DE1255353C2 - Verfahren zur Herstellung eines Diagnostiziermittels zur Bestimmung von Eiweiss in biologischen Fluessigkeiten - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines Diagnostiziermittels zur Bestimmung von Eiweiss in biologischen FluessigkeitenInfo
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Description
Der qualitative und quantitative Nachweis von Eiweiß in biologischen Flüssigkeiten, z. B. im Urin,
hat eine große diagnostische Bedeutung, insbesondere bei Nierenerkrankungen, aber auch bei Kreisläufschwäche,
Arteriosklerose, Hypertonie, Diabetes. Es ist eine Reihe von Methoden zum Nachweis von
Eiweiß bekanntgeworden, z. B. die Sulfosalicylsäureprobe, Essigsäure-Kochprobe, Salpetersäure-Ringprobe,
Pikrinsäureprobe; alle diese Methoden beruhen auf Fällungsreaktionen und sind ohne Laboratoriums-
- geräte nicht durchführbar. Für schnelldiagnostische Zwecke kommen diese Reaktionen daher nicht in
Betracht; hierfür benötigt man eine einfache Farbreaktion, welche auch durch ungeschultes Personal
routinemäßig durchgeführt werden kann, z. B. mit Hilfe von Testpapieren.
Eine für den Eiweißnachweis geeignete Färbreaktion wurde erstmals von F e i g 1 et al. (Mikrochim.
Acta, 2, 1937, S. 107) beschrieben. Diese Reaktion nutzt den bei verschiedenen Indikatoren
bekannten »Protein-Fehler« aus:
Wird der pH-Wert des Reagenzes unterhalb des Indikatorumschlagbereiches gehalten, so tritt bei
Zugabe von Eiweißlösung eine Farbänderung ein, die vom pH-Wert unabhängig ist und durch den
Eiweißgehalt bedingt wird; die Farbintensität der entstehenden Farbe ist abhängig von der Konzentration
des Eiweiß in der zu prüfenden Lösung. F e i g 1 arbeitete diesen Eiweißnachweis als Tüpfelreaktion
aus, wobei er als Reagenzien das Kaliumsalz des Tetrabromphenolphthaleinäthylesters und Essigsäure
verwendete. Zur Herstellung von Eiweißtestpapieren auf Basis der Feigl-Reaktion muß natürlich
die Essigsäure durch eine nichtflüchtige Säure ersetzt werden; nach den Verfahren der britischen Patentschriften
814 223, 826 066 und 840 362 verwendet man hierfür zweckmäßig eine saure Puffersubstanz,
wie z. B. Citratpuffer, sowie gewünschtenfalls oberflächenaktive Mittel! Die auf diese Weise erhaltenen
Eiweißteststreifen befriedigen jedoch nicht völlig, da die Farbkontraste von negativer und positiver Eiweißprobe
in Konzentrationsbereichen unterhalb von 0,1% Eiweiß sehr wenig differieren; der positive Test
fällt mehr oder weniger stark gelbgrün aus, der negative Test ist grüngelb und ist dunkler gefärbt
als der trockene Teststreifen. Auch läßt die Empfindlichkeit dieser Testpapiere einiges zu wünschen übrig
(Nachweisgrenze etwa 0,03 bis 0,01 % Eiweiß). Es ist für den Mediziner aber erforderlich, Eiweiß
im Harn in derselben Verdünnung nachweisen zu können, wie es mit der Essigsäure-Kochprobe
möglich ist; demnach müssen noch 0,005°/0 Eiweiß
im Harn einwandfrei diagnostiziert werden kön- * nen.
Bei dem Verfahren der obengenannten britischen Patentschriften wird der saugfähige Träger mit einer
Lösung imprägniert, welche die Puffersubstanz zusammen mit dem Farbstoffindikator enthält. Aus der
belgischen Patentschrift 642 648 ist bekannt, daß man wesentlich empfindlichere Eiweißtestpapiere erhält,
wenn man die Puffersubstanz und den Farbstoffindikator getrennt, d. h. nacheinander auf den Träger
aufbringt. Die hierbei erhaltenen Testpapiere sind schwach gelb gefärbt und geben mit eiweißhaltigem
Urin kräftige Blaufärbungen, die entsprechend der Eiweißkonzentration abgestuft sind und sich deutlich
von der gelben Färbung des negativen Testes abheben. Es können bis 0,005% Eiweiß-einwandfrei nachgewiesen
werden. Bei längerer Lagerung jedoch werden diese Eiweißteststreifen allmählich graustichig
und verlieren dadurch an Empfindlichkeit. Außerdem beobachtet man an den bekannten Eiweißtestpapieren auch bei eiweißfreiem Harn gelegentlich
schwach positive Reaktionen, was auf unbekannte Harnbestandteile zurückzuführen ist; zuweilen wird
diese Fehlanzeige durch überhöhte Mengen von Kreatinin im Harn hervorgerufen.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß man sehr empfindliche und stabil gelbgefärbte Eiweißtestpapiere
herstellen kann, die auch nicht zu Fehlanzeigen bei Anwesenheit unbekannter Harnbestandteile
neigen, wenn die Testpapiere zusätzlich mit Lösungen anorganischer Sulfate imprägniert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Diagnostiziermittels zur Bestimmung von Eiweißin
biologischen Flüssigkeiten, bestehend aus einem Farbstoffindikator, welcher den sogenannten »Protein-Fehler«
aufweist, einer sauren Puffersubstanz und gewünschtenfalls einem oberflächenaktiven Mittel
sowie einem saugfähigen Träger ist demgemäß dadurch gekennzeichnet, daß man den saugfähigen
Träger zusätzlich mit einer 1- bis 10%igen Lösung eines anorganischen Sulfates bzw. Gemischen derselben
in einem organischen Lösungsmittel imprägniert. Bevorzugte anorganische Sulfate sind Magnesium-
und/oder Zinksulfat. Bevorzugte Lösungsmitel sindstark polare, leichtflüchtige Lösungsmittel, wie Methanol
oder Äthanol.
