DE2754944B2 - Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Ascorbinsäure - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure oder Dehydroascorbinsäure und ein zur Durchführung des Verfahrens geeignetes Reagens.

Die Bestimmung von Ascorbinsäure ist vor allem in der Lebensmittelchemie von großer Bedeutung. Sie wird zur Beurteilung der Qualität verschiedener Nahrungsmittel benötigt, wie z. B. die von Obstsäften, Frischgemüse, Tiefkühlgemüse und anderen Proben. Oft wird gerade bei Erfrischungsgetränken ein bestimmter Vitamin C-gehalt deklariert, der dann auch gehalten werden muß. Aber auch als Antoxidans und als Schönungsmittel wird Ascorbinsäure zugesetzt und muß dann bestimmt werden. Im klinisch-diagnostischen Bereich ist der Ascorbinsäuregehalt vor allem im Urin von Interesse, wo er zu Störungen in den verschiedenen, auf Red-Ox- Reaktionen beruhenden Schneildiagnostika Anlaß gibt Die Ascorbatbestimmung im Serum ist in tropischen Längern von Interesse, da hier Avitaminosen (Skorbut) oft von den Symptomen anderer Krankheiten so überdeckt sind, daß sie nicht zu diagnostizieren sind. Aufgrund der Bedeutung der Ascorbinsäurebestimmung sind schon verschiedene Verfahren entwickelt und publiziert worden, deren Spezifität aber in der Regel gering ist und die einen zum Teil erheblichen Aufwand erfordern. Eine Zusammenfassung der bekannten Verfahren, ihrer Spezifität und ihrer Praktikabilität findet sich in Handbuch der Lebensmittelchemie, Hrg. J. Schormüller, Bd. II, 2, Springer-Verlag Berlin-Heidelberg, 1967,764-789.

Die obigen Ausführungen gelten auch für die Dehydroascorbinsäure. Ascorbinsäure wird nämlich durch Luftsauerstoff leicht in Dehydroascorbinsäure überführt. Im Probenmaterial liegt daher häufig eine Mischung von Ascorbinsäure und Dehydroascorbinsäure vor. Da Dehydroascorbinsäure die gleiche Vttaminwirkung besitzt wie Vitamin C, ist es zumeist sinnvoll zu prüfen, wie groß der Dehydroascorbatgehalt der Probe ist.

Es sind auch bereits Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure mittels Tetrazoliumsalzen bekanntgeworden, Mikrochim. Acta 1970, S 457—462. Diese Reaktionen verlaufen entsprechend der Gleichung:

Tetrazoliumsalz + Ascorbat

-► Formazan+ Dehydroascorbat+ H ⁺

Diese Verfahren, die in alkalischem Milieu durchgeführt werden müssen, werden jedoch durch zahlreiche

Substanzen stark gestört und wurden daher auch von den Entwicklern nur zur Bestimmung von Reinsubstanzen bzw. für pharmazeutische Zubereitungen, die keine größeren Mengen an Störsubstanzen enthalten, vorgeschlagen. In eigenen Versuchen konnte die Brauchbarkeit dieser Methoden nicht bestätigt werden.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure zu schaffen, welches die oben angegebenen Nachteile nicht aufweist spezifischer als die bekannten Verfahren ist und insbesondere nicht die Störungsanfälligkeit gegenüber Fremdsubstanzen aufweist, die bisher bei Verwendung von Tetrazoliumsalzen auftrat Ein Ziel der Erfindung ist auch die Schaffung eines Verfahrens der vorstehend bezeichneten Art welches auch auf Dehydroascorbinsäure angewendet werden kann.

Es wurde nunmehr gefunden, und hierauf beruht die Erfindung, daß In schwach saurem pH-Wert mit ganz bestimmten Tetrazoliumsalzen in Gegenwart eines bestimmten Elektronenüberträgers und eines oberflächenaktiven Mittels die Störung durch Fremdsubstanzen praktisch vollständig ausgeschaltet wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure mittels Tetrazoliumsalz unter Messung der erhaltenen Färbung ist daher dadurch gekennzeichnet daß die Umsetzung in Gegenwart von

3-(4,5-Dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, Nitrotetrazoliumblau, Tetrazoliumblau-chlorid oder Distyryl-nitroblau-tetrazoliumchlorid zusammen mit Phenazinmethosulfat und einem Detergens bei schwach saurem pH-Wert durchgeführt wird.

