DE3015877C2

DE3015877C2 -

Info

Publication number: DE3015877C2
Application number: DE3015877A
Authority: DE
Inventors: Yasunao Ikeda Osaka Jp Ogawa; Kaoru Yao Osaka Jp Ishitobi
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1979-04-24
Filing date: 1980-04-24
Publication date: 1988-06-01
Also published as: AU5768780A; FR2455283B1; IT1129080B; US4303409A; DE3015877A1; GB2049928B; CA1139646A; GB2049928A; CH645723A5; AU532839B2; FR2455283A1; JPS55142249A; JPS6257946B2; SE8002970L; NL8002391A; IT8067648A0; DK173980A

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel und insbesondere einen Teststreifen zur kolorimetrischen Analyse (Nachweis und Bestimmung) von Ascorbinsäure gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Ascorbinsäure (Vitamin C) ist in relativ hohen Konzentrationen in Nahrungs- und Futtermitteln und Getränken, insbesondere in solchen, die damit angereichert sind, sowie in Spezialpräparaten, beispielsweise Vitamintabletten oder -pillen enthalten. Bei Aufnahme derartiger Nahrungs- oder Futtermittel oder anderer Präparate durch Menschen oder Tiere findet sich Ascorbinsäure in entsprechenden Konzentrationen im Körpergewebe, im Blut und in den Exkrementen.

Ist ein Nachweis oder eine Bestimmung anderer spezieller Substanzen in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Urin oder Blut, beabsichtigt, so können häufig sehr große Meßfehler bei den zu bestimmenden Substanzen entstehen, was auf die starke Reduktionsfähigkeit der gleichzeitig vorliegenden Ascorbinsäure, die den zu bestimmenden Wert stark beeinflußt, zurückzuführen ist.

Wenn beispielsweise die Menge an Glucose, Galactose, Cholesterin oder Harnsäure in Körperflüssigkeiten mit einem Nachweissystem, das ein Enzym mit einer für die spezielle Substanz spezifischen Oxidationsaktivität und Peroxidase zusammen mit einem Redox-Chromogen enthält, festgestellt werden soll oder wenn eine geringe Blutmenge im Urin mit einem Nachweissystem aus Peroxidase und Chromogen ermittelt werden soll, so kann eine negative Abweichung vom tatsächlichen Wert auf eine entsprechende Menge an gleichzeitig vorliegender Ascorbinsäure zurückzuführen sein.

Wenn andererseits die Menge an Glucose, Harnsäure oder dergleichen mit einem auf einem Reduktionsverfahren basierenden System ermittelt werden soll, kann eine positive Abweichung vom tatsächlichen Wert aufgrund der entsprechenden Menge an gleichzeitig vorliegender Ascorbinsäure auftreten.

Es ist bekannt, zur Messung von Ascorbinsäure in wäßrigen Lösungen eine kolorimetrische Titrationsanalyse unter Verwendung von Indophenol durchzuführen. Dieses Verfahren hat sich jedoch in der klinischen Chemie als wenig praktisch erwiesen.

Bei der klinischen Analyse ist es notwendig, gleichzeitig vorliegende Ascorbinsäure gleichzeitig mit der Messung der vorerwähnten speziellen Substanz oder vorzugsweise vorher nachzuweisen und zu bestimmen. Das Verfahren zur Messung der letztgenannten Substanz muß je nach dem Ergebnis der Bestimmung der gleichzeitig vorliegenden Ascorbinsäure so abgeändert werden, daß es durch die Anwesenheit von Ascorbinsäure nicht oder nur geringfügig beeinflußt wird.

Es ist wünschenswert, die Nachweis- und Bestimmungsverfahren beider Substanzen so durchzuführen, daß die genauen Werte in einem Arbeitsgang auf möglichst einfache Weise in kurzer Zeit erhalten werden, wobei die Ermittlung eines Werts für die spezielle Substanz selbst und deren Eichung in bezug auf den Ascorbinsäuregehalt gleichzeitig ermöglicht werden soll.

