DE1255353C2 - Verfahren zur Herstellung eines Diagnostiziermittels zur Bestimmung von Eiweiss in biologischen Fluessigkeiten - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines Diagnostiziermittels zur Bestimmung von Eiweiss in biologischen Fluessigkeiten

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DE1255353C2 DE1964B0079314 DEB0079314A DE1255353C2 DE 1255353 C2 DE1255353 C2 DE 1255353C2 DE 1964B0079314 DE1964B0079314 DE 1964B0079314 DE B0079314 A DEB0079314 A DE B0079314A DE 1255353 C2 DE1255353 C2 DE 1255353C2
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Description

Der qualitative und quantitative Nachweis von Eiweiß in biologischen Flüssigkeiten, z. B. im Urin, hat eine große diagnostische Bedeutung, insbesondere bei Nierenerkrankungen, aber auch bei Kreisläufschwäche, Arteriosklerose, Hypertonie, Diabetes. Es ist eine Reihe von Methoden zum Nachweis von Eiweiß bekanntgeworden, z. B. die Sulfosalicylsäureprobe, Essigsäure-Kochprobe, Salpetersäure-Ringprobe, Pikrinsäureprobe; alle diese Methoden beruhen auf Fällungsreaktionen und sind ohne Laboratoriums- - geräte nicht durchführbar. Für schnelldiagnostische Zwecke kommen diese Reaktionen daher nicht in Betracht; hierfür benötigt man eine einfache Farbreaktion, welche auch durch ungeschultes Personal routinemäßig durchgeführt werden kann, z. B. mit Hilfe von Testpapieren.
Eine für den Eiweißnachweis geeignete Färbreaktion wurde erstmals von F e i g 1 et al. (Mikrochim. Acta, 2, 1937, S. 107) beschrieben. Diese Reaktion nutzt den bei verschiedenen Indikatoren bekannten »Protein-Fehler« aus:
Wird der pH-Wert des Reagenzes unterhalb des Indikatorumschlagbereiches gehalten, so tritt bei Zugabe von Eiweißlösung eine Farbänderung ein, die vom pH-Wert unabhängig ist und durch den Eiweißgehalt bedingt wird; die Farbintensität der entstehenden Farbe ist abhängig von der Konzentration des Eiweiß in der zu prüfenden Lösung. F e i g 1 arbeitete diesen Eiweißnachweis als Tüpfelreaktion aus, wobei er als Reagenzien das Kaliumsalz des Tetrabromphenolphthaleinäthylesters und Essigsäure verwendete. Zur Herstellung von Eiweißtestpapieren auf Basis der Feigl-Reaktion muß natürlich die Essigsäure durch eine nichtflüchtige Säure ersetzt werden; nach den Verfahren der britischen Patentschriften 814 223, 826 066 und 840 362 verwendet man hierfür zweckmäßig eine saure Puffersubstanz, wie z. B. Citratpuffer, sowie gewünschtenfalls oberflächenaktive Mittel! Die auf diese Weise erhaltenen Eiweißteststreifen befriedigen jedoch nicht völlig, da die Farbkontraste von negativer und positiver Eiweißprobe in Konzentrationsbereichen unterhalb von 0,1% Eiweiß sehr wenig differieren; der positive Test fällt mehr oder weniger stark gelbgrün aus, der negative Test ist grüngelb und ist dunkler gefärbt als der trockene Teststreifen. Auch läßt die Empfindlichkeit dieser Testpapiere einiges zu wünschen übrig (Nachweisgrenze etwa 0,03 bis 0,01 % Eiweiß). Es ist für den Mediziner aber erforderlich, Eiweiß im Harn in derselben Verdünnung nachweisen zu können, wie es mit der Essigsäure-Kochprobe möglich ist; demnach müssen noch 0,005°/0 Eiweiß im Harn einwandfrei diagnostiziert werden kön- * nen.
Bei dem Verfahren der obengenannten britischen Patentschriften wird der saugfähige Träger mit einer Lösung imprägniert, welche die Puffersubstanz zusammen mit dem Farbstoffindikator enthält. Aus der belgischen Patentschrift 642 648 ist bekannt, daß man wesentlich empfindlichere Eiweißtestpapiere erhält, wenn man die Puffersubstanz und den Farbstoffindikator getrennt, d. h. nacheinander auf den Träger aufbringt. Die hierbei erhaltenen Testpapiere sind schwach gelb gefärbt und geben mit eiweißhaltigem Urin kräftige Blaufärbungen, die entsprechend der Eiweißkonzentration abgestuft sind und sich deutlich von der gelben Färbung des negativen Testes abheben. Es können bis 0,005% Eiweiß-einwandfrei nachgewiesen werden. Bei längerer Lagerung jedoch werden diese Eiweißteststreifen allmählich graustichig und verlieren dadurch an Empfindlichkeit. Außerdem beobachtet man an den bekannten Eiweißtestpapieren auch bei eiweißfreiem Harn gelegentlich schwach positive Reaktionen, was auf unbekannte Harnbestandteile zurückzuführen ist; zuweilen wird diese Fehlanzeige durch überhöhte Mengen von Kreatinin im Harn hervorgerufen.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß man sehr empfindliche und stabil gelbgefärbte Eiweißtestpapiere herstellen kann, die auch nicht zu Fehlanzeigen bei Anwesenheit unbekannter Harnbestandteile neigen, wenn die Testpapiere zusätzlich mit Lösungen anorganischer Sulfate imprägniert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Diagnostiziermittels zur Bestimmung von Eiweißin biologischen Flüssigkeiten, bestehend aus einem Farbstoffindikator, welcher den sogenannten »Protein-Fehler« aufweist, einer sauren Puffersubstanz und gewünschtenfalls einem oberflächenaktiven Mittel sowie einem saugfähigen Träger ist demgemäß dadurch gekennzeichnet, daß man den saugfähigen Träger zusätzlich mit einer 1- bis 10%igen Lösung eines anorganischen Sulfates bzw. Gemischen derselben in einem organischen Lösungsmittel imprägniert. Bevorzugte anorganische Sulfate sind Magnesium- und/oder Zinksulfat. Bevorzugte Lösungsmitel sindstark polare, leichtflüchtige Lösungsmittel, wie Methanol oder Äthanol.
