JPS59187266A - 体液成分測定におけるアスコルビン酸の消去方法 - Google Patents
体液成分測定におけるアスコルビン酸の消去方法Info
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- JPS59187266A JPS59187266A JP6096983A JP6096983A JPS59187266A JP S59187266 A JPS59187266 A JP S59187266A JP 6096983 A JP6096983 A JP 6096983A JP 6096983 A JP6096983 A JP 6096983A JP S59187266 A JPS59187266 A JP S59187266A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、体液中に存在する各種成分を定量する際の・
アスコルビン酸の影響を除去する方法に関する。
アスコルビン酸の影響を除去する方法に関する。
体液中の各種成分を定量することによって各種疾病を診
断することは現在広く行なわれているが、この測定法と
して近年特に酵素反応を介する比色定量法が多く採用さ
れている。例えば、ｌ）酸化酵素反応系を介して過酸化
水素を生成させ、これをペルオキシダーゼの共存下被酸
化性色原体に作用させて生成する色素化合物を比色定量
する方法、２）脱水素酵素反応系を介してＮＡＤＨまた
はＮＭ）ＰＨを生成させ、これを電子伝達系存在下にテ
トラゾリウム塩に作用させ、還元して生ずるホルマザン
を比色定量する方法などがある。
断することは現在広く行なわれているが、この測定法と
して近年特に酵素反応を介する比色定量法が多く採用さ
れている。例えば、ｌ）酸化酵素反応系を介して過酸化
水素を生成させ、これをペルオキシダーゼの共存下被酸
化性色原体に作用させて生成する色素化合物を比色定量
する方法、２）脱水素酵素反応系を介してＮＡＤＨまた
はＮＭ）ＰＨを生成させ、これを電子伝達系存在下にテ
トラゾリウム塩に作用させ、還元して生ずるホルマザン
を比色定量する方法などがある。
ところが体液中にはアスコルビン酸が存在しているため
、アスコルビン酸の強い還元性により上記比色定量法に
おける酸化、還元系が影響を受け、測定に誤差を生じさ
せるとい５難点がある。アスコルビン酸は正常人血清中
にもｘ、２ｍ９／ｄｅ程度存在するが、疾病の治療に大
量のアスコルビン酸が用いられることにより血清中濃度
が著るしく増加しており、測定に与える影響は極めて大
きい。上記ｌ）の定量法においては、被酸化性色原体が
縮合して生成した色素を還元して測定値に負の誤差を与
え、２）の定量法においてはテトラゾリウム塩を還元し
てホルマザンを生成させ、測定値に正の誤差を与える。
、アスコルビン酸の強い還元性により上記比色定量法に
おける酸化、還元系が影響を受け、測定に誤差を生じさ
せるとい５難点がある。アスコルビン酸は正常人血清中
にもｘ、２ｍ９／ｄｅ程度存在するが、疾病の治療に大
量のアスコルビン酸が用いられることにより血清中濃度
が著るしく増加しており、測定に与える影響は極めて大
きい。上記ｌ）の定量法においては、被酸化性色原体が
縮合して生成した色素を還元して測定値に負の誤差を与
え、２）の定量法においてはテトラゾリウム塩を還元し
てホルマザンを生成させ、測定値に正の誤差を与える。
このようにして、アスコルビン酸の影響は血清中に存在
するグルタチオンやビリルビンの場合よりもはるかに大
きく、上記反応系を利用する尿酸、トランスアミラーゼ
、中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、クレアチニンおよ
び遊離脂肪酸等の測定の場合にその影響を除くことが強
く要望される。
するグルタチオンやビリルビンの場合よりもはるかに大
きく、上記反応系を利用する尿酸、トランスアミラーゼ
、中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、クレアチニンおよ
び遊離脂肪酸等の測定の場合にその影響を除くことが強
く要望される。
従来はこの点に関して、酸化酵素の一種であるアスコル
ビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯＤ） ヲ用いル方法が一
般に行なわれていたが、人ＳＯＤを用いる方法はアスコ
ルビン酸の影響を軽減することはできても完全に除くこ
とは困難であり、またＡＳＯＤは酵素であるので非常に
高価な上、安定性も悪く、かつ混在する物質の影響を強
く受けるという欠点がある。
ビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯＤ） ヲ用いル方法が一
般に行なわれていたが、人ＳＯＤを用いる方法はアスコ
ルビン酸の影響を軽減することはできても完全に除くこ
とは困難であり、またＡＳＯＤは酵素であるので非常に
高価な上、安定性も悪く、かつ混在する物質の影響を強
く受けるという欠点がある。
本発明者らは、ＡＳＯＪこ代り、アスコルビン酸の影響
除去の効果が犬で、かつ安定な化学物質を用いる測定法
について種々検討を重ねていたが、下記の一般式（〜ま
たは（Ｂ） （式中Ｒ，〜、はそれぞれＨ，アルキル基、カルボキシ
アルキル基またはヒドロキシアルキル基であり、Ｘはエ
