DE3239236C2 - - Google Patents

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Hirano Iwakura Aichi Jp Kenichi
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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung des konjugierten Bilirubins in biologischen Flüssigkeiten.
Bilirubin (C₃₃H₃₆N₄O₆) ist ein gelbes Pigment, das in biologischen Flüssigkeiten, wie Blutserum, Urin usw. vorkommt. Ein im Gehirn von Ratten oder Guineaschweinen vorkommendes Enzym und ein aus einem Pilz der Art Agaricus hergestellte Enzym wirken nach bisherigen Berichten auf Bilirubin (Eur. J. Biochem. 10, 468, 1969; EP 5 637). Die enzymologischen Eigenschaften dieser Enzyme sind noch nicht geklärt.
Eine Suche nach Mikroorganismen, die eine auf Bilirubin wirkendes Enzym erzeugen, hat gezeigt, daß einige Mikroorganismen, die zu den Arten Myrothecium und Coprinus gehören, ein Enzym erzeugten, das Bilirubin oxidierte. Diese Mikroorganismen der Art Myrothecium wiesen beispielsweise Myr. verrucaria MT-1 (FERM BP 653), das neuerdings isoliert worden ist, und Artenkulturen wie Myr. verrucaria IFO 6113, IFO 6351 und IFO 9056, Myr. cinctum IFO 9950, Myr. roridum IFO 9531 usw. auf.
Diese Mikroorganismen der Art Coprinus enthalten beispielsweise Artkulturen wie Cop. cinereus IFO 8371, Cop. Lagopides IFO 30120 usw. Über Myr. verrucaria MT-1 war teilweise berichtet worden in Agric. Biol. Chem. 45, 2383, 1981.
Zur allgemeinen Herstellung dieses Enzym durch Verwenden eines Mikroorganismus der Gattung Myrothecium oder Coprinus wird der Mikroorganismus in Art routinemäßiger Tauchkultur kultiviert und das Filtrat der kultivierten Brühe durch Beigabe von Ammoniumsulfat ausgesalzen. Die so gewonnenen Abscheidungen werden in dionisiertem Wasser gelöst, wobei die Lösung dann dialysiert wird. Die innere Dialyselösung wird mit aktivierter Holzkohle entfärbt und der Chromatographie unterzogen. Seine aktiven, gesammelten Fraktionen werden lyophilisiert, um ein pulveriges Produkt zu erhalten. Beim Analysieren durch Scheibenelektrophorese hatte sich gezeigt, daß das Enzymprotein ein einzelnes Band lieferte das lagemäßig mit der Enzymtätigkeit zusammenfiel.
Die so erhaltene Enzymgewinnung wurde als Bilirubin-Oxidase erkannt. Das Bilirubin zu Biliverdin (C₃₃H₃₄N₄O₆) oxidierte durch einen Elektronakzeptor von molekularem Sauerstoff.
Das Enzym ist auch nicht durch Ausbildung von Wasserstoffperoxid im Laufe der Oxidation gekennzeichnet. Die enzymologischen Eigenschaften der Bilirubin-Oxidase werden noch dadurch beschrieben werden, das die anderen Werte in Parentesen diese Enzyme der Art Coprinusursprungs darstellen.
  •  1. Substrat-Besonderheit: Außer Bilirubin wirkt das Enzym an Chlorophyllin und Hemin, aber nicht an Hemoglobin, Chlorophyll und Vitamin B₁₂,
  •  2. Temperaturstabilität: Mehr als 90% Aktivität wird bei 50°C gehalten, während 100% Aktivität bei 70°C verloren geht,
  •  3. Optimale Temperatur: 40°C (30°C),
  •  4. pH-Stabilität: pH 6 bis 10 (pH 5 bis 9),
  •  5. optimaler pH-Wert: pH 8,
  •  6. Molekulargewicht: etwa 52 000,
  •  7. Isoelektrischer Punkt: 4,1 (3,8),
  •  8. Effekt der Metallionen: Fühlbar gehemmt durch Fe++, aber nicht von anderen Metallionen beeinträchtigt,
  •  9. Inhibitoren: Kalium-zyanid und Thiourea,
  • 10. Absorption von sichtbarem Licht: 1% Enzym-Lösung zeigt keine Absorption in der Nähe von 375 und 460 mm,
  • 11. Zuckergehalt: etwa 7,8% als Glukose; und
  • 12. Kupfegehalt: 1 Mol Kupfer pro 1 Mol Enzym.