Ein entsprechendes, vereinfachtes Verfahren ist in der japanischen Patentveröffentlichung 712/78 beschrieben. Dieses Verfahren beruht auf dem Prinzip, daß Phosphormolybdat mit einer reduzierend wirkenden Substanz unter Bildung von Molybdänblau (Molybdänoxid) reagieren kann. Hierbei handelt es sich um ein bekanntes Verfahren zur quantitativen Bestimmung von geringen Mengen an anorganischem Phosphor. Aber auch dieses Verfahren ist nicht ganz zufriedenstellend, da es nur auf eine Ascorbinsäurekonzentration von 0 bis 40 mg/dl beschränkt ist und die Farbentwicklung wenig stabil ist.

Aus der US-PS 32 82 649 ist ein Mittel zur kolorimetrischen Analyse von Ascorbinsäure bekannt, das einen Komplex eines Chelatbildners mit einem mehrwertigen Metallion in dessen höherer Wertigkeitsstufe umfaßt.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mittel, insbesondere einen Teststreifen zur kolorimetrischen Analyse von Ascorbinsäure in wäßrigen Flüssigkeiten, z. B. Körperflüssigkeiten, zur Verfügung zu stellen, das in einfacher Weise innerhalb kurzer Zeit die Bestimmung von großen Konzentrationsbereichen mit ausreichender Genauigkeit erlaubt. Ferner soll erfindungsgemäß eine Möglichkeit geschaffen werden, den für eine bestimmte Substanz ermittelten Wert im Hinblick auf die Ascorbinsäurekonzentration zu korrigieren. Diese Aufgabe wird durch das Mittel gemäß Patentanspruch 1 gelöst.

Vorteilhafte Weiterbildungen des Mittels nach Anspruch 1 ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Vorzugsweise wird der Teststreifen zu einem kleinen Stück verarbeitet, das parallel mit einem Teststreifen oder einem anderen Nachweismittel zum Nachweis der speziellen Substanz in die zu bestimmende Flüssigkeit gehalten wird, so daß der Wert für die letztgenannte Substanz abgelesen und unter Berücksichtigung des Ergebnisses des Teststreifens zur Ascorbinsäureanalyse leicht korrigiert oder geeicht werden kann.

Beispiele für im erfindungsgemäßen Komplex enthaltene mehrwertige Metallionen sind Eisen-, Kupfer-, Kobalt- und Nickelionen. Eisen- und Kupferionen sind besonders bevorzugt. Beispiele für Metallsalze im oxidierten Zustand (höhere Wertigkeitsstufe) sind Eisen(III)-chlorid, Eisen(III)-ammoniumoxalat, Eisen(III)-citrat, Eisen(III)-ammoniumcitrat, Eisen(III)- ammoniumnitrat, Eisen(III)-bromid, Eisen(III)-ammoniumsulfat und Kupfer(II)-acetat.

Zur Komplexbildung mit den mehrwertigen Metallionen fähige Chelatbildner sind Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA), trans-1,2-Cyclohexandiamin-N,N,N′,N′-tetraessigsäure (CyHDTA), Diäthylentriamin-N,N,N′,N′′,N′′′-pentaessigsäure (DTPA), Triäthylentetramin-N,N,N′,N′′, N′′′,N′′′′-hexaessigsäure (TTHA) und Alkalimetallsalze dieser Verbindungen.

Als organische Metallindikatoren eignen sich o-Phenanthrolin, 4,7-Diphenyl-1,10-phenanthrolin, 2,2′-Bipyridin (α,α′-Dipyridyl), Cuproin, Neocuproin und 2,2′,2′′-Tripyridin.

Liegt die Absorptionsbande außerhalb des sichtbaren Bereichs, so kann eine UV- oder IR-Messung durchgeführt werden.

Beispiele für saugfähige Körper, die in dem einen einfachen Nachweis gestattenden Teststreifen zur Anwendung kommen können, sind Filterpapier, Gewebe, Faservliese, Filz und gesinterte, poröse Körper aus Glas- oder Keramikpulver, die gegebenenfalls in der Dünnschichtchromatographie übliche Sorptionsmittelteilchen enthalten können.

