DE1129003B

DE1129003B - Diagnostiziermittel zum Nachweis von Glukose in Fluessigkeiten

Info

Publication number: DE1129003B
Application number: DEM36364A
Authority: DE
Inventors: Marion Helen Cook
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1957-01-08
Filing date: 1958-01-08
Publication date: 1962-05-03
Also published as: US2893844A; FR1198419A; CH368328A; BE563751A; NL98884C; GB880526A

Description

In der Hauptpatentanmeldung M 30739 IX b/421 ist ein Diagnostiziermittel beschrieben, mit dem sich die Glukose in Körperflüssigkeiten, wie Urin oder Blut, bestimmen läßt. Es besteht aus einem saugfähigen Träger, der ein Enzym, das Oxydaseaktivität für Glukose aufweist, und einen Indikator enthält, der in Gegenwart eines Reaktionsproduktes, das sich bei der Berührung des Enzyms mit der Glukose bildet, eine Farbreaktion gibt.

Es hat sich nun gezeigt, daß man dieses Diagnostiziermittel vorteilhaft dadurch weiter ausgestalten kann, daß es zusätzlich eine reduzierend wirkende Verbindung enthält.

Das erfindungsgemäße Diagnostiziermittel hat den Vorteil, daß es zur Anzeige nur solcher Blutzuckerwerte eingestellt werden kann, die ihrer Natur nach gefährlich sind, d. h. die Anzeichen eines abnormen Blutzuckerspiegels sind.

Das Diagnostiziermittel besteht beispielsweise aus Glukose-Oxydase, Peroxydase, einem Indikator, dessen Farbe bei Gegenwart von Peroxydase durch Wasserstoffsuperoxyd sich ändert, einem Puffer, der bei der Reaktion einen bestimmten pH-Bereich einzuhalten vermag, einem Stabilisierungsmittel, wie Gelatine, sowie einer reduzierenden bzw. antagonistisch wirkenden Substanz. Diese Substanz ist eine reduzierende Verbindung, z. B. Hydrochinon, und hindert den Indikator daran, auf Glukosemengen zu reagieren, die unterhalb eines vorher festgesetzten Blutzuckerspiegels liegen.

Die Zubereitung kann man als Suspension oder als Lösung herstellen und damit ein saugfähiges Material beliebiger Gestalt wie Papier, Holz, Faserstoffe od. dgl. imprägnieren.

Man kann die Zubereitung unter Verwendung von Gelatine oder einer ähnlichen Haftsubstanz auch auf Glas, Metall oder Kunststoff aufbringen.

Die Zubereitung kann auch in Tablettenform gebracht werden. Man kann dann z. B. ein oder zwei Tropfen verdächtiges Blut auf die Oberfläche einer solchen Tablette bringen, sie dort lange genug belassen, daß eine Reaktion stattfinden kann, das Blut danach entfernen und dann beobachten, ob eine Farbänderung eingetreten ist.

Diagnostiziermittel zum Nachweis von
Glukose in Flüssigkeiten

Zusatz zur Patentanmeldung M 30739IX b/421
(Auslegeschrift 1 075 869)

Anmelder:

Miles Laboratories, Inc.,
Elkhart, Ind. (V. St. A.)

Vertreter: Dr.-Ing. F. Wuesthoff, Dipl.-Ing. G. Puls und Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. E. Frhr. v. Pechmann, Patentanwälte, München 9, Schweigerstr. 2

Beanspruchte Priorität:
V. St. v. Amerika vom 8. Januar 1957 (Nr. 632 969)

Marion Helen Cook, Elkhart, Ind. (V. St. A.),
ist als Erfinder genannt worden

Beispiel 1
5 mg Peroxydase,
200 mg Glukose-Oxydase,
100 mg o-Tolidindihydrochlorid,
200 mg Gelatine,

2000 mg feste Puffersubstanz

(32 % wasserfreie Citronensäure,
68% Natriumcitrat-Dihydrat),

4 mg Hydrochinon,
20 ml Wasser.