Die Erfindung soll nachfolgend erläutert werden.
Fig. 1 zeigt die Eichkurve, die beim Beispiel 1 erhalten wird, das noch erläutert werden wird. Diese Kurve zeigt die Beziehung zwischen der Bilirubin-Konzentration und Absorptionsfähigkeit (Abnahme).
Bilirubin ist im freien Zustand in biologischen Flüssigkeiten nicht zwingend vorhanden, aber in Form von sogenannten konjugiertem Bilirubin (d. h. Bilirubin kombiniert mit Glukuronsäure, schwefliger Säure, Salzsäure od. dgl.) oder von sogenanntem konjugiertem Bilirubin (d. h. Bilirubin kombiniert mit Albumin).
Es wird gesagt, daß konjugiertes Bilirubin in Fällen von Leberzellenläsion, hepatitischem Ikterus, posthe­ patitischem Ikterus und dergl. zunimmt, während un­ konjugiertes Bilirubin in Fällen von Leberdysfunktion und dergl. ansteigt. Deshalb wird es als notwendig er­ achtet, sowohl konjugiertes als auch unkonjugiertes Bilirubin hinsichtlich der klinischen Medizin unterschiedlich zu bestimmen. (siehe Clinical Biochemistry: Principles and Methods, 2, 1372, 1978)
Das unterschiedliche Bestimmen von Bilirubin wurde bisher mit einem chemischen Verfahren durchgeführt, bei dem Bilirubin mit einem Diazo-Reagens reagiert wurde, um Azobilirubin zu erhalten, dessen purpurrote oder dunkel­ blaue Färbung dann kolorimetrisch bestimmt wird (Scand J. Clin. Lab. Invetst, Suppl 56, 80 (1961); J. Biol. Chem. 119, 481, 1937). Das Verfahren besitzt jedoch die Nachteile, daß mühsame Operationen notwendig sind und es ungenau ist.
Es wurde erkannt, daß die Reaktivität von Bilirubin- Oxidase wie auch von Lakkase mit Bilirubin sich in biologischen Flüssigkeiten befindet und daß diese Enzyme bei alleiniger Verwendung hauptsächlich auf kon­ jugiertes Bilirubin einwirken können, während sie keine oder nur eine geringe Wirkung auf unkonjugiertes Bili­ rubin besitzen. Insbesondere besitzt Bilirubin-Oxidase, der Gattung Myrothecium keine Wirkung auf unkonjugiertes Bilirubin, während Bilirubin-Oxidase der Gattung Coprinus und Lakkase eine geringe Wirkung auf unkonju­ giertes Bilirubin aufweist.
Andererseits ist festgestellt worden, daß bei der Durchführung der Reaktion der Bilirubin-Oxidase der Gattung Myrothecium auf Bilirubin in einer biologischen Flüssigkeit bei Vorliegen von mindestens einem aus aktiven Oberflächenwirk­ stoffen, aromatischen Karbonsäuren, Sulfa-Drogen und Proteasen gewählten Zusätzen diese Bilirubin-Oxidase nicht nur auf konjugiertes Bilirubin sondern auch auf nicht konjugiertes Bilirubin einwirken kann, viel­ leicht, weil die Bindung zwischen Albumin und Bili­ rubin im unkonjugiertem Bilirubin geschwächt werden würde.