Unter den verwendbaren Tetrazoliumsalzen ergibt das 3-(4,5-Dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid, im folgenden als MTT bezeichnet, die besten Ergebnisse und wird daher im Rahmen der Erfindung bevorzugt Das Tetrazoliumsalz wird vorzugsweise in einer Menge von 0,01 bis 1 mMol/1 Testlösung, besonders bevorzugt von 0,05 bis 0,15 mMol/1 verwendet.

Wie oben erwähnt ist es wesentlich für das Verfahren der Erfindung, daß bei schwach sauren pH-Werten gearbeitet wird. In diesem pH-Wertbereich findet keine Reaktion mit den meisten Störsubstanzen statt bzw. wird die Reaktion so verlangsamt, daß sie praktisch bedeutungslos wird. Allerdings ist bei diesem sauren pH-Wert auch die Umsetzungsgeschwindigkeit mit der Ascorbinsäure so gering, daß ein praktisches Bestimmungsverfahren hierauf nicht aufgebaut werden könnte. Durch das Phenazinmethosulfat in Kombination mit dem Detergens wird jedoch spezifisch die Umsetzung der Ascorbinsäure so beschleunigt, daß trotzdem befriedigende Reaktionsgeschwindigkeiten erzielt werden. Überraschenderweise wird die Reaktion mit den Störsubstanzen jedoch durch die genannten Zusätze nicht beschleunigt.

Zur Einstellung des schwach sauren pH-Wert-bereichs, vorzugsweise eines pH-Werts zwischen 4,5 und 6,0 und besonders bevorzugt zwischen 4,8 und 5,3, eignen sich verschiedene Puffersysteme. Diejenigen Puffersysteme, die im genannten pH-Bereich puffern, sind dem Fachmann bekannt. Gute Reaktionsgescnwindigkeiten wurden mit Phosphatpuffer, TRA-Puffer und Phosphat/Citrat-Puffer erzielt und diese Puffer werden daher bevorzugt. Besonders gute Ergebnisse liefert der Phosphat/Citrat-Puffer, da mit diesem Puffer die < >5 Proportionalität der Extinktionsänderung durch den gebildeten Farbstoff bei allen Ascorbatmengen am besten erfüllt wird. Die zweckmäßige Pufferkonzentration liegt zwischen 0,05 und 1 molar, bevorzugt werden 0,1 bis 0,5 Mol/l.

Das jeweils geeignete Detergens kann leicht durch einige Versuche festgestellt werden. Die höchsten Reaktionsgeschwindigkeiten wurden mit Benzalkoniiimchlorid (Zephirol) erzielt Bei manchen Proben führte dieses Detergens jedoch zur Bildimg von Niederschlagen, welche die Bestimmung stören können. Als bester Kompromiß zwischen Reaktionsbeschleunigung und Klarhaltung der Probelösungen erwiesen sich die Alkylaryl-polyäthylenglykolester. Andere Beispiele für gut geeignete Detergentien sind Polyoxyäthylensorbitanester, wie Sorbimacrogol-stearat oder Polyäthylenglykollauryläther. Als Gruppe werden daher die nichtionogenen Polyäthylenglykolester und -äther im Rahmen der Erfindung bevorzugt ganz besonders bevorzugt wird' der Octyl-phenol-polyäthylenglykolester (Triton XlOO).

Für die Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit reichen im allgemeinen Konzentrationen zwischen 0,1 und 1% des Detergens aus. Oberhalb von 1% wurde eine weitere Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit nicht mehr festgestellt Da im Rahmen der Erfindung das Detergens jedoch nicht nur als Reaktionsbeschleuniger wirkt sondern auch die Löslichkeit des gebildeten Formazans verbessert, werden Zusätze zwischen 1 und 2% bevorzugt.

Die Beschleunigung der Reaktion wird außerdem durch das Phenazinmethosulfat (PMS) bewirkt, welches die Reaktionsgeschwindigkeit vervielfacht und vor allem einen quantitativen Umsatz bewirkt Mit anderen, bekannten Elektronenüberträgern wurde diese Beschleunigungswirkung nicht festgestellt. Die Konzentrationen können zwischen 0,01 und 1 mMol/1 liegen, in Ausnahmefällen auch darüber und darunter. Als besonders geeignet erwies sich eine Konzentration zwischen 0,05 und 0,15 mMol/1, da hierbei noch keine Reaktion mit SH-gruppenhaltigen Verbindungen, wie Homocystein, eintritt Derartige SH-gruppenhaltige Verbindungen können zugesetzt werden, wenn vorhandenes Dehydroascorbat gleichzeitig zu Ascorbat oxidiert werden soll. Hierauf wird weiter unten noch eingegangen.