Die Gelatine wurde in 5 ml kochendem Wasser aufgelöst, danach wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Die feste Puffersubstanz wurde in 5 ml Wasser suspendiert und mit der Gelatine vermischt, wobei sich eine klare Lösung ergab. Das o-Toluidindihydrochlorid wurde in 5 ml Wasser aufgelöst und ebenfalls der obigen Mischung zugefügt. Sofort danach wurden 2,5 ml Peroxydase und Glukose-Oxydase enthaltendes Wasser sowie 2,5 ml Hydrochinon enthaltendes Wasser zugegeben.

Diese Zubereitung wurde gut durchgemischt. Filterpapierstreifen von etwa 51 · 6 mm Größe wurden in diese Lösung getaucht und danach getrocknet.

Beispiele2 bis 4

In den folgenden Beispielen wurde die Menge der reduzierenden Verbindung, in diesem Falle Hydrochinon, von 0,03 bis 0,005% variiert. Die übrigen Bestandteile der Zubereitung sowie die Herstellung der Teststreifen war die gleiche geblieben.

209 578/150

Es wurden Lösungen hergestellt, die 100* 150, 200, 300 und 500 mg Zucker je 100 ml Hundeblut enthielten. In der Tabelle I sind die Versuchsergebnisse dieser Reihenbestimmungen zusammengestellt.

Tabelle I Tabelle II

Hydrochinon	Beispiel	\ 0	Milligramm Glukose	je 100 ml Blut	200	300	500
in der Zubereitung		;_!_		150		₊	₊
Vo	4	. 0	100		-f	-j-	4-
0,005	1	0	₊.	Sp.	Sp.	-ί-	+
0,020	2	0	0	0	0	0	0
0,030	3	0	0
0,040		0

Erklärung:

+ = positiv.

0 = negativ.

Sp. = Spuren.

Erhöht man die Mengen der antagonistisch wirkenden Substanzen, so wird der Blutzuckerspiegel, bei dem man einen positiven Test erhält, in entsprechender Weise angehoben. Das Beispiel 4, bei dem 0,005% Hydrochinon vorhanden waren, ergab für sämtliche Glukosekonzentrationen einen positiven Wert. Beispiel 3, das 0,040% antagonistische Substanz enthielt, ergab bei allen Glukosekonzentrationen einen negativen Test. Beispiel 2 jedoch, mit 0,030% antagonistischer Substanz, ergab einen positiven Test bei der Blutprobe, die 300 mg Zucker je 100 cm³ Blut enthielt. Ebenfalls ein positiver Test wurde bei der Blutprobe erhalten, die 500 mg Zucker je 100 cm³ Blut enthielt. Im Beispiel 1 mit 0,020% Antagonist wurde ein positiver Test erhalten bei 150 mg Zucker je 100 cm³ Blut. Man kann also durch genaue Einstellung der Menge der reduzierenden Substanz den Glukosewert einstellen, bei dem ein positiver Wert erhalten wird.

Aus den oben gegebenen Beispielen kann man ersehen, daß die Menge an Hydrochinon, im Bereich von etwa 0,005 bis 0,04^fl/o gewählt werden soll. Es ist selbstverständlich, daß man von anderen ähnlich wirkenden Substanzen andere Mengen nehmen muß, um den gewünschten Effekt zu bewirken.

Beispiel 5

5 mg Peroxydase,
240 mg Glukose-Oxydase,
50 mg o-Tolidinhydrochlorid, 240 mg Gelatine,

2 mg feste Puffersubstanz

(18,5 % wasserfreie Citronensäure, 81,5% Natriumcitrat-Dihydrat), 100 mg Algin,
20 ml Wasser.

Unter Verwendung verschiedener Mengen antagonistisch wirkender Substanzen wurden nach dem im Beispiel 1 in seinen Einzelheiten beschriebenen Verfahren Teststreifen präpariert. Diese Probestreifen wurden verwendet, um die Grenzwerte für den Blutzuckerspiegel zu bestimmen, bei denen man stets einen positiven Test bzw. stets einen negativen Wert erhielt.

Die in diesen Versuchsreihen verwendeten antagonistischen Substanzen waren Ascorbinsäure, Cysteinhydrochlorid und Dihydroxymaleinsäure.