チレン基；１個または２個のアルキル、カルボキシアル
キルまたはヒドロキシアルキルが置換したエチレン基：
４Ｌ＜はトランスシクロヘキセン基でアル。）で表わさ
れる化合物の鉄錯体、またはグルコン酸の鉄錯体に著る
しい上記効果のあることを見出し、本発明を完成した。
除去の効果が犬で、かつ安定な化学物質を用いる測定法
について種々検討を重ねていたが、下記の一般式（〜ま
たは（Ｂ） （式中Ｒ，〜、はそれぞれＨ，アルキル基、カルボキシ
アルキル基またはヒドロキシアルキル基であり、Ｘはエ
チレン基；１個または２個のアルキル、カルボキシアル
キルまたはヒドロキシアルキルが置換したエチレン基：
４Ｌ＜はトランスシクロヘキセン基でアル。）で表わさ
れる化合物の鉄錯体、またはグルコン酸の鉄錯体に著る
しい上記効果のあることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、上記鉄錯体の１種または２種以上を
添加することを特徴とする体液成分測定におけるアスコ
ルビン酸の影響を除去する方法に関する。
添加することを特徴とする体液成分測定におけるアスコ
ルビン酸の影響を除去する方法に関する。
上記（５）で表わされる化合物としては、ニトリロ玉酢
酸（ＮＴＡ） 、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥ
Ｇ） 、イミノニ酢酸（ＩＤＡ）、ヒドロキシエチルイ
ミノニ酢酸（ＨＩＤＡ） 、）リス（ヒドロキシメチル
）メチルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）およびニトリロ二
酢酸プロピオン酸（ＮＤＡＰ ）等があり、また（Ｂ）
で表わされる化合物としては、トランスシクロヘキサン
ジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ） 、エチレンジアミン匹
酢酸（ＥＤＴＡ） 、エチレンジアミンニ酢酸（ＥＤＤ
Ａ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＥＤ
ＴＡ−ＯＨ）、およびジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔ
ｈｙｌ−ＢＤＴＡ）等がある。鉄は２価でも３価でもよ
く、好ましくは３価のものを用いる。
酸（ＮＴＡ） 、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥ
Ｇ） 、イミノニ酢酸（ＩＤＡ）、ヒドロキシエチルイ
ミノニ酢酸（ＨＩＤＡ） 、）リス（ヒドロキシメチル
）メチルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）およびニトリロ二
酢酸プロピオン酸（ＮＤＡＰ ）等があり、また（Ｂ）
で表わされる化合物としては、トランスシクロヘキサン
ジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ） 、エチレンジアミン匹
酢酸（ＥＤＴＡ） 、エチレンジアミンニ酢酸（ＥＤＤ
Ａ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＥＤ
ＴＡ−ＯＨ）、およびジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔ
ｈｙｌ−ＢＤＴＡ）等がある。鉄は２価でも３価でもよ
く、好ましくは３価のものを用いる。
また本発明方法が適用される定量分析の被酸化性色原体
系としては、例えば４−アミノアンチピリンとナフトー
ル誘導体、４−アミノアンチピリンとアニリン誘導体お
よび４−アミノアンチピリンとナフトール誘導体等多く
の過酸化水素発色系があり、電子伝達系としては、ジア
ホラーゼ、フェナジンメトサルフェート（ＦＭＳ ）お
よびその誘導体等が挙げられる。勿論これらのほかにも
、アスコルビン酸が干渉するようないかなる測定にも本
発明方法は適用できる。
系としては、例えば４−アミノアンチピリンとナフトー
ル誘導体、４−アミノアンチピリンとアニリン誘導体お
よび４−アミノアンチピリンとナフトール誘導体等多く
の過酸化水素発色系があり、電子伝達系としては、ジア
ホラーゼ、フェナジンメトサルフェート（ＦＭＳ ）お
よびその誘導体等が挙げられる。勿論これらのほかにも
、アスコルビン酸が干渉するようないかなる測定にも本
発明方法は適用できる。
本発明の方法は、体液成分測定の際にその反応系に上記
鉄錯体が存在することによって効果を奏するので、何ら
かの方法で上記鉄錯体を反応系に添加すればよい。
鉄錯体が存在することによって効果を奏するので、何ら
かの方法で上記鉄錯体を反応系に添加すればよい。
次に試験例および実施例により本発明を説明する。
試験例１
過酸化水素系における鉄錯体のアスコルビン酸の影響除
去の効果を調べるために、代表例としてＮＴＡ、 ＤＨ
ＥＧ、 ＩＤＡ、 ＨＩＤＡ、 Ｔｒｉｃｉｎｅ、 Ｎ
ＤＡＰ、 ＣｙＤＴＡ。
去の効果を調べるために、代表例としてＮＴＡ、 ＤＨ
ＥＧ、 ＩＤＡ、 ＨＩＤＡ、 Ｔｒｉｃｉｎｅ、 Ｎ
ＤＡＰ、 ＣｙＤＴＡ。
ＥＤＴＡ、 ＥＤＤＡ、 ＥＤＴＡ−ＯＨ，ＭｅＥＤＴ
Ａおよびグ／ｌ／ コン酸それぞれの２価および３価の
鉄錯体を用い、以下の試験を行なった。
Ａおよびグ／ｌ／ コン酸それぞれの２価および３価の