Die Metallsalze liegen im erfindungsgemäßen Mittel im oxidierten Zustand vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01 bis 0,1 Mol vor. Besonders bevorzugt ist ein Konzentrationsbereich von 0,05 bis 0,08 Mol.

Der Chelatbildner ist im erfindungsgemäßen Mittel im allgemeinen in einer größeren molaren Menge als das Metallion vorhanden. Wenn kein Chelatbildner vorhanden ist, wird die gewünschte Reaktionsspezifität auf Ascorbinsäure stark verringert, wodurch sich eine gleichzeitige Stabilitätsabnahme gegen Strahlungseinflüsse ergibt.

Als Puffer können Salze von organischen Säuren mit anorganischen starken Basen in Konzentrationen, die die gewünschte Pufferwirkung gewährleisten, verwendet werden. Die Reaktion, auf der die Erfindung beruht, kann bei pH-Werten (pH-Wert des Mittels oder des Teststreifens in feuchtem Zustand) von 3 bis 6,5 durchgeführt werden. Vorzugsweise werden aber Puffer verwendet, die eine Einstellung des pH-Werts auf den Bereich von 4 bis 6 bewirken, um nachteilige Einflüsse von anderen reduzierenden Verbindungen, beispielsweise Harnsäure, Cystein, Sulfite, Salicylat, Glutathion, Creatin und Creatinin, vollständig auszuschalten.

Als Farbstoff zur Einstellung der Hintergrundfärbung in den Teststreifen können Lebensmittelfarben, wie FD & C Gelb Nr. 4 oder FD & C Blau Nr. 1, oder Kupfersalze je nach der gewünschten Klarheit und Empfindlichkeit des Nachweises verwendet werden.

Als Dispergiermittel werden vorzugsweise übliche Mittel, wie Polyvinylpyrrolidon (PVP), Hydroxypropylcellulose (HPC) und Polyäthylenglykol (PEG) verwendet, insbesondere wenn das Mittel sich auf einem Teststreifen in getrocknetem Zustand befindet. Das Dispergiermittel kann auch als Stabilisator für andere Bestandteile und zur Aufrechterhaltung der Homogenität der entwickelten Färbung dienen. Wegen seiner günstigen Eigenschaften wird PVP besonders bevorzugt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Filterpapier (Toyo Nr. 53) wird mit der nachstehend angegebenen ersten Lösung imprägniert und 90 Minuten bei 45°C unter vermindertem Druck getrocknet. Nach weiterer Imprägnierung mit der nachstehend angegebenen zweiten Lösung wird 30 Minuten bei 45°C unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält eine Vorratsrolle für Teststreifen.

1. Lösung:
CyHTA 2 g Eisen(III)-chlorid 1,2 g Natriumcitrat 5,5 g Citronensäure 1,3 g destilliertes Wasser57 ml FD & C Blau Nr. 1 (0,25 Gew.-/Vol.-%) 2,5 ml

2. Lösung:
2,2′-Bipyridin 0,4 g PVP oder HPC 0,5 g Äthanol10 ml Cyclohexanon30 ml

Nach dem Imprägnieren und Trocknen wird die Papierrolle bei niedriger Temperatur im Dunklen gelagert. Ein kleines Papierstück wird an der Spitze eines Kunststoffstreifens befestigt, wodurch man ein Teststäbchen erhält.

Die Funktionstüchtigkeit dieses Stäbchens wird geprüft, indem man es in Urinproben von offensichtlich gesunden Probanden, die frei von Ascorbinsäure sind, taucht. Diese Proben werden in den nachstehend angegebenen Konzentrationen mit Ascorbinsäure versetzt. Die Farbentwicklung auf dem kleinen Teststück wird nach 60 Sekunden beobachtet. Man erhält folgende Ergebnisse:

Ascorbinsäurekonzentration (mg/dl)Farbe (H-V/C) 0 5 BG-7/6 5 7,5 BG-7/3 1010 BG-6/2 20 7,5 R-5/2 40 5 R-5/4 80 2,5 R-4/4

Die Farbe wird angegeben als Farbton-Wert (H-V/C) im Vergleich zu Eichfarben gemäß JIS Z-8721 1964, Nihon Kikaku Kyokai (japanisches Eich- und Norminstitut).