Wenn die zu untersuchende Probe zur Chelatbildung neigende, zweiwertige Metallionen enthält, so können Chelate mit dem gebildeten Formazanfarbstoif entstehen, welche die Meßwerte beeinflussen können. Die Chelatbildung wird zwar durch den bevorzugt verwendeten Citrat/Phosphat-Puffer weitgehend ausgeschaltet. Es erwies sich jedoch als zweckmäßig, außerdem noch kleine Mengen von Sequestrierungsmitteln, wie Äthylendiamintetraessigsäure u. ä., zuzusetzen. Geeignete Mengen liegen im allgemeinen zwischen 0,1 und 5 mMol/1. Für besondere Zwecke, insbesondere bei der Analyse von Proben mit sehr hohem Gehalt an zweiwertigen Metallionen, können jedoch auch größere Zusätze zweckmäßig sein.

In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Parallelprobe mitgeführt, welche das gleiche Reagens enthält wie der Bestimmungsansatz, zusätzlich jedoch noch Ascorbatoxidase enthält. Die Ascorbatoxidase oxidiert spezifisch das in dem Parallelansatz enthaltene Ascorbat. Nach Ablaufen dieser Oxidationsreaktion wird diese Parallelprobe dann als Leerwert für die eigentliche Ascorbinsäurebestinimung verwendet. Dies heißt, daß die Extinktion des Leerwerts von der Extinktion der eigentlichen .Meßreaktionslösun** subtrahiert wird und

die Differenz der Berechnung der Ascorbinsäuremenge zugrunde gelegt wird.

Diese bevorzugte Ausführungsform der Erfindung steigert die Spezifität der Methode noch weiter, insbesondere dann, wenn in der Probelösung noch andere Substanzen vorhanden «.lad, bei denen eine Reaktion mit dem Tetrazoliumsalz nicht auszuschließen ist. Die Aseorbatoxidase wird zweckmäßig in Mengen zwischen 1 und 50 U/ml Testlösung eingesetzt Für Reihenanalysen bestimmter, weitgehend gleich zusammengesetzter Proben, insbesondere von Nahrungsmitteln, läßt sich leicht durch wenige Vorversuche feststellen, welche Ascorbatoxidasemenge in der Regel ausreicht, um vorhandenes Ascorbat quantitativ zu oxidieren.

Wie bereits erwähnt läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Bestimmung der Dehydroascorbinsäure einsetzen. Zu diesem Zweck wird die Dehydroascorbinsäure zuerst in Ascorbinsäure überführt und diese dann in der oben beschriebenen Weise bestimmt. Die Reduktion erfolgt zweckmäßig mit einer organischen Sulfhydrylverbindung. Bevorzugt wird Homocystein. Das Reduktionsmittel wird dabei im Überschuß verwendet und die Reduktion in neutralem oder schwach alkalischem Medium durchgeführt. Wird eine Sulfhydrylverbindung verwendet, so erweist sich eine Reduktion bei pH-Werten zwischen 7 und 8 als vorteilhaft. Bei dem bevorzugten Homocystein werden bei pH-Werten um etwa 7,5 beste Ergebnisse erzielt. Wenn anschließend für die Bestimmung der gebildeten Ascorbinsäure der schwach saure pH-Wert eingestellt wird, läuft die Umsetzung mit der Ascorbinsäure glatt ab, ohne daß die Überschüsse Sulfhydrylverbindung im Laufe der Reaktion neu gebildete Dehydroascorbinsäure wieder zurückreduziert und damit das Ergebnis verfälscht.

Diese Ausführungsweise des- erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich auch zur Bestimmung von Dehydroascorbinsäure neben Ascorbinsäure einsetzen. Hierzu ist es lediglich notwendig, in einer Probe in der vorstehend beschriebenen Weise Ascorbinsäure zu bestimmen und in einer zweiten Probe zuerst die Dehydroascorbinsäure, wie oben angegeben, zu reduzieren und danach die Bestimmung durchzuführen. Aus der Differenz der beiden Werte ergibt sich dann die Dehydroascorbinsäuremenge.