Als Farbstoffindikatoren kommen solche in Betracht, die einen großen Eiweißfehler bei einem Indikatorumschlag
in sauren pH-Bereich haben, insbesondere Tetrabromphenolphthaleinäthylester und -butylester
sowie Tetrabrombenzaurin. Als Puffer ist grundsätzlich jedes Puffersystem einsatzfähig, das auf einen
pH-Wert unterhalb 7,0 eingestellt werden kann; vorzugsweise wird Citratpuffer, d. h. eine wäßrige
Lösung von Citronensäure und tert.Natriumcitrat, verwendet.
Um die Saugfähigkeit der Testpapiere und damit deren Reaktionsgeschwindigkeit und Empfindlichkeit
zu erhöhen, setzt man den Imprägnierlösungen zweckmäßig eines der üblichen oberflächenaktiven
Mittel zu. Brauchbare oberflächenaktive Mittel sind z. B. Fettalkoholsulfonate, Alkylarylsulfonate, PoIycarbonsäureestersulfonate.
Besonders bewährt haben sich bei den neuen Testpapieren stickstoffhaltige anionenaktive Netzmittel, wie Fettsäuretauride, Fettsäureglycide,
Polycarbonsäure-alkylamidsulfonsäuren, Alkylsulfonglycide und N-substituierte Fettamidsulfonate.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Diagnostiziermittel erfolgt in an sich üblicher Weise: Der
saugfähige Träger, z. B. Filterpapier, wird entweder nach den Vorschriften der obengenannten britischen
Patentschriften mit einer Lösung imprägniert, welche die Puffersubstanz zusammen mit dem Farbstoffindikator
enthält; nach der Trocknung wird das Eiweißtestpapier üblicher Zusammensetzung mit einer
1 bis 10°/0igen Sulfatlösung imprägniert und erneut getrocknet. Vorzugsweise wird jedoch nach der
Vorschrift der belgischen Patentschrift 642 648 verfahren,
d. h., man trägt zuerst die Puffersubstanz auf' und imprägniert dann erst mit der Indikatorfarbstofflösung,
welche zusätzlich das Sulfat enthält. Die auf diese Weise erhaltenen Eiweißteststreifen können
als solche verwendet oder aber nach dem Verfahren der belgischen Patentschrift 629 300 mit Kunststoff- '
folien eingesiegelt werden. Im letzteren Fall hat es sich als zweckmäßig erwiesen, wenn man das Testpapier
mit einem zweiten, nicht imprägnierten Papierstreifen zusammen einsiegelt; hierdurch wird eine
gleichmäßigere Färbung des Teststreifens bei Durchführung der Nachweisreaktion gewährleistet.
Bei dem Verfahren der belgischen Patentschrift 642 648 ist die Auswahl eines geeigneten Lösungsmittels
für den Indikator von großer Bedeutung: wird hierfür Methanol oder Aceton verwendet, so erhält man ein
Testpapier, das bei einer grünen Grundfarbe mit mehreren blauen Flecken durchsetzt ist; gleichmäßig
gelbgefärbte Eiweißtestpapiere erhält man nur bei Anwendung von Halogenkohlenwasserstoffen als Lösungsmittel.
Überraschenderweise lassen sich nun nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung durch den
Zusatz von Sulfaten auch bei Benutzung von Methanol oder Äthanol als organischem Lösungsmittel
für den Indikatorfarbstoff gleichmäßig kräftig gelbgefärbte Papiere herstellen.
Die erfindungsgemäß hergestellten, sehr empfindliehen
und stabil kräftig gelbgefärbten Eiweißtestpapiere, die auch nicht zu gelegentlicher positiver
Reaktion bei eiweißfreiem Harn neigen, gewähren eine erhöhte Sicherheit bei der Benutzung als diagnostisches
Mittel und vereinfachen durch den deutlicheren Farbumschlag von Gelb nach Blau die praktische
Anwendung dieses Diagnosticums.
In den nachstehenden Beispielen ist das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert.