Beispiel 2

Gemäß Beispiel 1 werden mit der Abänderung, daß die erste Lösung die nachstehend angegebene Zusammensetzung aufweist, Teststreifen hergestellt.

1. Lösung:
TTHA 2 g Eisen(III)-chlorid 1,1 g Natriumcitrat 4 g Citronensäure 0,2 g destilliertes Wasser42 ml FD & C Blau Nr. 1 (0,25 Gew.-/Vol.-%) 1,8 ml

Nach einer Eintauchzeit dieser Teststreifen von 30 Sekunden werden ähnliche Farbentwicklungen wie in Beispiel 1 beobachtet.

Beispiele 3, 4 und 5

Zur Herstellung von Papierstücken für Teststäbchen werden die nachstehend angegebenen ersten Lösungen verwendet.

1. Lösung

Nach einer Eintauchzeit von 15 Sekunden werden mit diesem Teststreifen ähnliche Ergebnisse wie in Beispiel 1 beobachtet.

Beispiele 6, 7 und 8

Gemäß Beispiel 1 werden unter Verwendung der nachstehend angegebenen Lösungen Teststäbchen hergestellt:

1. Lösung

2. Lösung (für die Beispiele 6, 7 und 8 gleich):
2,2′-Bipyridin oder o-Phenanthrolin 0,2 g (beide Verbindungen geben im wesentlichen die gleiche Farbentwicklung)
PVP oder HPC 0,25 g Äthanol20 ml

Die Farbentwicklung wird nach einer Eintauchzeit von 15 Sekunden unter ähnlichen Bedingungen wie in Beispiel 1 beobachtet.

VC-Konzentration (mg/dl)Farbton (H-V/C) 0 5 Y-9/6 510 YR-8/8 10 5 YR-7/8 20 2,5 YR-7/10 4010 R-6/12

Beispiel 9

Gemäß Beispiel 1 werden unter Verwendung der nachstehend angegebenen ersten Lösung Teststäbchen hergestellt. Ferner sind nachstehend die Farbentwicklungen dieser Teststäbchen nach einer Eintauchzeit von 10 Sekunden angegeben.

1. Lösung:
EDTA-2Na 3 g Eisen(III)-ammoniumsulfat 7,1 g Natriumcitrat 6 g destilliertes Wasser95 ml FD & C Blau Nr. 1 (0,25 Gew.-/Vol.-%) 5 ml

Farbentwicklung:
Ascorbinsäurekonzentration (mg/dl)Farbton (H-V/C) 0 5 BG-7/6 5 7,5 BG-7/3 1010 BG-6/2 20 7,5 BG-6/2 40 5 BG-5/4 80 2,5 BG-4/4

Beispiel 10

Gemäß den Beispielen 6, 7 und 8 werden unter Verwendung der nachstehend angegebenen ersten Lösung Teststäbchen hergestellt.

1. Lösung:
EDTA-2Na 4 g Eisen(III)-chlorid 2 g Natriumcitrat 6,3 g Citronensäure 3 g Kupfer(II)-acetat (Anhydrid) 0,5 g destilliertes Wasser95 ml

Die mit diesen Teststreifen nach einer Eintauchzeit von 15 Sekunden erhaltenen Farbentwicklungen sind nachstehend angegeben:

Ascorbinsäurekonzentration (mg/dl)Farbton (H-V/C) 010 GY-8/3 0,510 Y-7/3 110 YR-7/3 210 YR-7/2 5 5 YR-7/3 1010 R-6/4 20 7,5 R-6/6

Beispiel 11

Gemäß Beispiel 1 werden unter Verwendung der nachstehend angegebenen Lösungen Teststäbchen hergestellt. Die beobachteten Farbentwicklungen sind ebenfalls nachstehend angegeben.