Unter den bevorzugten Bedingungen läuft das Verfahren der Erfindung in etwa 30 Minuten quantitativ ab, d. h. die Reaktion kommt nach ungefähr einer halben Stunde zum Stillstand. Die Messung kann beispielsweise in einem handelsüblichen Photometer bei einer für die Bestimmung des gebildeten Farbstoffs geeigneten Wellenlänge, wie 578 nm durchgeführt werden. Es lassen sich jedoch auch die anderer, bekannten Methoden zur Bestimmung der Stärke einer entwickelten Färbung einsetzen. Auch die Auswertung durch Farbvergleich führt zu befriedigenden Ergebnissen, insbesondere wenn das erfindungsgemäße Verfahren auf einem Teststreifen durchgeführt wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur Bestimmung von Ascorbinsäure und Dehydroascorbinsäure mit einem Gehalt an Tetrazoliumsalz und Puffer, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Tetrazoliumsalz eine Verbindung aus der Gruppe 3-(4,5-Dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, Nitrotetrazoliumblau, Tetrazoliumblauchlorid oder Distyrylnitroblau-tetrazoliumchlorid und außerdem Phenazinmethosulfat, ein Detergens und

eine schwach saure Puffersubstanz sowie gegebenenfails ein Sequestrierungsmittel oder/und Ascorbatoxidase oder/und eine Sulfhydrylverbindung enthält

Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße Reagens a's Puffersubstanz Phosphat/Citrat-puffer, pH 4,5 bis 6. Die bevorzugte Tetrazoliumsalzverbindung ist ΜΤΓ.

Ein bevorzugtes Reagens der oben genannten Art enthält

0.01 bis 1 mMol/I MTT,

0,01 bis 1 mMoi/1 PMS,

0,1 bis 2% V/V Detergens,

0,1 bis 1 Mol/I Puffersubstanz,

1 bis 50 U/ml Aseorbatoxidase und

0,1 bis 10 mMol/1 Sequestrierungsmittel,

jeweils bezogen auf die Konzentration in der fertigen Testlösung. Das erfindungsgemäße Reagens kann in trockener oder flüssiger Form, als Konzentrat oder gebrauchsfertige Lösung vorliegen. Sämtliche Bestandteile, ausgenommen die Ascorbinoxidase, können vorgemischt vorliegen.

Ein besonders bevorzugtes Reagens der obigen Art enthält

0,05 bis 0,15 mMol/I MTT,

0,05bisO,15mMol/lPMS,

0,5 bis 1,5% V/V Octylphenol-polyäthylenglykolester,

0,5bis5mMolEDTA,

0,1 bis 0.4 mMol/1 Phosphat/Citrat-Puffer, pH 4,8

bis 5,3 und

1 bis 10 U/ml Aseorbatoxidase.

Die Erfindung schafft eine einfache und spezifische Methode zur Bestimmung von Ascorbinsäure (Vitamin

C) und Dehydroascorbinsäure, die gegenüber bekannten Verfahren wesentlich spezifischer und weniger störungsaiifällig ist und mit einfachen Mitteln durchgeführt werden kann. Die Erfindung schafft auch zur Durchführung des Verfahrens geeignete Reagentien, die auch in Form eines Teststreifens angewendet werden können. Bei derartigen Teststreifen wird ein entsprechendes, vorzugsweise blattförmiges Trägermaterial, beispielsweise saugfähiges Papier, wie Filterpapier oder Kunststoffolie, mit dem Reagens imprägniert und dann

■i! entweder in die zu untersuchende Probe eingebracht oder diese Probe aufgetropft. Die Auswertung kann dann durch Farbvergleich erfolgen. Herstellung und Aufbau von Teststreifen sind dem Fachmann bekannt und bedürfen hier keiner näheren Beschreibung.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Phosphat/Citrat-puffer, oberflächenaktives Mittel, Sequestrierungsmittel, Tetrazoliumsalz, PMS sowie Wasser und Probe wurden in die Küvette eines handelsüblichen Photometers eingebracht, die Reaktion ablaufen gelassen und die Extinktionsdifferenz gegen

fao Luft oder Wasser gemessen. In einer parallelen Leerwertprobe wurde außerdem Aseorbatoxidase eingesetzt. Die gleiche Ascorbatoxidasemenge wurde der Meßwertprobe nach Beendigung der Reaktion zugesetzt, um durch die Aseorbatoxidase selbst etwa

b^r> hervorgerufene Extinktionsdifferenzen auszugleichen.