Hinsichtlich der erwähnten Ergebnisse hat es sich gezeigt, daß konjugiertes Bilirubin, das sich in einer biologischen Flüssigkeit befindet, durch die Verwendung von Bilirubin-Oxidase, die von einem Mikro­ organismus der Gattung Myrothecium allein gewonnen worden wird während totales Bilirubin, das die Summe von konjugiertem und nicht konjugiertem Bilirubin ist, die beide sich in der biologischen Flüssigkeit befinden, durch die Verwendung von Bilirubin-Oxidasen oder Lakkasen zusammen mit dem genannten Zusatz bestimmt werden kann. Der Pegel des unkonjugiertem Bilirubin kann leicht durch Subtraktion des ersteren vom letzte­ ren errechnet werden.
Das vorliegende Verfahren der differentiellen Bestim­ mung von Bilirubin in biologischen Flüssigkeiten wird, wie folgt, besonders erläutert: Zunächst wird im we­ sentlichen in derselben Weise wie beim chemischen Ver­ fahren mit Verwendung eines Diazo-Reagens jede von wäßrigen Lösungen von kommerziell erhältlichen kristallinen Bilirubin mit sich verändernden Konzentrationen mit Bilirubin-Oxidase reagiert, das durch einen Mikroorga­ nismus der Art Myrothecium gewonnen worden ist. Für jede sich ergebende Reaktionsmischung wird die Abnahme der Absorption bei der Wellenlänge von 440 mm oder die Zunahme der Absorption bei einer Wellenlänge von 330 und 380 mm gemessen. Die gemessenen Werte werden gegen entsprechende Konzentrationen der Bilirubinlösungen gesetzt, um eine sogenannte Eichkurve zu erhalten, die die Beziehung zwischen diesen darstellt. Dann wird eine Probe einer biologischen Flüssigkeit mit einer unbe­ kannten Bilirubinkonzentration mit dem Bilirubin-Oxidase reagiert, das von einem Mikroorganismus der Gattung Myrothe­ cium gewonnen worden ist, und es wird die Abnahme oder Zunahme der sich ergebenden Reaktionskurve gemessen. Die konjugierte Bilirubinkonzentration in der Probe kann durch Vergleich des gemessenen Wertes mit der Eichkurve errechnet werden.
Dieselben Verfahren werden durchgeführt, mit Ausnahme, daß eine Bilirubin-Oxidase oder Lakkase zusammen mit dem Zusatz an Stelle von nur Bilirubin-Oxidase verwendet wird, die von einem Mikroorganismus der Art Morothecium gewon­ nen worden ist. Die Eichkurve ist somit ähnlich aufge­ baut und die gesamte Bilirubinkonzentration in der Probe kann dann aus dem gemessenen Werte der Absorption und der Eichkurve errechnet werden.
Besondere Beispiele von Additiven enthalten aktive Oberflächen­ agense wie sukrosefettige saure Estere, Natrium-Cholat, taurocholische Säure, Natriumdodecyl-Sulfat, p-toluene­ sulfonische Säure, Zetyl-Pyridiumchlorid, Monylphenol­ ethoxylat und Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Kondensat, aromatische carboxylische Säuren wie salicylische Säure und sulfosalicylische Säure, Sulfa-Drogen wie Sulfanil­ amide und das Natriumsalz des Acetosulfamins (= Natrium-p-Amino­ benzolsulfonacetamid) Protease wie Pronase P (Warenzeichen der Fa. Kaken Chemical Co.) enthalten. Unter diesen Verbindungen werden Natrium-Cholat, taurocholische Säure, Natrium-Dodezyl-Sulfat, p-toluene­ sulfonische Säure, salicylische Säure und sulfosalicylische Säure bevorzugt. Beim Verfahren zum differentiellen Be­ stimmen von Bilirubin nach der Erfindung können ferner Puffer, Enzymstabilisatoren und dergl. verwendet werden, wenn dies notwendig ist.