Als Farbstoffindikatoren kommen solche in Betracht, die einen großen Eiweißfehler bei einem Indikatorumschlag in sauren pH-Bereich haben, insbesondere Tetrabromphenolphthaleinäthylester und -butylester sowie Tetrabrombenzaurin. Als Puffer ist grundsätzlich jedes Puffersystem einsatzfähig, das auf einen pH-Wert unterhalb 7,0 eingestellt werden kann; vorzugsweise wird Citratpuffer, d. h. eine wäßrige Lösung von Citronensäure und tert.Natriumcitrat, verwendet.
Um die Saugfähigkeit der Testpapiere und damit deren Reaktionsgeschwindigkeit und Empfindlichkeit zu erhöhen, setzt man den Imprägnierlösungen zweckmäßig eines der üblichen oberflächenaktiven Mittel zu. Brauchbare oberflächenaktive Mittel sind z. B. Fettalkoholsulfonate, Alkylarylsulfonate, PoIycarbonsäureestersulfonate. Besonders bewährt haben sich bei den neuen Testpapieren stickstoffhaltige anionenaktive Netzmittel, wie Fettsäuretauride, Fettsäureglycide, Polycarbonsäure-alkylamidsulfonsäuren, Alkylsulfonglycide und N-substituierte Fettamidsulfonate.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Diagnostiziermittel erfolgt in an sich üblicher Weise: Der saugfähige Träger, z. B. Filterpapier, wird entweder nach den Vorschriften der obengenannten britischen Patentschriften mit einer Lösung imprägniert, welche die Puffersubstanz zusammen mit dem Farbstoffindikator enthält; nach der Trocknung wird das Eiweißtestpapier üblicher Zusammensetzung mit einer 1 bis 10°/0igen Sulfatlösung imprägniert und erneut getrocknet. Vorzugsweise wird jedoch nach der Vorschrift der belgischen Patentschrift 642 648 verfahren, d. h., man trägt zuerst die Puffersubstanz auf' und imprägniert dann erst mit der Indikatorfarbstofflösung, welche zusätzlich das Sulfat enthält. Die auf diese Weise erhaltenen Eiweißteststreifen können als solche verwendet oder aber nach dem Verfahren der belgischen Patentschrift 629 300 mit Kunststoff- ' folien eingesiegelt werden. Im letzteren Fall hat es sich als zweckmäßig erwiesen, wenn man das Testpapier mit einem zweiten, nicht imprägnierten Papierstreifen zusammen einsiegelt; hierdurch wird eine gleichmäßigere Färbung des Teststreifens bei Durchführung der Nachweisreaktion gewährleistet.
Bei dem Verfahren der belgischen Patentschrift 642 648 ist die Auswahl eines geeigneten Lösungsmittels für den Indikator von großer Bedeutung: wird hierfür Methanol oder Aceton verwendet, so erhält man ein Testpapier, das bei einer grünen Grundfarbe mit mehreren blauen Flecken durchsetzt ist; gleichmäßig gelbgefärbte Eiweißtestpapiere erhält man nur bei Anwendung von Halogenkohlenwasserstoffen als Lösungsmittel. Überraschenderweise lassen sich nun nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung durch den Zusatz von Sulfaten auch bei Benutzung von Methanol oder Äthanol als organischem Lösungsmittel für den Indikatorfarbstoff gleichmäßig kräftig gelbgefärbte Papiere herstellen.
Die erfindungsgemäß hergestellten, sehr empfindliehen und stabil kräftig gelbgefärbten Eiweißtestpapiere, die auch nicht zu gelegentlicher positiver Reaktion bei eiweißfreiem Harn neigen, gewähren eine erhöhte Sicherheit bei der Benutzung als diagnostisches Mittel und vereinfachen durch den deutlicheren Farbumschlag von Gelb nach Blau die praktische Anwendung dieses Diagnosticums.
In den nachstehenden Beispielen ist das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert.