	Weniger als	Mehr als	immer positiv
Antagonist	Milligramm Glukose
	je 100 mg Blut	70
β/ο	immer negativ	100
Ascorbinsäure		160
ίο 0,002	40	300
0,010	70
0,030	130	40
0,050	200	80
Cysteinhydrochlorid		90
15 0,013	25	100
0,025	60	140
0,038	70	150
0,050	80	200
0,065	90	300
2o 0,075	90	450
0,100	140	900
0,125	180
0,150	200
0,200	300	60
^a5 Dihydroxymalein		75
säure		150
0,125	40	160
0,250	50	240
0,500	100
3o 0,550	100
0,625	180

Man kann selbstverständlich verschiedene Bestandteile der Testzubereitungen abändern. So kann z. B. die Indikatormenge zwischen etwa 30 und etwa 200 Teilen variieren und der Peroxydasegehalt z. B. zwischen etwa 1 und etwa 100 Teilen. Glukose-Oxydase kann man zwischen etwa 25 und etwa 500 Teilen im Ansatz verwenden, und Gelatine, Algin oder ein ähnliches Stabilisierungsmittel kann im Bereich von 0 bis zu etwa 1000 Teilen vorhanden sein. Für gewöhnlich verwendet man allerdings vorzugsweise etwa 50 bis etwa 500 Teile Gelatine oder ähnliche Substanzen.

Der p_H-Wert der Zubereitung soll etwa im Bereich von 4 bis 6, vorzugsweise bei etwa 5 liegen.

Die in den Beispielen verwendete Peroxydase wurde aus Meerrettich gewonnen; ihre Aktivität war etwa von derselben Größenordnung wie die Aktivität des Bluthämoglobins, das auch an ihrer Stelle verwendet werden kann.

Es ist anzunehmen, daß die antagonistisch wirkende Verbindung mit dem beim Reduktionsvorgang in Freiheit gesetzten Wasserstoffsuperoxyd reagiert.

Bis also die antagonistische Zubereitung vollständig reduziert ist, wird das bei der enzymatischen Reaktion mit der vorhandenen Glukose gebildete Wasserstoffsuperoxyd vorzugsweise mit der reduzierenden Verbindung reagieren, ehe eine Umsetzung mit der Peroxydase und dem Indikator unter Bildung der gewünschten Farbe eintritt. Auch andere reduzierende Stoffe können für die vorliegende Erfindung verwendet werden, z. B. Dihydroxymaleinsäure, Sulfydrylverbindungen, Natriumsulfit, Natriumhydrosulfit, Äthylenglykol, Resorcin, Catechin, Kaliumnitrit, Natriumnitrit.

Auch in dem Mengenverhältnis von Glukose-Oxydase und Peroxydase ist eine große Variations-

breite möglich. So kann z. B. der Gehalt an Glukose-Oxydase bis auf das Hundertfache der beschriebenen Mengen erhöht oder bis auf ein Zehntel der beschriebenen Menge verringert werden, ohne daß das Funktionieren des Diagnostiziermittels beeinträchtigt wird. Es ist allerdings nötig, daß genügend Oxydase vorhanden ist, um die Oxydation der Glukose zu katalysieren und daß genügend Peroxydase vorhanden ist, daß diese ihre Enzymaktivität ausüben kann.

Claims

Patentansprüche:

1. Diagnostiziennittel zum Nachweis von Glukose in Flüssigkeiten, insbesondere Urin, nach

der Hauptpatentanmeldung M 30739 IXb/421, bestehend aus einem saugfähigen Träger, der ein Enzym, das Oxydaseaktivität für Glukose aufweist, und einen Indikator enthält, der in Gegenwart eines Reaktionsproduktes, das sich bei der Berührung des Enzyms mit Glukose bildet, eine Farbreaktion gibt, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich eine reduzierend wirkende Verbindung enthält.

2. Diagnostiziennittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als reduzierend wirkende Verbindung Hydrochinon, Ascorbinsäure, Cysteinhydrochlorid oder Dihydroxymaleinsäure enthält.