Die Bilirubin-Oxidase-Menge zum Verwenden beim Verfahren zum differen­ tiellen Bestimmen von Bilirubin ist das, daß seine Konzentration in der Raktionsmischung gleich 0,003 bis 0,40 U/ml für Bilirubin-Oxidase, ausgedrückt durch die Bili­ rubin-Oxidaseaktivität, dessen Definition noch angegeben werden wird. Die Mengen der Additiven sind wie folgt: Beispielsweise wird Natrium Dodecylsulfat in einer sol­ chen Menge verwendet, daß sich eine Konzentration von 0,5 bis 10 mM in der Reaktionsmischung ergibt. Natrium- Cholat wird in einer solchen Menge verwendet, daß sich eine Konzentration von 2 bis 30 mM in der Reaktionsmi­ schung ergibt.
Die Einheit des Bilirubin-Oxidase-Aktivität wird wie folgt angegeben: Fünf mg Bilirubin-Kristalle werden in 250 ml einer 0,2 M tris-HC1-Pufferlösung (PH 8,4) mit Ethylenediaminetetraazetät-Säure (1 mM) gelöst. Ein 2 ml-Teil dieser Lösung wird mit 0,2 ml der Enzymlösung gemischt. Diese Mischung wird bei 37°C bebrütet und seine Absorptionsabnahme bei 440 nm wird dann gemessen. Die Enzymmenge, die 1 mikromole Bili­ rubin pro Minute oxidiert, wird als eine Einheit definiert.
Die Erfindung wird ferner durch folgende Beispiele erläutert. Diese dienen jedoch nicht zum Beschrän­ ken des Umfangs der Erfindung.
Beispiel 1 (Bestimmen von konjugiertem Bilirubin)
Jeder wäßrigen Lösung von 0,1 ml von 0, 2,5, 5,0, 7,5 10,0 15,0 und 20,0 mg% Bilirubin (Kristalle) wurden 3 ml einer 0,1 tris-HC1-Pufferlösung (pH 8,4) mit Bilirubin-Oxidase der Myrothecium-Gattung (0,1 U/ml) zugesetzt. Die sich ergebenden Mischungen wurden bei 37°C 30 Minuten lang bebrütet und die Abnahme ihrer Absorptionsfähigkeit wurde gemessen. Die gemessenen Werte wurden gegen die jeweiligen Konzentrationen der Bilirubinlösungen eingesetzt, um eine Eichkurve zu erhalten (Fig. 1).
Dann wurde eine Probe von Blutserum von 0,1 ml mit unbekannter Bilirubinkonzentration (fällt in den Bereich von 0 bis 20 mg% und danach dasselbe) in der beschriebenen Weise reagiert und die Absorptionsfähigkeits­ abnahme der sich ergebenden Reaktionsmischung wurde ge­ messen. Durch Vergleich des Wertes mit der Eichkurve nach Fig. 1 wurde der gemessene Wert mit der Eich­ kurve gemessen und die Bilirubinkonzentration im Bei­ spiel zu 2,8 mg% errechnet.
Beispiel 2 (Bestimmen des gesamten Bilirubins)
Jeder wäßrigen Lösung von 0,1 ml aus 0, 2,5 5,0, 7,5, 10,0, 15,0 und 20,0 mg% Bilirubins (Kristallen) wurden 3 ml einer Bilirubin-Oxidase der Gattung Myrothecium (0,1 µ/ml) enthaltenden und Natrium Cholat (14 mM) - enthaltenden Pufferlösung zugesetzt. Die sich ergebenden Mischungen wurden bei 37°C 30 Minuten lang bebrütet und ihre Absorptionsfähigkeits­ abnahme wurde bei 440 nm gemessen. Die gemessenen Werte wurden gegen die jeweiligen Konzentrationen der Bilirubinlösungen eingesetzt, wodurch eine der Fig. 1 gleichen Eichkurve erhalten wurde.