鉄錯体を用い、以下の試験を行なった。
１． 使用した試薬
（１）反応試薬（第１表参照、イ〜りの２７種類）イ〜
りの構成々分 ■）緩衝液（Ｂｏｒａｘ Ｂｕｆｆｅｒ）、、、、−、
−＊つ砂５ Ｑ ｍ ｍｏ ｌ／ｌ （ｐＨ７，０）２
） ＮＴＡ溶液 、−−−−−−−−ＮＴＡ Ｑ、５ｍｍｏ／／ｌ！３）
ＮＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）溶液 ４） ＮＴＡ−Ｆ’ｅ（’［）溶液 ５） ＤＨＢＧ−Ｆｅ（ＩＩ）溶液 ６） ＤＨｇＧ−Ｆｅ （１１）溶液７） Ｉ、Ｄ
Ａ−Ｆｅ（ＩＩ）溶液 Ｂ） ＩＤＡ−Ｆｅ（ｕＩ）溶液 ９） ＨＩＤＡ−Ｆｅ（Ｉ［）溶液 １０） ＨｘｎＡ−Ｆｅ（１１［）溶液ｋｌ） Ｔ
ｒｉｃｉｎｅ−Ｆｅ（ＩＩ）溶液１２） Ｔｒｉｃｉ
ｎｅ−Ｆｅ（ｉ［）溶液１３） ＮＤＡＰ−Ｆｅ（Ｉ
Ｉ）溶液ｔ４） ＮＤＡＰ−Ｆｅ（ＴＩ）溶液１５）
ＣｙＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）溶液１６） ＣｙＤＴ
Ａ−Ｆｅ（１［）溶液１７） ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ
）溶液ｔｓ） ＲＤＴＡ−Ｆｅ（１［）溶液１ ｇ
） ＢＤＤＡ−Ｆｅ （ＩＩ ）溶液２０） ＢＤ
ＤＡ−Ｆｅ（団）溶液 ２１） ＥＤＴＡ−ＯＨ−Ｆｅ（Ｉ［）溶液２２）
ＥＤＴＡ−ＯＨ−Ｆｅ（ＩＮ）溶液２３） ＭｅＥ
ＤＴＡ−ｒｅ （ＩＩ）溶液２４） ＭｅＥＤＴＡ−
Ｆｅ（Ｉ）溶液２５） グルコン酸塩−Ｆｅ（ｌ［）
溶液２６）硫酸第一鉄アンモニウム溶液 硫酸第一鉄アンモニウムＱ、５ｍｍｏｌ／ｅ〔”ｅ （
ｓｏ４）ｚ （ＮＨ４）２ ）２７）硫酸第二鉄アンモ
ニウム溶液 硫酸第二鉄アンモニウム０．５ ｍ ｍｏ ｌ／１［Ｆ
ｅ２（８０４）４ （ＮＨ４）２ ）上記各溶液の残部
は水 （２）発色液（ｐＨ７，０） ホウ砂 ５０ｍ ｍｏｌ／ＩＴＯＯ８”
３ｍ ｍｏｅ／ｌ！４−
アミノアンチビリｙ １．５ｍ ｍｏｅ／１
ペルオキシダーゼ ５０００単位／／残
部水 蒼ＴＯＯ３：Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−ｍ−）ルイシン （３） アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 ２０ｍＶｄｅ残部水 （４）過酸化水素溶液 過酸化水素 １．５ｍ ｍｏｌ！／ｌ！残
部水 ２、操作および結果 第１表の反応試薬イ〜りの各２ｍｌ！に（３）アスコル
ビン酸溶液２０μＩ！ または精製水２０μｌを加え、
３７’Ｃ，で５分間加温した後、（２）発色液ＬｍＡ’
を加え、直ちに（４）過酸化水素溶液２０μｌ！または
精製水２０μｅを添加して更に３７℃５分間加温し、波
長５５５ｎｍにおける吸光度を測定した。
りの構成々分 ■）緩衝液（Ｂｏｒａｘ Ｂｕｆｆｅｒ）、、、、−、
−＊つ砂５ Ｑ ｍ ｍｏ ｌ／ｌ （ｐＨ７，０）２
） ＮＴＡ溶液 、−−−−−−−−ＮＴＡ Ｑ、５ｍｍｏ／／ｌ！３）
ＮＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）溶液 ４） ＮＴＡ−Ｆ’ｅ（’［）溶液 ５） ＤＨＢＧ−Ｆｅ（ＩＩ）溶液 ６） ＤＨｇＧ−Ｆｅ （１１）溶液７） Ｉ、Ｄ
Ａ−Ｆｅ（ＩＩ）溶液 Ｂ） ＩＤＡ−Ｆｅ（ｕＩ）溶液 ９） ＨＩＤＡ−Ｆｅ（Ｉ［）溶液 １０） ＨｘｎＡ−Ｆｅ（１１［）溶液ｋｌ） Ｔ
ｒｉｃｉｎｅ−Ｆｅ（ＩＩ）溶液１２） Ｔｒｉｃｉ
ｎｅ−Ｆｅ（ｉ［）溶液１３） ＮＤＡＰ−Ｆｅ（Ｉ
Ｉ）溶液ｔ４） ＮＤＡＰ−Ｆｅ（ＴＩ）溶液１５）
ＣｙＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）溶液１６） ＣｙＤＴ
Ａ−Ｆｅ（１［）溶液１７） ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ
）溶液ｔｓ） ＲＤＴＡ−Ｆｅ（１［）溶液１ ｇ
） ＢＤＤＡ−Ｆｅ （ＩＩ ）溶液２０） ＢＤ
ＤＡ−Ｆｅ（団）溶液 ２１） ＥＤＴＡ−ＯＨ−Ｆｅ（Ｉ［）溶液２２）
ＥＤＴＡ−ＯＨ−Ｆｅ（ＩＮ）溶液２３） ＭｅＥ
ＤＴＡ−ｒｅ （ＩＩ）溶液２４） ＭｅＥＤＴＡ−
Ｆｅ（Ｉ）溶液２５） グルコン酸塩−Ｆｅ（ｌ［）
溶液２６）硫酸第一鉄アンモニウム溶液 硫酸第一鉄アンモニウムＱ、５ｍｍｏｌ／ｅ〔”ｅ （
ｓｏ４）ｚ （ＮＨ４）２ ）２７）硫酸第二鉄アンモ
ニウム溶液 硫酸第二鉄アンモニウム０．５ ｍ ｍｏ ｌ／１［Ｆ
ｅ２（８０４）４ （ＮＨ４）２ ）上記各溶液の残部
は水 （２）発色液（ｐＨ７，０） ホウ砂 ５０ｍ ｍｏｌ／ＩＴＯＯ８”
３ｍ ｍｏｅ／ｌ！４−
アミノアンチビリｙ １．５ｍ ｍｏｅ／１
ペルオキシダーゼ ５０００単位／／残
部水 蒼ＴＯＯ３：Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−ｍ−）ルイシン （３） アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 ２０ｍＶｄｅ残部水 （４）過酸化水素溶液 過酸化水素 １．５ｍ ｍｏｌ！／ｌ！残
部水 ２、操作および結果 第１表の反応試薬イ〜りの各２ｍｌ！に（３）アスコル