Die Einzelheiten des Verfahrens, die verwendeten Reagentien und ihre Mengen ergeben sich aus der nachstehenden Tabelle.

Tabelle

Lccrwcrt
(mil

l'rohe

(πι I) Konzentration im

Na₁HPO₄ 0,4 Mol/I/Citronensiiure
0.2'Mol/l. pH 5 + 3¹·;. Triton X 100
+■ 2 mMol/1 ETDA

Wasser
Probe

1,5

1,0
0.1

0.02

0,1

ΛΛΟ 500 U/ml

2 min inkubieren, dann

MTT 1,5 mMol/l 0.2

I'MS 1,5 mMol/l 0,2

Inkubieren. bis die Reaktion /um Stillstand gekommen ist (cn. 30 min'

AAO 500 U/I - 0,02

Na-HPO₄ 0.2 Mol/l Citronensäure
0.2 Mol/l. Triton XlOO 1.5"..
L'DTA/1 mMol/l

1-50 v.Mol/l =0,176 - 8.8 mg/1
Ascorbat

3.3 I.'/ml Testlösung

0.1 mMol/l
0.1 mMol/l

3.3 I' /I

Die oben angegebene Zusammensetzung eignet sich zur Bestimmung von 5 bis 250 mg Ascorbat pro Liter Probeflüssigkeit. Bei höheren Konzentrationen ist die Probe entsprechend zu verdünnen.

Bei geringeren Konzentrationen kann die Probemenge erhöht werden. Der Wassergehalt wird dann entsprechend erniedrigt.

Beispiel 2
Ascorbatbestimmung in Orangensaft

Von einem käuflichen Orangensaft wurde 0,1 ml direkt als Probe wie in Beispiel 1 beschrieben, eingesetzt. Es fanden sich 305 mg Vitamin C/i. Das entspricht der Deklaration von 4 Pfund reifen Oiangen ( = 300 mg/l). Zugesetzte Ascorbinsäure wurde zu ;00% ·■' ledcigeiunden. Schleichreaktionen !raten nicht auf und Uo geringe Trübung des Orangensafts blieb ohne Einfluß auf die Bestimmung.

B e i s p i e ! 3

2.0 g eines Citronenteegetränks (Nestea) wurden in 20 π! H:O gelöst und 0.1 ml dieser Lösung in den Test nach ikispiel 1 eingesetzt. Gefunden wurden 96 mg Vitamin CViOOg Trockenmasse. Schieichreaktionen wurden nicht festgestellt. Der Probe vor dem Auflösen zugesetzte Ascorbinsäure wurde zu 99.2% wiedergefunden. Hie geringe Trübung der Lösung war ohne Einfluß auf den Test.

Beispiel 4

Bestimmung in Hagebutten

5 ml Hagebuttenkonzentrat wurden in 100 ml H2O gelöst. Davon wurden nach dem Zentrifugieren 0,1 ml in den Test nach Beispiel 1 eingesetzt. Es fanden sich 1770 mg Vitamin O> Konzentrat. Ein Leichter Schieich trat in Probe und Leerwert auf. Er wurde durch Extrapolation berücksichtigt. Vor dem Verdünnen zugesetzte Ascorbinsäure wurde zu 100.9% wiedergefunden. Die leichte Färbung des so verdünnten Extrakts störte die Bestimmung nicht.

Beispiel 5
Bestimmung in iohannisbeersaft

1 ml schwarzer lohannisbeersaft wurde mit Wasse auf 10 ml verdünnt und davon 0.1 ml in den Test nact Beispiel 1 eingesetzt. Es fanden sich 305 mg Vitamin C/I Vor dem Verdünnen zugesetzte Ascorbinsäure wurd( zu 100°/» wiedergefunden. Schleichreaktionen konnter nicht beobachtet werden. Um zu prüfen, ob dei unverdünnte, stark gefärbte Saft zu Störungen Aniaf. gab. wurde er 4 Wochen offen im Kühlschrank gelagert um den Ascorbatgehalt zu senken. Dann wurde 0.1 m Saft unverdünnt in den Test eingesetzt. Es fanden sich noch 93 mg Vitamin C/I. Die starke Probenfärbunt störte nicht. Auch Schleichreaktionen traten nicht auf Zugesetzte Ascorbinsäure wurde vollständig wiedergefunden.