Dann wurde eine Blutserumprobe mit einer unbekannten Bilirubinkonzentration in der beschriebenen Weise reagiert und die Absorptionsfähigkeitsabnahme der sich ergebenden Reaktionsmischung gemessen. Durch Vergleich des gemessenen Wertes mit der Eichkurve nach Fig. 1 wurde die (gesamte) Bilirubinkonzentration in der Probe zu 5,2 mg% errechnet.
Beispiel 3 (Bestimmen des Gesamtbilirubins)
Das Verfahren nach Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß Bilirubin-Oxidase von Coprinus- Ursprung (3 mU/ml), Lakkase mit Polyporus-Ursprung (0,1 mU/ml) oder Lakkase aus einer Lackfabrik (1 mU/ml) an Stelle von Bilirubin-Oxidase der Myrothecium- Gattung verwendet werden. Es wurde in allen Fällen eine Eichkurve ähnlich der nach Fig. 1 erhalten. Die Menge des gesamten Bilirubins in der Blutserum­ probe wurde auf 5,3 mg% bzw. 5,1 mg% geschätzt.
Beispiel 4
Es wurde die Wirkung von Bilirubin-Oxydase, die von einem Mikroorganismus der Gattung Myrothecium stammt, auf verschiedene Bilirubintypen untersucht. Kristallines Bilirubin wurde als nicht kombiniertes Bilirubin und "Bilirubin-Control" als konjugiertesds Bilirubin verwendet. Das zur Anwendung kommende konjugierte Bilirubin war von den Erfindern wie folgt hergestellt worden: 10 ml Hundegalle wurden mit dem doppelten Volumen Chloroform extrahiert. Die erhaltene wäßrige Schicht wurde konzentriert und dann einer (Sephadex G-25) Gel-Filtration unterzogen, wodurch eine gereinigte Substanz erhalten wurde. Diese wurde nach dem Diazo-Verfahren untersucht mit dem Bilirubin-B Test "Wako" und es wurde kein unkonjugiertes Bilirubin festgestellt.
Reaktionsmischungen bestehend aus einer Reagenzverbindung für die quantitative Bestimmung von Bilirubin (mit 3 ml einer 0,1 M HCL Pufferlösung mit 0,3 Einheiten Bilirubin-Oxydase NS-1) und 100 µl jeweils mit Bilirubinslösung unterschiedlicher Konzentration wurden auf 37°C für 30 Minuten erwärmt. Dann wurde die Absorptionsabnahme bei 440 nm gemessen.
Die Ergebnisse sind in der Fig. 2 gezeigt.
In dieser Figur bedeutet (-○-) nicht unkonjugiertes Bilirubin, (-⚫-) nicht kombiniertes Bilirubin und (-▲-) konjugiertes Bilirubin.
Wien sich aus dieser Figur ergibt, wirkt die Bilirubin-Oxydase NS-1 wenig auf unkonjugiertes Bilirubin, andererseits aber auf konjugiertes und nicht kombiniertes Bilirubin und gibt eine gute Linearität.
Beispiel 5
Die Reaktionsfähigkeit von Bilirubin-Oxydase, die von einem Mikroorganismus der Gattung Myrothecium stammt, auf unkonjugiertes Bilirubin wurde untersucht in Anwesenheit von Zusätzen.
Reaktionsmischungen mit der unten angegebenen Zusammensetzung wurden auf 37°C erwärmt. Die resultierende Abnahme der Absorption bei 440 nm wurde 3 Minuten nach dem Reaktionsbeginn bestimmt und die berichtigten Werte, die die Abnahme pro Minute zeigen, wurde errechnet. Die Ergebnisse, die sich dabei zeigten, sind in Tabelle I aufgeführt. Das als Substrat benutzte unkonjugierte Bilirubin war wiederum "Bilirubin-Control" (DADE Diagnostics Inc.).