ビン酸溶液２０μＩ！ または精製水２０μｌを加え、
３７’Ｃ，で５分間加温した後、（２）発色液ＬｍＡ’
を加え、直ちに（４）過酸化水素溶液２０μｌ！または
精製水２０μｅを添加して更に３７℃５分間加温し、波
長５５５ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果、以下の第２表に示す如く、本発明による鉄錯
体を添加したハ〜ノの反応試薬ではアスコルビン酸の影
響を完全に除去することができるが、硫酸第一鉄アンモ
ニウムのみでは呈色反応が阻筈され、また硫酸第二鉄ア
ンモニウムおよびＮＴＡのみの添加ではアスコルビン酸
の影響を除去する効果がなかった。
体を添加したハ〜ノの反応試薬ではアスコルビン酸の影
響を完全に除去することができるが、硫酸第一鉄アンモ
ニウムのみでは呈色反応が阻筈され、また硫酸第二鉄ア
ンモニウムおよびＮＴＡのみの添加ではアスコルビン酸
の影響を除去する効果がなかった。
以下余白
Ｈ，Ｏ，：過酸化水素
数字は吸光度（０，Ｄ）を表わす
ホルマザン系における鉄錯体のアスコルビン酸の影響除
去の効果を調べるために、代表例としてＣｙＤＴＡ−Ｆ
ｅ （Ｉｌ［）およびＣｙＤＴＡ−Ｆｅ （ＩＩ）を用
い、以下の試験を行なった。
去の効果を調べるために、代表例としてＣｙＤＴＡ−Ｆ
ｅ （Ｉｌ［）およびＣｙＤＴＡ−Ｆｅ （ＩＩ）を用
い、以下の試験を行なった。
１、 使用した試薬
（１）反応試薬（第３表参照Ａ、Ｆ５種類）Ａ、Ｆの構
成４分 ｌ）緩衝液 ・・・・・・ホウ砂 ５０ｍ ｍｏ／！／ｅ （ｐＨ７
，０）２）ＣｙＤＴＡ溶液 、−−−、ＣｙＤＴＡ Ｑ、５ｍ ｍｏｌ／１３）
ＣｙＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）溶液４） ＣｙＤＴＡ−Ｆ
ｅ（ＩＩ）溶液５）硫酸第二鉄アンモニウム溶液 硫酸第二鉄アンモニウム０．５ｍｍ□ψ６）硫酸第一鉄
アンモニウム溶液 ・・・・・・硫酸第一鉄アンモニウム０．５ ｍ ｍｏ
ｌ！／ｌ！上記各溶液の残部は水 第 ３ 表 Ｏ印は添加したものを示す （２）発色液 （ｐＨ７，０） ホウ砂 ５Ｑｍ ｍｏｌ／ｌ！フエナジ
ンメトサルフエー） ０．３ｍ ｍｏｅ／１ニ
トロテトラゾリウムブルー １．５ｍ ｍｏｅ／１
残部水 （３） アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 ２０ｍガｅ 残部水 （４） ＮＡＤＨ溶液 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド２ｍｍａ
ｔ／１ 残部水 ２．８作および結果 第３表の反応試薬Ａ〜Ｆの各２ｍｌに、（３）アスコル
ビン酸溶液２０μｌ！まだは精製水２０μｌを加え、３
７℃で５分間加温した後、（２）発色液Ｌｍｌを加え、
直ちに（４） ＮＡＤＨ溶液２０μｌまたは精製水２０
μｌを添加してさらに３７℃、５分間加温し、波長５８
０ｎｍにおける吸光度を測定した。
成４分 ｌ）緩衝液 ・・・・・・ホウ砂 ５０ｍ ｍｏ／！／ｅ （ｐＨ７
，０）２）ＣｙＤＴＡ溶液 、−−−、ＣｙＤＴＡ Ｑ、５ｍ ｍｏｌ／１３）
ＣｙＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）溶液４） ＣｙＤＴＡ−Ｆ
ｅ（ＩＩ）溶液５）硫酸第二鉄アンモニウム溶液 硫酸第二鉄アンモニウム０．５ｍｍ□ψ６）硫酸第一鉄
アンモニウム溶液 ・・・・・・硫酸第一鉄アンモニウム０．５ ｍ ｍｏ
ｌ！／ｌ！上記各溶液の残部は水 第 ３ 表 Ｏ印は添加したものを示す （２）発色液 （ｐＨ７，０） ホウ砂 ５Ｑｍ ｍｏｌ／ｌ！フエナジ
ンメトサルフエー） ０．３ｍ ｍｏｅ／１ニ
トロテトラゾリウムブルー １．５ｍ ｍｏｅ／１
残部水 （３） アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 ２０ｍガｅ 残部水 （４） ＮＡＤＨ溶液 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド２ｍｍａ
ｔ／１ 残部水 ２．８作および結果 第３表の反応試薬Ａ〜Ｆの各２ｍｌに、（３）アスコル
ビン酸溶液２０μｌ！まだは精製水２０μｌを加え、３
７℃で５分間加温した後、（２）発色液Ｌｍｌを加え、
直ちに（４） ＮＡＤＨ溶液２０μｌまたは精製水２０
μｌを添加してさらに３７℃、５分間加温し、波長５８
０ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果、下記の第４表に示す如く、本発明によるＣｙ
ＤＴＡ−鉄錯体を添加した場合（Ｃ，Ｄ）、ホルマザン
系におけるアスコルビン酸の影響全完全に除去すること
ができるが、硫酸第二鉄アンモニウム、硫酸第一鉄アン
モニウムあるいはＣＹＤＴＡのみの添加では伺ら効果が
なかった。
ＤＴＡ−鉄錯体を添加した場合（Ｃ，Ｄ）、ホルマザン
系におけるアスコルビン酸の影響全完全に除去すること
ができるが、硫酸第二鉄アンモニウム、硫酸第一鉄アン
モニウムあるいはＣＹＤＴＡのみの添加では伺ら効果が
なかった。
第 ４ 表
実施例１ 中性脂肪の測定
１、 試薬
（１）鉄錯体添加試薬 ｐＨ７，６
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＱ、１ｍｏｌ
／ｅ ＴＯＯ８２ｍｍｏｅ／ｅ グリセロキナーゼ １ｏＯｕ／／グリ
