DE1598809B2

DE1598809B2 - Diagnostiziermittel fuer glukose in fluessigkeiten

Info

Publication number: DE1598809B2
Application number: DE19661598809
Authority: DE
Inventors: Joseph Wilfred Elkhart Ind.; Atkinson Roger Lee Three Rivers Mich.; Fräser (V.St.A.)
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1965-08-02
Filing date: 1966-08-02
Publication date: 1973-03-15
Also published as: CH476999A; SE329511B; US3453180A; NL6610864A; DE1598809A1; DE1598809C3; BR6681737D0; GB1144600A; BE684941A; NL126573C

Description

Der Nachweis von Glukose in Körperfiüssigkeiten, wie Urin und Blut, ist ebenso wie die quantitative Bestimmung in diesen von großer Bedeutung für Diabetiker, die ihre Diät hinsichtlich ihrer Zudereinnahri.e kontrollieren und in dieser Hinsicht häufig überwacht werden müssen durch eine regelmäßige Kontrolle des Glukosegehaltes in ihren Körperflüssigkeiten Ein Mittel für qualitative und quantitative Glukosebestimmungen soll ebenso benutzt werden können Tür Routineanalysen von Körperflüssigkeiten in Krankenhäusern und bei praktizierenden Ärzten, bei Programmen zur Frfassung der Diabetes sowie zur Unterscheidung der Glukose von anderem Zucker U- dgl.

Da die Frühdiagnose und fortgesetzte Kontrolle bei Diabetes sehr wichtig ist, muß ein für den Kliniker geeigneter Glukosetest möglichst schnell und einfach und genügend empfindlich sein, um Unterschiede in der Verfassung des Patienten wiederzugeben.

Diagnostiziermittel für Glukose in Flüssigkeiten, die auf einem saugfähigen Träger ein Enzym mit Glukoseoxydase-Aktivität, eine Substanz mit Peroxydase-Aktivität einen Puffer sowie einen Farbindikator enthalten, sind bekannt (deutsche Patentschrift 1 075 869, 1 121 848 und 1 171 847). Die Reaktionen beim enzymatischen Nachweis von Glukose sind bekannt. GIukoseoxydase katalysiert die aerobe Oxydation der Glukose unter bildung von Glukonsäure und Wasser-Stoffperoxid. Eine Verbindung mit Peroxydase-Aktivität ist dann in der Lage, die Oxydation eines Indikators, wie z. B. o-Tolidin-dihydrochlorid, in Gegenwart des von der Glukoseoxydase gebildeten Wasserstoffperoxids herbeizuführen. Die Menge an oxydiertem Indikator und die dementsprechend resultierende Farbstärke steht in direkter Beziehung zu der in der untersuchten Probe vorhandenen Glukosemenge.

In der USA.-Patentschrift 3 123 443 ist ein Diagnostiziermittel beschrieben, das bisher zum Nachweis eier Glukose in Flüssigkeiten, wie Urin, benutzt wurde. Es enthielt ein saugfähiges Material, das mit einem Reagenzgemisch getränkt war. Die Tränklösung enthielt Glukoseoxydase, Peroxydase, o-Tolidin-dihydrochlorid als Indikator, einen Zitronensäure/Natrium- 6^ citrat-Puffer, Natriumalginat-Gclatine und Polyoxyäthylen-sorbitylmonooleat als oberflächcnaktivus Mit-Gegenstand eines älteren Patents (deutsche Patentschrift f 272 019) ist ferner bereits ein Diagnostiziermittel, welches Glukoseoxydase, Peroxydase, ein Puffersystem, einen Farbindikator sowie Polyvinylpyrrolidon und ein Derivat eines Mischpolymerisats von Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid, das sich von der Säureform oder der Teilesterform ableiten kann, enthiilt.