1. Lösung:
Kupfer(II)-acetat (wasserfrei) 0,2 g EDTA-2Na 0,5 g destilliertes Wasser20 ml

2. Lösung:
4,7-Diphenyl-1,10-phenanthrolin 0,2 g PVP oder HPC 0,4 g Äthanol20 ml

Farbentwicklung 1 (nach einer Eintauchzeit von 15 Sekunden in Urin):

Ascorbinsäurekonzentration (mg/dl)Farbton (H-V/C) 0 5 BG-8/3 510 BY-7/3 10 5 GY-7/3 20 2,5 GY-7/3 40 7,5 GY-4/4

Farbentwicklung 2 (nach einer Eintauchzeit von 30 Sekunden in Serum, wobei die Serumproben mit Hyland, Q-PAK-Chemie-Kontrollserum I unter Variation der Ascorbinsäurekonzentration hergestellt werden):

Ascorbinsäurekonzentration (mg/dl)Farbton (H-V/C) 07,5 GY-8/3 15 GY-7/4 45 YZ-7/3 107,5 R-6/6

Beispiel 12

Gemäß Beispiel 1 werden unter Verwendung der nachstehend angegebenen Lösungen Teststäbchen hergestellt. Die entwickelten Färbungen nach einer Eintauchzeit von 15 Sekunden in Urinproben entsprechen im wesentlichen denen von Beispiel 1.

1. Lösung:
EDTA-2Na 3 g Eisen(III)-chlorid 2 g Natriumcitrat 5,6 g Citronensäure 3 g destilliertes Wasser94 ml FD & C Blau Nr. 1 (0,25 Gew.-/Vol.-%) 5 ml

2. Lösung:
2,2′-Bipyridin 0,4 g PVP 0,5 g Cyclohexanon27,5 ml Äthanol12,5 ml

Beispiel 13

Gemäß Beispiel 12 werden unter Verwendung der nachstehend angegebenen ersten Lösung, die insbesondere für die Bestimmung von Serumproben geeignet ist, Teststreifen hergestellt. Der Farbstoffmenge zur Einstellung der Hintergrundfärbung und den flüssigen Eigenschaften wird besondere Beachtung geschenkt. Ferner sind die beobachteten Farbentwicklungen nachstehend angegeben.

1. Lösung:
EDTA-2Na 3 g Eisen(III)-chlorid 2 g Natriumcitrat10 g destilliertes Wasser94 ml FD & C Blau Nr. 1 (0,25 Gew.-/Vol.-%) 0,3 ml

Farbentwicklung (nach einer Eintauchzeit von 30 Sekunden in Serum):

Ascorbinsäurekonzentration (mg/dl)Farbton (H-V/C) 0 5 Y-8/4 0,510 YR-8/3 1 7,5 YR-8/3 2 5 YR-8/4 510 R-7/6 10 7,5 R-6/8

Bei Untersuchungen zur Ermittlung möglicher Beeinträchtigungen durch gleichzeitiges Vorhandensein anderer Arzneistoffe wurde festgestellt, daß bei Natriumfluorid, Kaliumoxalat, Glutathion (reduzierte Form), Creatin, Creatinin oder Brenztraubensäure bis zu Konzentrationen von 100 mg/dl und bei Harnsäure oder Vitamin E bis zu Konzentrationen von 5 mg/dl solche Störwirkungen nicht auftreten.

Ferner ergibt Cystein in einer Konzentration von 25 mg/dl eine Farbentwicklung, die der Farbentwicklung von Ascorbinsäure in einer Konzentration von 0,5 mg/dl entspricht.

Vergleichsbeispiel

Gemäß Beispiel 1 werden unter Verwendung der nachstehend angegebenen ersten Lösung, die keinen Chelatbildner enthält, Teststreifen hergestellt und geprüft.

1. Lösung:
Eisen(III)-chlorid 1 g Citronensäure 1 g Natriumcitrat 3 g destilliertes Wasser45 ml FD & C Blau Nr. 1 (0,25 Gew.-/Vol.-%) 2,5 ml

Farbentwicklung (nach einer Eintauchzeit von 15 Minuten in Urin):

Ascorbinsäurekonzentration (mg/dl)Farbton (H-V/C) 0 5 G-6/4 5 7,5 GY-4/2 10 5 Y-5/1 2010 R-4/2 40 7,5 R-3/4

Die erhaltenen Teststäbchen verblassen beim Altern und eignen sich nicht einmal zu einer kurzzeitigen Lagerung. Bei Anwesenheit von Salicylaten wird eine Farbentwicklung beobachtet.