セロ−３−リン酸オキシダーゼ ｌｏ＋ｏ００ｕ／／ペ
ルオキシダーゼ ２．．５．０ ：Ｑ
ｕ／ｅアデノシン三リン酸 １ｍｍｏｌ
／ｅＥＤＤＡ−Ｆｅ（Ｉｌｌ）
０．１ｍｍ０ｅ／ｅ（２）対照試薬 ｐＨ７，６ （１）の試薬よりＥＤＤＡ−Ｆｅ （ＲＩ） ヲ除イｆ
ｃ モ０’）（３）反応試薬 ｐＨ７，６ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン０．１ ｍｏ
Ｉｌｌ リボプロティンリパーゼ ２００，０ＯＯｕ／
／４−アミノアンチピリン ３ｍｍｏｌ／１残
部水 （４） アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 ５０ｍυ〜残部水 ２、操作および結果 血清２０μｌ（検体）を入れた試験管２本および精製水
２０μｌ（試薬ブランク）を入れた試験管１本を用意し
、前者のうち１本には（４）アスコルビン「溶液２ｏμ
ｌを、Ｉ他の１本には精製水２０μｌをさらに加える。
／ｅ ＴＯＯ８２ｍｍｏｅ／ｅ グリセロキナーゼ １ｏＯｕ／／グリ
セロ−３−リン酸オキシダーゼ ｌｏ＋ｏ００ｕ／／ペ
ルオキシダーゼ ２．．５．０ ：Ｑ
ｕ／ｅアデノシン三リン酸 １ｍｍｏｌ
／ｅＥＤＤＡ−Ｆｅ（Ｉｌｌ）
０．１ｍｍ０ｅ／ｅ（２）対照試薬 ｐＨ７，６ （１）の試薬よりＥＤＤＡ−Ｆｅ （ＲＩ） ヲ除イｆ
ｃ モ０’）（３）反応試薬 ｐＨ７，６ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン０．１ ｍｏ
Ｉｌｌ リボプロティンリパーゼ ２００，０ＯＯｕ／
／４−アミノアンチピリン ３ｍｍｏｌ／１残
部水 （４） アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 ５０ｍυ〜残部水 ２、操作および結果 血清２０μｌ（検体）を入れた試験管２本および精製水
２０μｌ（試薬ブランク）を入れた試験管１本を用意し
、前者のうち１本には（４）アスコルビン「溶液２ｏμ
ｌを、Ｉ他の１本には精製水２０μｌをさらに加える。
これら３本の試験管それぞれに、（１）鉄錯体添加試薬
２ｍ／を加えた後３７℃で５分間加温し、ついで（３ン
反応試薬１ｍ／を加え、３７℃で５分間加温し、波長５
５５ｎｍにおける吸光度を測定した。同様にして（１）
鉄錯体添加試薬を（２）対照試薬に代えて行ない、吸光
度を測定した。
２ｍ／を加えた後３７℃で５分間加温し、ついで（３ン
反応試薬１ｍ／を加え、３７℃で５分間加温し、波長５
５５ｎｍにおける吸光度を測定した。同様にして（１）
鉄錯体添加試薬を（２）対照試薬に代えて行ない、吸光
度を測定した。
その結果は第５表に示す如く、鉄錯体添加試薬を用いる
とアスコルビン酸の影響を除く効果が非常に大であった
。
とアスコルビン酸の影響を除く効果が非常に大であった
。
第５表
実施例２ トランスアミナーゼの測定（１）１、 試
薬 （１）鉄錯体添加ＧＯＴ （ＧＯＴ ：グルタミン酸オ
キザロ酢酸トランスアミナーゼ）用試薬 ｐＨ７，４リ
ン酸−カリウムｌ Ｏｍｍｏｌ／Ｉ ＴＯＯ８２ｍｍｏｌ／ｌ！ し一アスパラギン酸 １００ｍｍｏＪ／７
α−ケトゲルタール酸 ５ｍｍｏｌ／ｅチ
アミンピロリン酸 ０．４ｍｍｏｌ／１オキザ
ロ酢酸脱炭酸酵素 ２，０ＯＯｕ／／ピルビン酸オ
キシダーゼ ３，０００ｕ／／ペルオキシダーゼ
２，０００ｕ／／ＤＨＢＧ −Ｆｅ （１１
［） ０．５ｍｍｏｌ／１残部 水 （２）対照ＧＯＴ用試薬 ｐＨ１４ （１）の試薬よりＤＨＥＧ−Ｆｅ （ｎ［）を除いたも
の（３）鉄錯体添加ＧＰＴ用試薬 ｐＨ７，４リン酸−
カリウム １０ ｍ ｍｏ ｌ／ＩＴＯＯ８
２ｍｍｏ／／／ Ｌ−アラニン １００ｍｍｏ／／／α−
ケトゲルタール酸 ５ ｍ ｍｏ ｅ／１チア
ミンピロリン酸 Ｑ、４ｍｍｏφピルビン酸オ
キシダーゼ ３，０００ｕ／７ベルオキシダーゼ
２，０ＯＯｕ／ｅＤＨＥＧ−Ｆｅ （ＩＩ）
’０．５ｍｍｏ身を残部 水 （４）対照ＧＰＴ （ＧＰＴ ：グルタミン酸トランス
アミナーゼ）用試薬 （３）ノ試薬よりＤＨＥＧ−Ｆｅ （Ｉ［）を除いたも
の（５）反応試薬 ４−アミノアンチピリ７ ２．’５ｍｍｏ！！
／１残部 水 （６）反応停止液 クエン酸ナトリウム ０１ｍｏ／／７残部 水 （７） アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 ２Ｑｍｐ／ｄ／Ｉ’残部 水 ２、操作および結果 血清２０μｌ（検体）を入れた試験管２本および精製水
２０μｇ（試薬ブランク）を入れた試験管１本を用意し
、前者のうち１本には（７）アスコルビン酸溶液２０μ
ｌを、他の１本には精製水２０μｌをさらに加える。こ
れら３本の試験管それぞれに（１）鉄錯体添加ＧＯＴ用
試薬Ｑ、８ｍ／を加えた後、３７°Ｃ１３分間加温し、
次に（５）反応試薬０２ｍ１を加えて３７℃で２０分間
反応させた後、（６）反応停止液２ｍｌを加え、波長５
５５ｎｍにおける吸光度を測定した。同様にして（１）
の試薬を（２）対照ＧＯＴ用試薬、（３）鉄錯体添加Ｇ
ＰＴ用試薬、または（４）対照ＧＰＴ用試薬に代えて行
ない１．吸光度を測定した。
薬 （１）鉄錯体添加ＧＯＴ （ＧＯＴ ：グルタミン酸オ
キザロ酢酸トランスアミナーゼ）用試薬 ｐＨ７，４リ
ン酸−カリウムｌ Ｏｍｍｏｌ／Ｉ ＴＯＯ８２ｍｍｏｌ／ｌ！ し一アスパラギン酸 １００ｍｍｏＪ／７
