfat,
anwesend sind. Das Kupfer-II-ion fordert nämlich die Bildung des Molybdänblau-Komplexes, weshalb seine Anwesenheit
erwünscht ist (Delsa.1 und Manhouri, Bull. Soc. Chim. Biol.
(Paris) 40, 623 (1958), mitgeteilt in Wootton, Micro-Analysis in Medical Biochemistry, 4th Ed., Churchill Ltd., London,
England, 1964, (Seiten 77 bis 78)).
Es wurde nun eine zur spektrophotometrischen Bestimmung von anorganischem Phosphor geeignete wässrige Lönung mit einem
Reduktionsmittel zur Reduktion eines Phosphormolybdat-Komplexes unter Erzielung seiner charakteristischen blauen Farbe gefunden,
wobei sich die Lösung dadurch auszeichnet, daß sie auch ein langkettiges Aminokohlenwasserstoff-AthylenoxydAddukt oder des-
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sen quaternäres Derivat, das in saurer Lösung kationisch ist
und lipophile und hydrophile nichtionioche Gruppen aufweist, in einer ausreichenden Menge enthält, um die Ausfällung ^von
Protein aus einer Protein, Molybdänsäure und einen Phosphomolybdatkomplex
enthaltenden Lö'sung zu verhindern.
In saurerLb"sung liegen diese Verbindungen in Form kationischer
Amoniumealze vor. Man nimmt an, daß diese Salze aufgrund ihres kationischen und lipophilen Charakters mit den anwesenden
Molybdänverbindungen uryi möglicherweise auch mit dein Protein
komplexe Verbindungen eingehen. Die Polyäthergruppen dieser Verbindung, halten, da sie hydrophil sind, die entstandene
komplexe Struktur in Lösung, und vermeiden so die Eildung eines Niederschlags.
Besonders wertvolle Addukte oder deren quaternäre Derivate entsprechen der folgenden allgemeinen Formel
σ1
Y-0-CH2-CH20H
η -m
worin A~ ein nicht störendes, nicht mit dem Phosphor um das
Molybdän konkurrierendes und eine Beeinträchtigung der charakteristischen blauen Farbe eines Phosphormolybdatkomplexes nicht
förderndes Anion und wobei in 1, 2 oder mehr ist} -worin B eine
lipophile Gruppe mit etwa 6 bis 28 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 14 bis 22 Kohlenstoffatomen ist; worin C Wasserstoff
oder CH2-CH2(OCH2CHg)x-O-CH2-CH2OH bedeutet; worin R Wasserstoff
oder eine lipophile Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise CH, bedeutet; worin X und Y ganze Zahlen sind,
deren Summe 5 bis 30, vorzugsweise 5 bis 20 int, wobei die
ganzen Zahlen X und Y etwa gleich groß sind; und worin η 0 oder
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1 ist.
Aus der obigen Formel ergibt sich, daß quaternisierte Verbindungen
vorliegen, wenn η 1 ist. In dienern Fall ist auch das nicht störende Anion A vorzugsweioe Cl , SO0 oder CILz-O-SO.*.
Es können auch ähnliche Anionen verwendet v/erden, wie z,B. andere Halogene d.h. Br"", F", oder Alkoxysulfite und Polycarboxylate
mit einem niederen Molekulargewicht. Die Anwendung von
Arsenaten, Phosphaten und dergl., welche mit Molybdän reagieren
können, soll natürlich vermieden werden.
Was die lipophilen Gruppen B und R betrifft, so können diese nur eine Kettenlänge aufweisen, welche die Wasserlöslichkeit des
Addukte nicht beeinträchtigt. B soll deshalb keinen Kohlenstoffgehalt von über etwa 28 Kohlenstoffatomen aufweisen. Auch soll,
wenn das Addukt in quaternärer Form vorliegt, η also 1 ist, der
Kohlenstoffgehalt von R 10 nicht wesentlich überschreiten. Die lipophilen Gruppen sind vorzugsweise gesättigte Kohlenwasserstoffe,
d.h. geradkettige oder verzweigte Alkyle, obwohl Aryl-,
Alkylaryl- und cycloaliphatische Reste enthaltende Gruppen ebenfalls brauchbar sind. Dementsprechend können die Gruppen, solange
sie lipophil bleiben, Substituenten wie z.B. Halogene
sowie Äther- oder Thioäther-Einheiten aufweisen.