0.1 M tris-HCl Pufferlösung (pH 8.4)|3 ml
Bilirubin Control (20 mg/dl) 20 µl
Bilirubin-Oxydase (15 U/ml) 20 µl
Zusätze (10% wäßrige Lösung, 0.1% wäßrige Lösung für Pronase P.) 50 µl
Zusätze
O.D./min.
Keine
0.0006
Sukrose fettsäure estar 0.003
Natrium-Cholat 0.025
Taurocholsäure 0.010
Natriumdodecyl-Sulfat 0.055
p-Toluonsäure 0.013
Adecatol N-p-100 0.003
Adecatol N-p-700 0.004
Sulfanilamid 0.003
Polyoxäthylen 0.002
Pluronic F88 0.004
Cetyl-Pyridiniumchlorid 0.002
Salicylsäure 0.024
Sulfosalicylsäure 0.018
Pronase P 0.002
Lauryl Pyridiniumchlorid 0.002
Cetyl Trimethylammoniumbromid 0.002
Natriumaccetosulfamin 0.003

Claims (3)

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung des konjugierten Bilirubins in biologischen Flüssigkeiten, gekennzeichnet durch die Kombination der folgenden Verfahrensschritte:
  • a) Reagierenlassen von wäßrigen Lösungen von Bilirubin unterschiedlicher Konzentrationen mit Bilirubin-Oxydase, die von einem Mikroorganismus der Gattung Myrothecium stammt, zum Erstellen einer Eichkurve, welche die Beziehung zwischen der Absorptionsfähigkeit der Reaktionsmischung und der Konzentration des Bilirubins wiedergibt;
  • b) Reagierenlassen einer biologischen Flüssigkeit unbekannter Bililrubinkonzentration mit der Oxydase, die von einem Mikroorganismus der Gattung Myrothecium stammt, und Messen der photometrischen Absorptionsfähigkeit der sich ergebenden Reaktionsmischung; und
  • c) Ermitteln der Bilirubinkonzentration in der biologischen Flüssigkeit durch Vergleichen des in b) gemessenen Wertes mit denen der Eichkurve.
2. Verfahren zur quantitativen Bestimmung des gesamten Bilirubins in biologischen Flüssigkeiten, gekennzeichnet durch die Kombination der folgenden Verfahrensschritte:
  • a) Reagierenlassen jeder wäßrigen Lösung von Bilirubin unterschiedlicher Konzentrationen mit Bilirubin-Oxydase, die von einem Mikroorganismus der Gattung Myrothecium oder Coprinus stammt, in Gegenwart von zumindest einem Additiv aus der Gruppe oberflächenaktiver Mittel, aromatischer Carbonsäuren, Sulfonamide und Proteasen zum Erstellen einer Eichkurve, welche die Beziehung zwischen der Absorptionsfähigkeit der Reaktionsmischung und der Bilirubinkonzentration wiedergibt;
  • b) Reagierenlassen einer biologischen Flüssigkeit unbekannter Bilirubinkonzentration mit der Bilirubin-Oxydase, die von einem Mikroorganismus der Gattung Myrothecium oder Coprinus stammt in Gegenwart genannter Additive und Messen der Absorptionsfähigkeit der sich ergebenden Reaktionsmischung und
  • c) Ermitteln der Bilirubinkonzentration in der biologischen Flüssigkeit durch Vergleichen der in b) gemessenen Werte mit denen der Eichkurve.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Additiv zumindest aus einer Verbindung aus der Gruppe Natriumcholat, Taurocholsäure, Natriumdodecylsulfat, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und Sulfosalicylsäure besteht.
DE19823239236 1982-02-18 1982-10-20 Verfahren zur quantitativen bestimmung von physiologischen komponenten in biologischen fluessigkeiten oder gasen Granted DE3239236A1 (de)

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