60 Beispiel 1
Filterpapier (Schleicher & Schüll Nr. 2316) wird zunächst mit einer Imprägnierlösung folgender Zusammensetzung imprägniert und an der Luft getrocknet:
2molares tert.Natriumcitrat 11 ml
2molare Citronensäure 39 ml
Tetrabromphenolblau 0,04 g
Äthanol 50,0 ml
Anschließend wird das Papier mit einer 5%igen methanolischen Magnesiumsulfatlösung getränkt und erneut getrocknet.
Das getrocknete Papier ist gelblich gefärbt und zeigt Eiweiß im Harn bis zu einer Konzentration von 0,01 % einwandfrei an. Das Papier ändert seine Farbe aberzieht, wenn es mit eiweißfreiem normalem Urin, besonders auch mit stark kreatininhaltigem Urin, befeuchtet wird. Die nicht mit Magnesiumsulfat behandelten Papiere zeigen dagegen bei normalem, eiweißfreiem Urin je nach Art des Urins gelegentlich schwache Reaktionsfärbungen, ebenfalls bei kreatininhaltigem Urin, was einen geringen Eiweißgehalt im Urin vortäuschen kann.
Beispiel2
Filterpapier (Schleicher & Schüll Nr. 2316) wird zunächst mit einer Pufferlösung folgender Zusammensetzung getränkt und dann an der Luft getrocknet:
Tert.Natriumcitrat 9,80 g
Citronensäure 3,50 g
Natriumlaurylsülfat 0,05 g
Aqua destillata ad 100,0 ml
Anschließend wird das Papier mit einer Indikatorlösung folgender Zusammensetzung getränkt und erneut getrocknet:
Tetrabromphenolphthaleinäthylester 40 mg
Magnesiumsulfat 5 g
Methanol (oder Äthanol) ...... ad 100 ml
An Stelle der magnesiumsulfathaltigen Lösung kann auch eine zinksulfathaltige folgender Zusammensetzung verwendet werden:
Tetrabromphenolphthaleinäthylester 40 mg
Zinksulfat 5 g
Methanol ad 100 ml
Das getrocknete Papier wird aufgerollt, und die Rollen werden quer auf die gewünschte Breite von 5 mm geschnitten. Die auf diese Weise erhaltenen Teststreifen sind gelblich gefärbt und ändern ihre Farbe nicht, wenn sie mit eiweißfreiem Urin befeuchtet werden. Eiweiß im Harn zeigt sich durch Blaufärbungen, die je nach Eiweißgehalt abgestuft sind. So kann Eiweiß im Harn bei einer Konzentration von 0,005 °/0 noch nachgewiesen werden.
Beispiel 3
Filterpapier (Schleicher & Schüll Nr. 2316) wird zunächst mit einer Pufferlösung folgender Zusammensetzung getränkt und dann an der Luft getrocknet:
Tert.Natriumcitrat 9,80 g
Citronensäure 3,50 g
Natriumsalz eines Fettsäuremethyl-
glycids (»Medialan KA, konz.«) 0,05 g
Destilliertes Wasser ad 100,0 ml
Anschließend wird das Papier mit einer Indikatorlösung folgender Zusammensetzung getränkt und erneut getrocknet:
Tetrabromphenolphthaleinäthylester 40 mg
Magnesiumsulfat ................ 5 g
Methanol ....'■ ad 100 ml
Man erhält so ein gelbgefärbtes Testpapier, das seine Farbe bei eiweißfreiem Urin nicht ändert und
bei Eiweiß im Harn je nach Eiweißgehalt abgestufte Blaufärbungen anzeigt. Es läßt sich bis zu einem Gehalt von 0,001 % Eiweiß im ■ Harn noch eine Farbreaktion einwandfrei beobachten.
Die Stabilitätsprüfung der nach den Beispielen 1, 2 und 3 hergestellten Eiweißtestpapiere wurde durchgeführt, indem man die Testpapiere 12 Wochen bei 400C lagerte. Sie zeigten gegenüber Mustern, die bei Raumtemperatur gelagert wurden, keine Unterschiede im Aussehen und in der Reaktionsempfindlichkeit; die gelbe Farbe blieb unverändert. Demgegenüber verfärbten sich Eiweißtestpapiere, die ohne die Verwendung von Sulfaten hergestellt wurden, schon nach kurzer derartiger Lagerung von Gelb nach Grau.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostiziermittels zur Bestimmung von Eiweiß in biologischen Flüssigkeiten, bestehend aus einem Färbstoffindikator, welcher den sogenannten »Protein-Fehler« aufweist, einer sauren Puffersubstanz und gewünschtenfalls eirfem oberflächenaktiven Mittel sowie einem saugfähigen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß man den saugfähigen Träger zusätzlich mit einer 1- bis 10%igen Lösung eines anorganischen Sulfats bzw. Gemischen derselben in einem organischen Lösungsmittel imprägniert.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als - anorganisches Sulfat Magnesium- und/oder Zinksulfat verwendet.
3. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Methanol oder Äthanol verwendet.
4. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktive Mittel stickstoffhaltige, anionenaktive Netzmittel verwendet.
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