Die Anwesenheit von A'thylenoxyd in der Verbindung ist schliess-Iieh
von Bedeutung, um die hydrophile Funktionalität (functionality) zu gewährleisten. Damit jedoch der kombinierte lipophile
und hydrophile Charakter des Addukts nicht nachteilig beeinflußt
wird, soll der Äthylenoxydgehalt den oben angegebenen Wert nicht überschreiten. Vorzugsweise ist die Gruppe C in der
obigen Formel ein Polyäthylenoxyd, wobei X ungefähr denselben Wert besitzt wie Y.
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Wertvolle Addukte und deren quaternisierte Derivate v/erden im
Handel von der Arinark Corporation unter den Hand einnähen
Ethomeen bzw. Ethoquad angeboten.
Die Menge des verwendeten Addukts ist nicht besonders kritisch,
solange eine Menge angewandt wird, die ausreicht, um die Ausfällung
von Protein zu verhindern. Zur Bestimmung der geeigneten
anzuwendenden Menge können einfache Versuche durchgeführt werden. Im allgemeinen soll das Addukt in einer Menge von
mindestens etwa 25 mg anwesend sein und gewöhnlich nicht mehr als 155 mg, bezogen auf 100 Mikroliter der zu analysierenden
Probe. Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Teile und Prozentangaben gewich tsbezogen.
Es wurden 4 Liter einer wässrigen Lösung durch Zugabe der im folgenden genannten Bestandteile zu entionisiertem Wasser hergestellt:
150 g Ethoquad 18/25, ein quaternäres Arninokoblenwasserstoff-Äthylenoxyd-Addukt.
In dieser Verbindung ist, bezogen auf die obige Formel, R Methyl, B ist ein linearer,
gesättigter, aliphatischer Rest mit etwa 18 Kohlenstoffatomen, C ist eine Polyäthylenoxyd-Crujjpe aus etwa
15 Kolen Äthylenoxyd, A ist Cl, m und η sind 1.
100 ml CH3COOH ) pu uifl clmm „
40 g CH3COONa.3H2O j 3 zu gewührlels1*n
20 g (CH3NH2- /*"*\ -OH)2SO4 (Reduktionsmittel)
40 g Na2S2Oc (schützt das Reduktionsmittel vor Zersetzung
und wirkt ebenfalls als Reduktionsmittel). Durch Zugabe der folgenden Bestandteile zu entionisiertem
Wasser wurden 500 ml einer zweiten wässrigen Lösung
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herg stellt:
5 β (IiII4)6Κο?024· 7H2O
3 g Cu3O4·5H2O
3 g Cu3O4·5H2O
6 ml conz. H2SO4 (verhindert Mo-Cu Niederschlag).
Dann wird durch Vermischen von 10 Volumteilen der ernten der
oben angegebenen Lösungen mit 1 Volumteil der zweiten Lösung ein Arbeitsreagens hergestellt. Das Arbeitsreagens ist bei
Zimmertemperatur mindestens etwa 4 Stunden stabil. Dann werden 3 ml des Arbeitsreagens mit 0,100 ml (100 Mikroliter) ,der zu
analysierenden Probe, s.B. Serum, Urin etc kombiniert. Die erhaltene
Lösung wird etwa 30 Minuten stehengelassen. Nach dieser
Zeit hat sich die charakteristische Molybdänblau-Parbe im wesentlichen
voll entwickelt. Die Absorption der Lösung wird dann bei etwa 660 bis 700 nm, vorzugsweise bei 690 nm abgelesen, unter
Verwendung einer Blindprobe aus 100 Mikroliter Wasser und 3 ml Arbeitsreagens.
Unter Verwendung von Proben mit bekannten Phosphorkonzentrationen
kann in üblicherweise eine geeignete Eichkurve angelegt
werden, um die Phosphormenge in den Proben mit unbekanntem Phosphorgehalt quantitativ zu bestimmen. Dabei sollte bei der
Eichung und bei der zu untersuchenden Probe derselbe Zeitabstand
von der Zugabe des Arbeitsreagens bis zur Ablesung der
Absorption angewandt werden, obwohl dies weniger kritisch ist
bei Abständen von 30 Minuten oder mehr. Das Beer'sehe Gesetz
hat Gültigkeit in einem Konzentrationsbereich von etwa 0 bis mg P/dl, und im allgemeinen bis zu 15.