α−ケトゲルタール酸 ５ｍｍｏｌ／ｅチ
アミンピロリン酸 ０．４ｍｍｏｌ／１オキザ
ロ酢酸脱炭酸酵素 ２，０ＯＯｕ／／ピルビン酸オ
キシダーゼ ３，０００ｕ／／ペルオキシダーゼ
２，０００ｕ／／ＤＨＢＧ −Ｆｅ （１１
［） ０．５ｍｍｏｌ／１残部 水 （２）対照ＧＯＴ用試薬 ｐＨ１４ （１）の試薬よりＤＨＥＧ−Ｆｅ （ｎ［）を除いたも
の（３）鉄錯体添加ＧＰＴ用試薬 ｐＨ７，４リン酸−
カリウム １０ ｍ ｍｏ ｌ／ＩＴＯＯ８
２ｍｍｏ／／／ Ｌ−アラニン １００ｍｍｏ／／／α−
ケトゲルタール酸 ５ ｍ ｍｏ ｅ／１チア
ミンピロリン酸 Ｑ、４ｍｍｏφピルビン酸オ
キシダーゼ ３，０００ｕ／７ベルオキシダーゼ
２，０ＯＯｕ／ｅＤＨＥＧ−Ｆｅ （ＩＩ）
’０．５ｍｍｏ身を残部 水 （４）対照ＧＰＴ （ＧＰＴ ：グルタミン酸トランス
アミナーゼ）用試薬 （３）ノ試薬よりＤＨＥＧ−Ｆｅ （Ｉ［）を除いたも
の（５）反応試薬 ４−アミノアンチピリ７ ２．’５ｍｍｏ！！
／１残部 水 （６）反応停止液 クエン酸ナトリウム ０１ｍｏ／／７残部 水 （７） アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 ２Ｑｍｐ／ｄ／Ｉ’残部 水 ２、操作および結果 血清２０μｌ（検体）を入れた試験管２本および精製水
２０μｇ（試薬ブランク）を入れた試験管１本を用意し
、前者のうち１本には（７）アスコルビン酸溶液２０μ
ｌを、他の１本には精製水２０μｌをさらに加える。こ
れら３本の試験管それぞれに（１）鉄錯体添加ＧＯＴ用
試薬Ｑ、８ｍ／を加えた後、３７°Ｃ１３分間加温し、
次に（５）反応試薬０２ｍ１を加えて３７℃で２０分間
反応させた後、（６）反応停止液２ｍｌを加え、波長５
５５ｎｍにおける吸光度を測定した。同様にして（１）
の試薬を（２）対照ＧＯＴ用試薬、（３）鉄錯体添加Ｇ
ＰＴ用試薬、または（４）対照ＧＰＴ用試薬に代えて行
ない１．吸光度を測定した。
その結果は第６表に示す如く、鉄錯体添加試薬を加えた
場合にはアスコルビン酸の影響を除く効果が大であった
。
場合にはアスコルビン酸の影響を除く効果が大であった
。
第６表
実施例３ トランスアミナーゼの測定（２）１、 試
薬 （１）鉄錯体添加ＧＯＴ用試薬 ｐＨ７，４リン酸−カ
リウム ｌＱｍｍｏφ４−アミノアンチピリ
ｙ Ｏ，５ｍｍｏ ｅ／１２．４−ジクロルフェ
ノール ２ｍｍｏｅ／／Ｌ−”７スパラギン酸
１００ｍｍｏｅ／／α−ケトゲルタール酸
５ ｍｍｏ ｌ／ｌ！チアミンピロリン酸
０．４ ｍｍｏ ｌ／ｌ！オキザロ酢酸脱炭酸酵素
２ ＋ ＯＯＯｕ／ｅピルビン酸オキシダーゼ
３，０ＯＯｕ／／ペルオキシダーゼ ２．
０００ｕ／７ＥＤＴＡ−ＯＨ−Ｆｅ （［［）
０．２ｍｍｏｆ／７残部 水 （２）対照（’７０Ｔ用試薬 ｐＨ７，４（１）ノ試薬
よりＥＤＴＡ−ＯＨ−Ｆｅ （ｌ［）を除Ｉ／Ｘだもの （３）鉄錯体添加ＧＰＴ用試薬 ｐＨ７，４リン酸−カ
リウム １０ｍｍｏ／／／４−アミノアンチ
ピリン０５ｍｍ０ｅ／ｌ！Ｌ４−シフｏ ／ｌ／７−＋
１− ／−ル２ｍｍｏｌ／ＩＬ −７ラニ７
１００ｍｍｏ／／７α−ケトゲルタール酸
５ｍｍｏＩ！／ｅチアミンピロリン酸 ０
．４ ｍ ｍｏ ｅｌｅピルビン酸オキシダーゼ
３．０００ｕ／ｇペルオキシダーゼ ２
＋０ＯＯｕ／ＩＢＤＴＡ−ＯＨ−Ｆｅ （１［）
０．２ｍｍｏ！！／／残部 水 （４） 対照ＧＰＴ用試薬 ｐＨ７，４（３） ｏ）
ＧＰＴ用試薬よりＥＤＴＡ−ＯＨ−Ｆｅ （ｌ［）を
除いたもの （５）反応停止液 クエン酸ナトリウム Ｑ、１ｍｍ０ｌ！ρ残部
水 （６） アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 Ｉ Ｑ ｍ９／ｄ １残
部 水 ２ 操作および結果 血清２０μｅ（検体）を入れた試験管２本および精製水
２０μｌ（試薬ブランク）を入れた試験管１本を用意し
、前者のうち１本には（６）アスコルビン酸溶液２０μ
ｌを、他の１本には精製水２０μｌを加える。これら３
本の試験管それぞれに（１）の試薬Ｌｍｌを加えて３７
℃、２０分間加温した後、（５）反応停止液２ｒｒ１１
を加え、波長５ＱＱｎｒｎにおける吸光度を測定した。
薬 （１）鉄錯体添加ＧＯＴ用試薬 ｐＨ７，４リン酸−カ
リウム ｌＱｍｍｏφ４−アミノアンチピリ
ｙ Ｏ，５ｍｍｏ ｅ／１２．４−ジクロルフェ
ノール ２ｍｍｏｅ／／Ｌ−”７スパラギン酸
１００ｍｍｏｅ／／α−ケトゲルタール酸
５ ｍｍｏ ｌ／ｌ！チアミンピロリン酸
０．４ ｍｍｏ ｌ／ｌ！オキザロ酢酸脱炭酸酵素
２ ＋ ＯＯＯｕ／ｅピルビン酸オキシダーゼ
３，０ＯＯｕ／／ペルオキシダーゼ ２．
０００ｕ／７ＥＤＴＡ−ＯＨ−Ｆｅ （［［）
０．２ｍｍｏｆ／７残部 水 （２）対照（’７０Ｔ用試薬 ｐＨ７，４（１）ノ試薬
よりＥＤＴＡ−ＯＨ−Ｆｅ （ｌ［）を除Ｉ／Ｘだもの （３）鉄錯体添加ＧＰＴ用試薬 ｐＨ７，４リン酸−カ
リウム １０ｍｍｏ／／／４−アミノアンチ
ピリン０５ｍｍ０ｅ／ｌ！Ｌ４−シフｏ ／ｌ／７−＋
１− ／−ル２ｍｍｏｌ／ＩＬ −７ラニ７
１００ｍｍｏ／／７α−ケトゲルタール酸
５ｍｍｏＩ！／ｅチアミンピロリン酸 ０
．４ ｍ ｍｏ ｅｌｅピルビン酸オキシダーゼ
３．０００ｕ／ｇペルオキシダーゼ ２
＋０ＯＯｕ／ＩＢＤＴＡ−ＯＨ−Ｆｅ （１［）
０．２ｍｍｏ！！／／残部 水 （４） 対照ＧＰＴ用試薬 ｐＨ７，４（３） ｏ）