Zwar stellen die oben beschriebenen Reagenzgemische für das Diagnosliziermittcl einen deutlichen Fortschritt dar, doch weisen sie einige Nachteile Ki der Herstellung und Anwendung auf. Sie waren in dem zur Herstellung der Tränklösung benutzten wäürigen Alkohollösungsmittel nicht vollständig löslich, und wenn ein saugfähiges Material mit diesen Lösungen getränkt und dann getrocknet wu:..e, so führte dies k-icht /u Diagnostiziermitteln, die einen kleine;. Anteil sichtbarer einzelner Teilchen an der OK. flücK· aufwiesen. Wegen der damit vorhandene; Ungenauigkeit .>ei der Beurteilung der gebildete! Farbe sind solche Teilchen unerwünscht. Wird dir Reagenzlösung auf ein saugfähiges Material mitu-; eines Mundstückes mit kleinem Durchmesser g<bracht, -o neigen die ungelösten Feststoffteilche . ferner da/u, die öffnung zu verstopfen und Kein trachtigen damit eine gute Anwendung des Reagenz gemisches. Das frühere Diagnostiziermittel gem..κ der ISA.-Patentschrift 3 121443 ermöglichte ferne. keine ausreichende l'nters-heidung der von den: Indikator gebildeten larbtiefe. um die gewünscht·: genaue Feststellung von Glukosemengen bei geringen Glukosekonzentrationen zu ermöglichen.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Diagnostiziermittel herzustellen, dessen Oberfläche frei ist von sichtbaren einzelnen leuchen und das außerdem im Vergleich zu früheren Reagenzien verbesserte Bestimmungscharakteristika aufweist. Diese Aufgabe wird durch die im Patentanspruch angegebene Erfindung gelöst.

Die zur Herstellung des erfindungsgemäßen Diagnostiziermittels benutzte Glukoseoxydase ist eine flüssige Glukoseoxydase, die im wesentlichen frei ist von Katalase. Die flüssige Glukoseoxydase wird zweckmäßig in einer Form verwendet, die etwa 1000 Glukoseoxydasecinheiten pro Milliliter flüssige Glukoseoxydase enthält. Die GluKoseoxydaseeinheit ist dem F.nzymchemikcr bekannt und definiert als die Menge an Glukoseoxydase, die die Oxydation eines Glukosesubstrates mit 3,3 Gewichtsprozent Glukosemonohydrat, mit 10 ⁶I Sauerstoff pro Minute bei 35 C. einem pH-Wert von 5,1 und nach einer Zeitdauer von 15 Minuten katalysiert. Neben dem genannten Glukoseoxydasepräparat kann auch jedes andere flüssige Enzymsystem, das Glukoseoxydaseaktivität besitzt, bei der dargelegten Erfindung benutzt werden.

Als Substanzen mi' peroxydativer Wirkung können bei der vorliegenden Erfindung verschiedene organische und anorganische Stoffe benutzt werden, z. B. pflanzliche Pcroxydasen, wie Meerrettich-Peroxydase und Kartoffel-Peroxydase, aber auch kleinere Mengen an Stoffen, die eine geringe Tönung oder einen definierten, vorher bestimmbaren Farbuntergrund besitzen, wie normales Gesamtblut, rote Blutkörperchen, lyophilisiertcs Gesamtblut und ähnliche Substanzen mit Oxyaasewirkung. Auch anorganische Verbindungen mit Peroxydasewirkung können Verwendung finden, wie z. B. Mischungen aus Kaliumiodid und

Natriummolybdat oder andere Jodide, wie Natrii'mend Ammoniurnjodide bzw. andere Molybdate, wie Natrium- und Ammoniun!molybdate. Darüber hinaus können Urohemin und eine Anzahl anderer Porphyrin-Verbindungen mit Peroxydasewirkung benutzt werden. Andere Verbindungen, die keine Enzyme sind, aber Peroxydaseaktivität besitzen, sind z. B. Eisensuifocyanat, Eisentannat, Fcrri-ferrocyanid, Ka-Jiumchromsulfat u. dgl.