Beispiel 6
Bestimmung in Bier

Bier, das außerhalb Bayerns gebraut ist. daß /u Schönungszv. ecken und zur Haltbarmachung Ascorbinsäure enthalten. Dagegen ist Q^r Zusatz nach dem ba\erischen Reinhcitsgeboi verboten. Weder in heilem oder dunklem K-ißbier noch in Dosenbier wurde bei der Durchführung des Verfahrens vor, Beispiel 2 Ascorbinsäure gefunden. Störungen konnten nicht festgestelh werden und zugesetzte Ascorbinsäure wurde vollständig vviedergefvirick--

Be ispiel 7
Bestimmung in Spinat

Blanchierter, tiefgefrorener Spinat wurde aufgetaut und gründlich gemischt. 50 g davon wurden nach denn Verfahren von Marchesini et al (I. Food Science 39 [1974], 568 bis 571) aufgearbeitet, nur daß anstelle von HPO3 Phosphorsäure eingesetzt wurde. Bei einem Einsatz von 0,2 mi des auf pH 5 gestellten Extrakts wurden bei der Durchführung des Verfahrens von Beispie! 1 22mg Ascorbat/!00g tiefgefrorenen Spinat gefunden. Bei einem Trockengewicht von 8% entspricht das 275 iT.g Ascorbat/100 g Trockenmasse und somit

den Befunden für blanchierten Spinat verschiedener Sorten. Vor der Extraktion zugesetzte Ascorbinsäure wurde zu 98,8% wiedergefunden. .Schleichreaktionen konnten nicht beobachtet werden.

Beispiel 8
Bestimmung in Kartoffeln

50 g Kartoffeln wurden gewaschen, zerkleinert und in gleicher Weise wie der Spinat in Beispiel 7 aufgearbeitet. Der Extrakt wurde auf pH 5 gestellt und auf 100 ml aufgefüllt. Nach dem Zentrifugieren wurden 500 ml in den Test eingesetzt. Es fanden sich 18.9 mg Ascorbat/kg Kartoffeln. Normal sind ca. 150 mg/kg. Es handelte sich jedoch um alte Ware, die schon sehr ausgetrocknet und teilweise gekeimt war. Unter diesen Bedingungen sinkt der Vitamin C-gehalt stark ab und kann sogar völlig verschwinden. Zur Prüfung wurde den Kartoffeln vor der Extraktion 75 mg Ascorbinsäure zugesetzt und das Extraktionsverfahren durchgeführt. Es fanden sich 97% dieses inneren Standards wieder. Schleichreaktionen traten nicht auf.

Beispiel 9
Bestimmung in Serum

Der Gehalt von Ascorbinsäure im Serum soll zwischen 2 und 15 mg/1 betragen. Daher wurde 1 ml mit Trichloressigsäure enteiweißtes Probenmaterial in den Test eingesetzt. In 6 verschiedenen Seren fanden sich 1,5 bis 2,64 mg Ascorbat/1. Schleichreaktionen traten nicht auf. Die Wiederfindung zugesetzter Ascorbinsäure betrug praktisch 100% bei Zugabe von 17,2 mg Ascorbat/I Serum.

IO

Beispiel 10
Bestimmung in Urin

Der Gehalt an Ascorbat im Harn kann erhebliche ι Werte erreichen. Bei normaler Ernährung beträgt die Ausscheidung im Urin 10 bis 100 mg/1. Bei Einnahme höherer Dosen als 100 mg werden 60 bis 80% der eingenommenen Menge im Urin wiedergefunden, so daß bei der heute vielfach üblichen Einnahme größerer

ίο Ascorbinsäuremengen im Harn auch größere Werte als 100 mg/1 zu erwarten sind. In einem frischen Urin wurden beim Einsatz von 0,1 ml 257 mg Ascorbat/1 bei einer Wiederfindung von 98,3% gefunden, ohne daß Schleichreaktionen oder andere Störungen beobachtet wurden.