ＧＰＴ用試薬よりＥＤＴＡ−ＯＨ−Ｆｅ （ｌ［）を
除いたもの （５）反応停止液 クエン酸ナトリウム Ｑ、１ｍｍ０ｌ！ρ残部
水 （６） アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 Ｉ Ｑ ｍ９／ｄ １残
部 水 ２ 操作および結果 血清２０μｅ（検体）を入れた試験管２本および精製水
２０μｌ（試薬ブランク）を入れた試験管１本を用意し
、前者のうち１本には（６）アスコルビン酸溶液２０μ
ｌを、他の１本には精製水２０μｌを加える。これら３
本の試験管それぞれに（１）の試薬Ｌｍｌを加えて３７
℃、２０分間加温した後、（５）反応停止液２ｒｒ１１
を加え、波長５ＱＱｎｒｎにおける吸光度を測定した。
同様にして（１）の試薬を（２）対照ＧＯＴ用試薬、（
３）鉄錯体添加ＧＰＴ用試薬まだは（４）対照ＧＰＴ用
試薬に代えて行ない、吸光度を測定した。
３）鉄錯体添加ＧＰＴ用試薬まだは（４）対照ＧＰＴ用
試薬に代えて行ない、吸光度を測定した。
その結果は、第７表に示す如く、鉄錯体添加試薬を用い
るとアスコルビン酸の影響を除く効果が犬であることが
明らかとなった。
るとアスコルビン酸の影響を除く効果が犬であることが
明らかとなった。
第 ７ 表
実施例４ 乳酸脱水素酵素の測定
■ 試薬
（１）鉄錯体添加試薬 ｐＨ８，６
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン０．１ｍｍｏ
ｌ／１ ＤＬ−乳酸 Ｑ、１５ ｍｍｏ ｌ／１β
−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド５ｍｍｏｅ／
１ ジアホラーセ ３．ｏｏｏｕ／ｇＣｙＤ
ＴＡ−Ｆｅ （ＩＮ） １．５ｍｍｏ
ｅ／ｌ！残部 水 （２）対照試薬 １）Ｈ８，６ （１）ノ試薬よりＣｙＤＴＡ−Ｆｅ（Ｉ［ｒ）を除いた
もの（３）発色液 ニトロテトラゾリウムブルー ３ｍｍｏｌ／ｌ！
残部 水 （４）反応停止液 塩酸 ０・ｉ ｍｏ、ノアを残部
水 （５） アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 ２０ ｍＶｄｅ調部 水 ２ 操作および結果 血清２０μｅ（検体）を入れた試験管２本および精製水
２０μｅ（試薬ブランク）を入れた試験管１本を用意シ
ー、前者のうち１本には（５）アスコルビン酸溶液２０
μｌを、他の１本には精製水２０μｌを加える。これら
３本の試験管それぞれに（１）の試薬Ｑ、８ｒｒ＋／を
加えて３７″Ｇ、３分間加温し、（３）発色液０．２ｒ
Ｍ！を加えて３７’（：、、２０分間反応させた後、（
５）反応停止液５ｍｌ！を加え、波長５７Ｑｎｍにおけ
る吸光度を測定した。同様にして（１）の試薬を（２）
の試薬に代えて行ない、吸光度を測定した。
ｌ／１ ＤＬ−乳酸 Ｑ、１５ ｍｍｏ ｌ／１β
−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド５ｍｍｏｅ／
１ ジアホラーセ ３．ｏｏｏｕ／ｇＣｙＤ
ＴＡ−Ｆｅ （ＩＮ） １．５ｍｍｏ
ｅ／ｌ！残部 水 （２）対照試薬 １）Ｈ８，６ （１）ノ試薬よりＣｙＤＴＡ−Ｆｅ（Ｉ［ｒ）を除いた
もの（３）発色液 ニトロテトラゾリウムブルー ３ｍｍｏｌ／ｌ！
残部 水 （４）反応停止液 塩酸 ０・ｉ ｍｏ、ノアを残部
水 （５） アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 ２０ ｍＶｄｅ調部 水 ２ 操作および結果 血清２０μｅ（検体）を入れた試験管２本および精製水
２０μｅ（試薬ブランク）を入れた試験管１本を用意シ
ー、前者のうち１本には（５）アスコルビン酸溶液２０
μｌを、他の１本には精製水２０μｌを加える。これら
３本の試験管それぞれに（１）の試薬Ｑ、８ｒｒ＋／を
加えて３７″Ｇ、３分間加温し、（３）発色液０．２ｒ
Ｍ！を加えて３７’（：、、２０分間反応させた後、（
５）反応停止液５ｍｌ！を加え、波長５７Ｑｎｍにおけ
る吸光度を測定した。同様にして（１）の試薬を（２）
の試薬に代えて行ない、吸光度を測定した。
その結果は第８表に示す如く、鉄錯体を用いた場合には
アスコルビン酸の影響を除く効果が犬であった。
アスコルビン酸の影響を除く効果が犬であった。
第 ８ 表
以上で明らかな如く、本発明は上記し丸鉄錯体を添加し
て体液成分の測定を行なうことにより、測定値に及ぼす
アスコルビン酸の影響を完全に除去することができるも
のである。
て体液成分の測定を行なうことにより、測定値に及ぼす
アスコルビン酸の影響を完全に除去することができるも
のである。
Claims (1)
- （１）次の一般式（Ａ）または（Ｂ） （式中Ｒ１〜５はそれぞれＨ；アルキル基：カルボキシ
アルキル基；またはヒドロキシアルキル基であり、Ｘは
エチレン基；１個まだは２個のアルキル、カルボキシア
ルキルまたはヒドロキシアルキルが置換したエチレン基
；モジくはトランスシクロヘキセン基である。） で表わされる化合、物の鉄錯体、またはグルコン酸の鉄
錯体の１種または２種以上を添加することを特徴とする