60 Beispiel 1
Filterpapier (Schleicher & Schüll Nr. 2316) wird zunächst mit einer Imprägnierlösung folgender Zusammensetzung
imprägniert und an der Luft getrocknet:
2molares tert.Natriumcitrat 11 ml
2molare Citronensäure 39 ml
Tetrabromphenolblau 0,04 g
Äthanol 50,0 ml
Anschließend wird das Papier mit einer 5%igen methanolischen Magnesiumsulfatlösung getränkt und
erneut getrocknet.
Das getrocknete Papier ist gelblich gefärbt und zeigt Eiweiß im Harn bis zu einer Konzentration von
0,01 % einwandfrei an. Das Papier ändert seine Farbe aberzieht, wenn es mit eiweißfreiem normalem Urin,
besonders auch mit stark kreatininhaltigem Urin, befeuchtet wird. Die nicht mit Magnesiumsulfat
behandelten Papiere zeigen dagegen bei normalem, eiweißfreiem Urin je nach Art des Urins gelegentlich
schwache Reaktionsfärbungen, ebenfalls bei kreatininhaltigem Urin, was einen geringen Eiweißgehalt im
Urin vortäuschen kann.
Filterpapier (Schleicher & Schüll Nr. 2316) wird zunächst mit einer Pufferlösung folgender Zusammensetzung
getränkt und dann an der Luft getrocknet:
Tert.Natriumcitrat 9,80 g
Citronensäure 3,50 g
Natriumlaurylsülfat 0,05 g
Aqua destillata ad 100,0 ml
Anschließend wird das Papier mit einer Indikatorlösung folgender Zusammensetzung getränkt und
erneut getrocknet:
Tetrabromphenolphthaleinäthylester 40 mg
Magnesiumsulfat 5 g
Methanol (oder Äthanol) ...... ad 100 ml
An Stelle der magnesiumsulfathaltigen Lösung kann auch eine zinksulfathaltige folgender Zusammensetzung
verwendet werden:
Tetrabromphenolphthaleinäthylester 40 mg
Zinksulfat 5 g
Methanol ad 100 ml
Das getrocknete Papier wird aufgerollt, und die Rollen werden quer auf die gewünschte Breite von
5 mm geschnitten. Die auf diese Weise erhaltenen Teststreifen sind gelblich gefärbt und ändern ihre Farbe
nicht, wenn sie mit eiweißfreiem Urin befeuchtet werden. Eiweiß im Harn zeigt sich durch Blaufärbungen,
die je nach Eiweißgehalt abgestuft sind. So kann Eiweiß im Harn bei einer Konzentration
von 0,005 °/0 noch nachgewiesen werden.
Filterpapier (Schleicher & Schüll Nr. 2316) wird zunächst mit einer Pufferlösung folgender Zusammensetzung
getränkt und dann an der Luft getrocknet:
Tert.Natriumcitrat 9,80 g
Citronensäure 3,50 g
Natriumsalz eines Fettsäuremethyl-
glycids (»Medialan KA, konz.«) 0,05 g
Destilliertes Wasser ad 100,0 ml
Destilliertes Wasser ad 100,0 ml
Anschließend wird das Papier mit einer Indikatorlösung folgender Zusammensetzung getränkt und
erneut getrocknet:
Tetrabromphenolphthaleinäthylester 40 mg
Magnesiumsulfat ................ 5 g
Magnesiumsulfat ................ 5 g
Methanol ....'■ ad 100 ml
Man erhält so ein gelbgefärbtes Testpapier, das seine Farbe bei eiweißfreiem Urin nicht ändert und
bei Eiweiß im Harn je nach Eiweißgehalt abgestufte Blaufärbungen anzeigt. Es läßt sich bis zu einem
Gehalt von 0,001 % Eiweiß im ■ Harn noch eine Farbreaktion einwandfrei beobachten.
Die Stabilitätsprüfung der nach den Beispielen 1, 2 und 3 hergestellten Eiweißtestpapiere wurde durchgeführt,
indem man die Testpapiere 12 Wochen bei 400C lagerte. Sie zeigten gegenüber Mustern, die bei
Raumtemperatur gelagert wurden, keine Unterschiede im Aussehen und in der Reaktionsempfindlichkeit;
die gelbe Farbe blieb unverändert. Demgegenüber verfärbten sich Eiweißtestpapiere, die ohne die
Verwendung von Sulfaten hergestellt wurden, schon nach kurzer derartiger Lagerung von Gelb nach Grau.
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostiziermittels zur Bestimmung von Eiweiß in biologischen
Flüssigkeiten, bestehend aus einem Färbstoffindikator, welcher den sogenannten »Protein-Fehler«
aufweist, einer sauren Puffersubstanz und gewünschtenfalls eirfem oberflächenaktiven Mittel
sowie einem saugfähigen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß man den saugfähigen
Träger zusätzlich mit einer 1- bis 10%igen Lösung eines anorganischen Sulfats bzw. Gemischen
derselben in einem organischen Lösungsmittel imprägniert.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als - anorganisches Sulfat
Magnesium- und/oder Zinksulfat verwendet.
3. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel
Methanol oder Äthanol verwendet.
4. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktive
Mittel stickstoffhaltige, anionenaktive Netzmittel verwendet.
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