Beispiel 14 Quantitative Bestimmung mit einem gelösten System

Die erste Lösung wird hergestellt, indem man 0,2 g Eisen(III)- chlorid und 0,3 g EDTA-2Na in 0,3 m Citratpuffer vom pH-Wert 5,5 löst (Gesamtvolumen 100 ml). Die zweite Lösung wird hergestellt, indem man 0,5 g 2,2′-Bipyridin in Wasser (Gesamtvolumen 100 ml) löst. Beide Lösungen werden im Dunkeln aufbewahrt.

Bei der Bestimmung der Ascorbinsäurekonzentration werden 5 ml der ersten Lösung mit 2 ml der zweiten Lösung vereinigt und zu einer Urinprobe (0,1 ml oder 1,0 ml von 1 : 10-verdünntem Urin) und 0,3 m Citratpuffer (pH-Wert 5,5 gegeben (Endvolumen 10 ml). Das Reaktionsgemisch wird vor der Messung bei 520 nm 2 Minuten oder länger im Dunklen aufbewahrt. Die mit Eichproben erhaltene Kurve erweist sich als vollständig linear:

Y = 0,097 X - 0,0014

wobei X die Ascorbinsäurekonzentration in mg/dl und Y die optische Dichte bei 520 nm bedeutet. Die lineare Beziehung gilt bis zu einer Ascorbinsäurekonzentration von 110 mg/dl.

Der Variationskoeffizient (cv) für die Reproduzierbarkeit bei quantitativen Bestimmungen liegt unter 1 Prozent.

Nachteilige Einflüsse, die durch andere, in der Probe vorhandene Substanzen verursacht werden, sind in der nachstehenden Tabelle als Ausbeute angegeben (d. h. die Spezifität dieser Lösung für Ascorbinsäure).

Tabelle

Claims

1. Mittel zur kolorimetrischen Analyse von Ascorbinsäure, umfassend einen Komplex eines Chelatbildners mit einem mehrwertigen Metallion in dessen höherer Wertigkeitsstufe, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Komplex eines Chelatbildners aus der Gruppe Äthylendiamintetraessigsäure, trans-1,2- Cyclohexandiamin-N,N,N′,N′-tetraessigsäure, Diäthylentriamin- N,N,N′,N′′,N′′′-pentaessigsäure, Triäthylentetramin- N,N,N′, N′′′,N′′′′-hexaessigsäure oder Alkalimetallsalze dieser Verbindungen mit einem mehrwertigen Metallion in seiner höheren Wertigkeitsstufe, einen mit dem Metallion in dessen niedrigerer Wertigkeitsstufe reaktionsfähigen Indikator aus der Gruppe o-Phenanthrolin, 4,7-Diphenyl-1,10-phenanthrolin, 2,2′-Bipyridin, Cuproin, Neocuproin und 2,2′,2′′-Terpyridin sowie einen Puffer zum Einstellen des pH-Werts des Mittels im Bereich von 3 bis 6,5 enthält.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das mehrwertige Metallion aus der Gruppe Eisen-, Kupfer-, Kobalt- und Nickelionen ausgewählt ist.

3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer den pH-Wert des Mittels auf einen Wert von 4 bis 6 einstellt.

4. Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel ein Teststreifen ist, der zusätzlich einen Farbstoff zur Einstellung einer Hintergrundfarbe sowie ein Dispergiermittel umfaßt, mit der Maßgabe, daß der Puffer den pH-Wert auf die angegebenen Werte in feuchtem Zustand des Teststreifens einstellt.

5. Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Teststreifen aus Papier, Filterpapier, Kieselgelpapier, DEAE-Cellulosepapier, Gewebe, Filz oder einem gesinterten, porösem Körper aus Glas oder Keramikpulver besteht.

6. Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Dispergiermittel ausgewählt ist aus der Gruppe Polyvinylpyrrolidon, Hydroxypropylcellulose und Polyäthylenglykol.