体液成分測定におけるアスコルビン酸の消去方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6096983A JPS59187266A (ja) | 1983-04-08 | 1983-04-08 | 体液成分測定におけるアスコルビン酸の消去方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6096983A JPS59187266A (ja) | 1983-04-08 | 1983-04-08 | 体液成分測定におけるアスコルビン酸の消去方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59187266A true JPS59187266A (ja) | 1984-10-24 |
| JPH0141223B2 JPH0141223B2 (ja) | 1989-09-04 |
Family
ID=13157748
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6096983A Granted JPS59187266A (ja) | 1983-04-08 | 1983-04-08 | 体液成分測定におけるアスコルビン酸の消去方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59187266A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0811844A1 (en) * | 1996-06-07 | 1997-12-10 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Reagent composition, testing piece and assay kit |
| US5702955A (en) * | 1995-05-22 | 1997-12-30 | Bayer Corporation | Ascorbate resistant detection of hydrogen peroxide |
| JP2013172676A (ja) * | 2012-02-24 | 2013-09-05 | Sapporo Breweries Ltd | ノンアルコール飲料の品質を保証するキット及び方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55142249A (en) * | 1979-04-24 | 1980-11-06 | Shionogi & Co Ltd | Reduction type ascorbic acid detecting composition and test piece |
| JPS55150897A (en) * | 1979-04-10 | 1980-11-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method and apparatus for removing ascorbic acid from agueous solution |
-
1983
- 1983-04-08 JP JP6096983A patent/JPS59187266A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55150897A (en) * | 1979-04-10 | 1980-11-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method and apparatus for removing ascorbic acid from agueous solution |
| JPS55142249A (en) * | 1979-04-24 | 1980-11-06 | Shionogi & Co Ltd | Reduction type ascorbic acid detecting composition and test piece |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5702955A (en) * | 1995-05-22 | 1997-12-30 | Bayer Corporation | Ascorbate resistant detection of hydrogen peroxide |
| EP0811844A1 (en) * | 1996-06-07 | 1997-12-10 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Reagent composition, testing piece and assay kit |
| CN1113240C (zh) * | 1996-06-07 | 2003-07-02 | 株式会社京都第一科学 | 试剂组合物、试验片和分析盒 |
| JP2013172676A (ja) * | 2012-02-24 | 2013-09-05 | Sapporo Breweries Ltd | ノンアルコール飲料の品質を保証するキット及び方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0141223B2 (ja) | 1989-09-04 |
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