Da ein spezielles Arbeitsreagens beschrieben wurde, wird festgestellt,
daß die Konzentrationen der hier in an sich bekannter
V/eise angewandten Bestandteile variieren können, z.B. um
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- 10 c/>. In ähnlicher Weise können verschiedene Puffer, Reduktionsmittel,
Säuren, Kupfersalze, H-Wert und dergl. angewandt
werden, solange -sie die. Bestimmung von Phosphor in der anregebenen
Weise nicht nachteilig beeinflussen. Insbesondere können Mischungen von 3-Buten-l, A-äiol und entweder ο-Phenylen^diamin
oder 2,4-Diaminophenol-dihydrochlorid in etwa gleichen Gewichtsmengen
als Red\*ktionsmittel anstelle des speziell beschriebenen
p-Methyl-Ar."inoniuTn-Phenol-Sulfats verwendet werden.
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Claims (1)
- Patentansprüche.) Zur spektrophotoraetrischen Bestimmung von anorganischem Phosphor geeignete wässrige Lösung mit einem Reduktionsmittel zur Reduktion eines Phosphormolybdat-Komplexes unter Erzielung seiner charakteristischen blauen Farbe, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung auch ein wasserlösliches, langkettiges Aminokohlenwasserstoff-Äthylenoxyd-Addukt oder dessen quaternäres Derivat, das in saurer Lösung kationisch ist und lipophile und hydrophile nichtionische Gruppen aufweist, in einer ausreichenden Menge enthält, um die Ausfällung von Protein aus einer Protein, Molybdänsäure und einen Phosphormolybdatkomplex enthaltenden Lösung zu verhindern.Wässrige Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Addukt oder dessen qiiternäres Derivat der folgenden allgemeinen Formel entsprichtC1 IB-N-CH2-GH2-(OCH2CH2)Y-O-GH2-CH2OH . mRnη
A.worin A~ ein nicht störendes, 'nicht mit dem Phosphor um das Molybdän konkiirrierendes und eine Beeinträchtigung der charakteristischen blauen Farbe eines Phosphormolybdatkomplexes nicht förderndes'Anion ist, wobei m 1,2 oder mehr ist; worin B eine lipophile Gruppe mit etwa 6 bis 28 Kohlenstoffatomen ist, worin C Wasserstoff oder CH2-CH2-(0CH2CH2)x-0-CHp-CH2OH bedeutet; worin R Wasserstoff oder eine lipophile Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet und X und Y ganze Zahlen sind, deren Summe 5 bis 30 ist und worin η 0 oder 1 ist.509846/0 7363. Wässrige Lösung nach Anspruch 2, Ί a d u r c h g ε k e η η zeichnet, daß A~m die Bedeutung Cl", SO2 oder CII,-O-SO,~ besitzt; daß B eine lipophile Gruppe mit etwa 14 bis 22 Kohlenstoffatomen ist; daß C die Gruppe -CH2-CH2-(OCII0CH2^-CH2-CH2OH bedeutet, und X und I ganze Zahlen mit einer Summe von 5 bis 20 sind.4. Wässrige Lösung nach Anspruch 3, dadurch gek.enn zeichnet,
tung CH, besitzt.zeichnet, daß A die Bedeutung Cl und R die Bedeu-5. Wässrige Lösung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß X und Y etwa gleich große ganze Zahlen sind,6. Wässrige Lösung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß η Null ist.7. Wässrige Lösung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß η 1 ist.8. Verfahren sur spektrophotometrischen Bestimmung von anorganischem Phosphat durch komplexes Binden (complexing) des zu analysierenden anorganischen Phosphats mit Molybdän unter Bildung eines Phosphomolybdatkomplexes, Reduzieren des Komplexes unter Ausbildung seiner charakteristischen Blaufarbe und spektrophotometrisches Hessen der Farbintensität des reduzierten Komplexes, dadurch gekennzeichnet, daß die spektrophometrische Messung der T?arbintensität in einer wässrigen Lösung eines langkettigen Aminokohlenwasserstoff-Athylenoxyd-Addukts oder dessen quaternären Derivats erfolgt, das in saurer Lösung kationisch ist und lipophile und hydrophile nichtionische Gruppen enthält, wobei dieses Addukt oder sein quaternäres Derivat in einer509846/0 738ίοausreichenden Menge anwesend ist, um die Ausfällung von Protein in dieser wässrigen lösung zu verhindern.509846/0 738
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