Beispiel 11

So hohe Vitamin C-gehalte im Urin, wie sie in Beispiel 10 gefunden wurden, können die Farbstoffbildung üblicher Teststreifen für Glucose, Blut oder Bilirubin usw., die auf Oxidation verschiedener Leucofarbstoffe beruhen, ganz oder teilweise unterdrücken und zu falschen Resultaten führen. Ob diese Gefahr besteht, kann durch einen Teststreifen festgestellt werden. Ein Rundfilter aus Testpapier wurde hierzu gründlich mit 0,2MoI Na₂HPO₄/0,l Mol/l Citronensäurepuffer von pH 5 gewaschen, abgesaugt und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Anschließend wurde das Leerwertgemisch von Beispiel !,jedoch ohne Probe und Ascorbatoxidase, über das in einer Petrischale liegende Filter gegossen und erneut unter Vakuum und Lichtabschluß bei Raumtemperatur getrocknet. Auf das so vorbereitete Filter wurde je ein Tropfen von Lösungen, enthaltend 2, 5, 10, 25 und 50 mg Ascorbat/ 100 ml, aufgetropft. Innerhalb einer Minute bildeten sich blauviolette Flecken, deren Farbintensität mit steigender Ascorbatmenge zunahm. Wasser ergab lediglich eine leichte Gelbfärbung.

Claims (14)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure oder Dehydroascorbinsäure mit Tetrazoniumsalz und Auswertung der erhaltenen Färbung, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Gegenwart von 3-(4,5-Dimethyl-thiazolyl-2)-25-diphenyltetrazoliumbromid, Nitrotetrazoliumblau, Tetrazoliumblau-chlorid oder Distyryl-nitroblau-te- )o trazoliumchlorid zusammen mit Phenazinmethosulfat und einem Detergens bei schwach saurem pH-Wert durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert durch Phosphat/Citrat- puffer eingestellt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Alkylaryl-polyäthylenglykolester als Detergens verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein pH-Wert zwischen 4,5 und 6 eingestellt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Sequestrierungsmittel zugesetzt wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß einem Leerwertansatz mit Probelösung Ascorbatoxidase zugesetzt und die Leerwertextinktion nach Beendigung der Oxidationsreaktion von der Extinktion der eigentlichen Bestimmungsreaktion substrahiert wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung von Dehydroascorbat der Probelösung überschüssige Sulfydrylverbindung bei einem pH-Wert zwischen 7 und 8 zugesetzt und nach Beendigung der Oxidation auf pH 4,8 bis 5,3 gebracht und die Ascorbinsäure bestimmt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Sulfhydrylverbindung Homocystein verwendet wird.

9. Reagens zur Bestimmung von Ascorbinsäure und Dehydroascorbinsäure mit einem Gehalt an Tetrazoliumsalz und Puffer, dadurch gekennzeichnet, daß es als Tetrazoliumsalz eine Verbindung aus der Gruppe 3-(4,5-Dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, Nitrotetrazoliumblau, Tetrazoliumblau-chlorid oder Distyrylnitroblau-tetrazoliumchlorid und außerdem Phenazinmethosulfat, ein Detergens, eine schwach saure Puffersubstanz und gegebenenfalls eine Sulfhydrylverbindung oder/und Ascorbatoxidase oder/und ein Sequestrierungsmittel enthält.

10. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Puffersubstanz aus Phosphat/Citrat-puffer, pH 4,5 bis 6, besteht.

11. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es 3-(4,5-Dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid enthält. < >o

12. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es als Detergens einen Alkylarylpolyäthylenglykol-ester enthält.

13. Reagens nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es *>' 0,01 bis 1 mMol pro Liter 3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltet.razoliumbromid,

0.01 bis 1 mMol pro Liter Phenazinmethosulfat.

0,1 bis 1 Mol pro Litsr Puffersubstanz,

0,1 bis 2 Gew.-% Detergens,

1 bis 50 U pro ml Ascorbatoxidase,

0,1 bis 10 mMol pro Liter Sequestrierungsmittel,

bezogen auf die fertige Testlösung, enthält

14. Reagens nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es aus

0,05 bis 0,15 mMol pro ml 3-{4,5-Dimethylthiazolyl-2)-24-dipnenyltetrazo!iumbromid, 0,05 bis 0,15 niMoi pro Liter Phenazinmethosulfat, 0,5 bis 1,5% Octylphenyl-polyäthylenoxidäther, 05 bis 5 mMol pro Liter Äthylendiamin-tetraessigsäure,

0,1 bis 0,4 mMol pro Liter Phosphat/Citrat-puffer, pH 4,8 bis 5,3,

1 bis 10 U pro ml Ascorbatoxidase, jeweils bezogen auf fertige Testlösung, besteht oder diese enthält