DE3339042A1 - Colorimetrisches reagens zur bestimmung von (beta)-lipoproteinen - Google Patents
Colorimetrisches reagens zur bestimmung von (beta)-lipoproteinenInfo
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Description
Colorimetrisches Reagens zur Bestimmung von ß-Lipoproteinen
Die Erfindung betrifft die Anwendung eines "ß-Lipoprotein-Farbstoffs"
zu Identifizierung von ß-Lipoproteinen. Insbesondere betrifft sie die Verwendung eines "ß-Lipoprotein-Farbstoffs"
in Pufferlösung und in Gegenwart von geeigneten kationischen oder nicht-ionischen grenzflächenaktiven Substanzen
und anionischen Gruppen, die von Metallsalzen oder von anorganischen Säuren stammen zur semiquantitativen oder
quantitativen Bestimmung von ß-Lipoproteinen.
Es ist bekannt, daß Lipoproteine als Flüssigkeitsträger im Blut wirken.
Sie können in vier Hauptgruppen eingeteilt werden, die sich durch die Zusammensetzung der Flüssigkeiten (die sie tra-
gen) t der irägerproteine ihre Größe, Dichte, elektrophoretisch^
Mobilität und ihre Antigeneigenschaften unterscheiden.
/2
Drei Lipoproteinfraktionen können im Serum, das beim Fasten
entnommen und gewonnen wird (Nüchternserum) bestimmt werden, nämlich VLDL (very Low Density Lipoproteins), LDL (Low Density
Lipoprotein) und HDL (High Density Lipoprotein). Im Serum, das nach dem Essen entnommen wird, ist eine vierte
Fraktion vorhanden, nämlich Chylomikronen, deren Vorhandensein im Nüchternserum pathologisch ist.
Die Bestimmung der verschiedenen Lipoproteinfraktionen ist von beträchtlichem klinischem Interesse, da sie direkt zusammenhängen
mit der Pathologie der Arteriosklerose. Die
üblichen Verfahren zur Bestimmung der verschiedenen Lipoproteinfraktionen sind
1) Elektrophorese
2) Ultrazentrifugation
1) Elektrophorese
2) Ultrazentrifugation
3) Immunologische und immunoelektrophoretische Verfahren und
4) Immunonephelometrische Verfahren
Es sind auch colorimetrische Verfahren bekannt, bei denen die Proteinkonzentration mehr oder weniger näherungsweise
erhalten wird durch Bestimmung von Cholesterin und Lipiden, die an die Proteine gebunden sind.
Insbesondere sind in Beziehung auf die LDL's, d.h. die Proteine,
die zur Zeit als diejenigen angesehen werden, die direkt in Beziehung stehen zum Auftreten von Arteriosklerose
keine direkten spe ktrophotometrischen Verfahren zu ihrer Bestimmung bekannt.
Es hat sich nun gezeigt, daß ß-Lipoproteine spezifisch mit
einem "ß-Lipoprotein-Farbstoff" reagieren.
Die Erfindung betrifft die Verwendung (bei der Indentifizierung von ß-Lipoproteinen) eines "ß-Lipoprotein-Farb-
/3
Stoffs", der ausgewählt ist aus Triphenylmethan-derivaten, bei denen das Vorhandensein der Wasserstoffsubstituenten,
wie sie in der allgemeinen Formel I angegeben sind, wesentlich ist:
XOOC.
(I)
wobei R, und R2 gleich oder unterschiedlich sind und jeweils
ein Halogenatom bedeuten und X ein Wasserstoffatom oder ein einwertiges Kation bedeutet und die nicht ausdrücklich
angegebenen am aromatischen Ring gebundenen Wasserstoff atome ebenfalls substituiert sein können.
Die Erfindung betrifft auch eine Zubereitung (zur Bestimmung von Lipoproteinen), umfassend:
i) "ß-Lipoprotein-Farbstoff" in Pufferlösung, ii) ein Qelat bildendes Mittel, das im Stande ist, in der
Probe vorhandene störende Metallionen zu chelatisieren,
um eine spezifischere Reaktion zu erhalten,
iii) anorganische und anionische Gruppen und iv) gegebenenfalls kationische oder nicht-ionische
grenzflächenaktive Mittel.
Ein solches Mittel kann beispielsweise enthalten
a) ein Puffersystem, das imstande ist einen pH-Wert zwischen
3 und 7 aufrechtzuerhalten,
b) ein Che1at bildendes Mittel, das imstande ist, Metall-
/4
ionen und insbesondere Eisen zuchelatisieren.
Besonders geeignete Ghelat bildende Mittel sind Citronensäure und deren Salze und EDTA (Ethylen-diamin-tetraessigsäure)
und deren Salze, die auch als Puffer wirken können.
c) Ein kationisches oder nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel und besonders kationische grenzflächeaktive
Mittel wie Salze von quaternären Aminoniumbasen, in denen
dieInicht)hydrophoben Gruppen Alkylreste sind. Dabei hat
ο sich Cetyltrimethylammonium-bromid als besonders geeignet
erwiesen.
d) Anionische Gruppen bzw. Anionen wie Halogenide, Nitrate, Sulfate, Phosphate usw., die zu dem Gemisch in Form von
Salzen oder Säuren zugesetzt werden können.
Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde bestimmt
durch chromatographische Isolierung der Proteine von gepooltem Humanserum, das unter geeigneten Bedingungen eine
positive Reaktion mit einem "ß-Lipoprotein-Farbstoff" gab und immunolgische Identifizierung mit Hilfe spezifischer
Antisera. ι
Gleichzeitig wurde sichergestellt, daß die anderen fraktio-
I nierten Serumproteine keine positive Reaktion mit dem "ß-Lipoprotein-Farbstoff" unter analogen Bedingungen ergaben
.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Reagenszusammensetzung zur Identifizierung von Lipoproteinen
A) Reagens: Puffer;K-Acetat 0,5 m
/5
Cetyltrimethylammonium-bromid 270 mg/1 Mordant Bleu 1 70 mg/1
MgCl2.6H2O 60 g/l
Citronensäure 0,026 m
Dreibasisches Na-Citrat 0,038 m
MgCl2.6H2O 60 g/l
Citronensäure 0,026 m
Dreibasisches Na-Citrat 0,038 m
B) Gleiches Reagens, wobei jedoch anstelle von Mordant Bleu 1, Mordant Bleu 29 in einer Konzentration von
80 mg/1 enthalten war.
0 Beispiel 2
A) 0,1 ml Serum wurde zu 2 ml des oben erwähnten Reagens A zugegeben. Das Absorptionsspektrum des so erhaltenen Reak-5
tionsgemisches wurde mit einem Spektrophotometer gegenüber
einer Blindprobe aus 2 ml Reagens und 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung abgelesen. Eine Spitze zwischen 640
und 590 nm mit einem Absorptionsmaximum zwischen 600 und 610 nm zeigt das Vorhandensein von ß-Lipoproteinen in dem
Serum an.
B) 0,1 ml Serum wurden zu 2 ml des oben erwähnten Reagens
B gegeben, wobei entsprechend Beispiel 2A) gearbeitet wurde, Eine Spitze zwischen 640 und 570 nm mit einem Absorptionsmaximum zwischen 580 und 590 nm zeigt das Vorhandensein
von ß-Lipoproteinen im Serum an.
Reagenszubereitung zur Bestimmung von Lipoproteinen Das Reagens bestand aus
- Chromogene Lösung entsprechend den Reagentien nach Beispiel 1
- Leer-Lösung: Identisch der chromogenen Lösung jedoch ohne
"ß-Lipoprotein-Farbstoff".
/6
Bestinunung von ß-Lipoproteinen in Humansera
Die folgenden Bestandteile wurden entsprechend dem folgendem Schema in Reagensgläser pipetiert
Probe Blindprobe 1 Seirum-Blindprobe Blindprobe
Serum 0,05 - 0,05
physiologische Kochsalz- - 0,05 - 0,05
lösung
chromogene Lösung 1,5 1,5
Leer-Lösung - - 1,5 1,5
Nach 20 min wurde die optische Dichte der Probe bei 610 bis
620 nm gegenüber der Blindprobe 1 (A,) und die optische
Dichte der Serum-Blindprobe bei 615 bis 620 nm gegenüber der Blindprobe 2 (C„) abgelesen. A, d.h. A, - A_ ist proportional
zu der ß-Lipoprotein-Konzentration im Serum.
Vergleich
80 Humansera wurden nach dem Verfahren des Beispiels 4 untersucht.
Die Lipoproteine wurden in dem gleichen Serum nach dem Radi al-Iinmunodif fusionsverfahren (Platten von Behringwerke
AG) bestimmt. Der Korrelationskoeffizient, der nach den beiden Verfahren erhaltenen Ergebnisse;r beträgt
0,86.
6238 BAD ORIGINAL
Claims (4)
1.) Colorimetrisches Reagens zur Bestimmung von ß-Lipoproteinen,
umfassend ein Triphenylmethan-derivat der Formel
KO
XOOC
(D
in der R, und R„ gleich oder verschieden sind und jeweils
ein Halogenatom bedeuten und X ein Wasserstoffatom oder ein
einwertiges Kation sein kann und die in der Formel nicht ausdrücklich angegebenen Wasserstoffatome der aromatischen
Ringe ebenfalls substituiert sein können.
2 * Colorimetrisches Reagens nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet , daß das Triphenylmethan-derivat Mordant Bleu 1 (C.I. 43830) oder Mordant Bleu 29 (CI.
43825) ist.
3, Colorimetrisches Reagens nach Anspruch 1 oder 2, bestehend
aus
/2
a) mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel I in Pufferlösung,
b) einem Oelat bildenden Mittel,
c) anorganischen Anionen und
d) gegebenenfalls kationischen oder nicht-ionischen grenzflächenaktiven
Mitteln.
4. Anwendung des colorimetrischen Reagens nach Anspruch
1 bis 3 zur Identifizierung von ß-Lipoproteinen.
6238
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