Bei dem Mischpolymerisat aus Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid, das als Mischungskomponente für das neue Diagnostiziermittel geeignet ist, handelt es sich um ein äquimolares Reaktionsprodukt von Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid der Formel

OCH₁

CH₂-CH-CH-CH —

I I

O = C C= O

wobei »n« eine positive Zahl darstellt mit einem Wert, der im Falle einer Lösung von 1 Gewichtspro-Eent Polymerisat in Methyläthylketon einer spezifischen Viskosität von etwa 0,1 bis 3,5 entspricht. Ein solches Mischpolymerisat ist käuflich erhältlich. Löst man das Mischpolymerisat in Wasser auf, bildet es ein Säurederivat mit der folgenden Formel

OCH₃

CH₂-CH-CH-CH

O = C

C== O

OH OH

Wird das Mischpolymerisat in Alkohol mit der Formel ROH aufgelöst, wobei R den organischen Rest darstellt, so wird ein partieller Ester mit der folgenden Formel gebildet

OCH₃

CH₂-CH-CH-CH

C=O

OH OR

Da das erfindungsgemäße Diagnostiziermittel mittels wäßriger Alkohollösungen hergestellt wird, enthält das Endprodukt entweder die Säure- oder die Teüesterform oder ein Gemisch beider.

Als Indikator wird in der vorliegenden Erfindung vorzugsweise o-Tolidin-dihydrochlorid benutzt. Dieser Indikator liefert verschiedene Blau-Farbtiefen, wenn er durch Peroxydase in Gegenwart von Wasserstoffperoxyd, das von der analysierten Glukose erhalten wird, oxydiert wird.

Das Reagenzgemihch, das bei dem vorliegenden neuen Diagnostiziermittel für Glukose in Urin benutzt wird, sollte bei einem pH-Wert von etwa 4 bis 6, vorzugsweise etwa 5, gehalten werden. Dieser pH wird durch das Zitronensäure/Natriumcilrat-Puffersystem aufrechterhalten.

Durch die Anwesenheit der oben beschriebenen Mischpolymerisate wird die Farbtiefe des oxydierten Indikators verbessert in Verbindung mit Polyvinylpyrrolidon mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 40 000, einem langkettigen Polymeren von 3,6-Anhydro-D-Galactose und sulfatisierten D-Galactoseresten. Diese Farbverstärkung ist von Wert für die Unterscheidung verschiedener Farbstärken, vor allem bei niedrigen Glukosegehalten (etwa Ί,; Gewichtsprozent). Dies ist beispielsweise besonders wichtig bei einem Glukosetest, der zur Feststellung einer A nfang?diabetes verwendet werden soll.

Das langkettige Polymerisat von 3,6-Anhydro-D-Gaiactose und sulfatisierten D-Galactoseresten ist käuflich erhältlich. Das langkettige Po'ymerisat hat ein Molekulargewicht von mehreren Hunderttausend. Um die gewünschten Lösungseigenschaften zu erhalten, wurde als oberflächenaktives Mittel das im Handel erhältliche Natriumlauroylsarcosinat zugesetzt.

Vorzugsweise wird ein Farbstoff verwendet, um Tönungen der saugfähigen Komponente zu maskieren und um eine Untergrundfarbe zu liefern, die zu der von dem Indikator gebildeten Farbe in Kontrast steht. Zweckmäßigerweise wird eine rote Untergrundfarbe hierbei angewandt als Kontrast zu den blauen Farben, die von dem o-Tolidin-dihydrochlorid bei Anwesenheit von Glukose gebildet werden. Ein solches Gemisch erzeugt ein breites Spektrum von R^t (keine Glukose anwesend) über Violett 'etwa 0,1 Gewichtsprozent Glukose) und Purpur (etwa 0,25 bis 0.5 Gewichtsprozent Glukose) zu dunklem Purpur (mehr als etwa 0,5 Gewichtsprozent Glukose). Wie schon ausgeführt, wird das neue Diagnostiziermittel hergestellt durch Tränken einer saugfal.i?en Komponente mit dem oben beschriebenen, in wäßrigem Alkohol gelösten Reagenzgemisch. Dieses Tränken kann entweder durch Eintauchen des saugfähigen Materials in die flüssige Mischung erreicht werden oder durch Aufgießen der flüssigen Mischung auf die Oberfläche des aufsaugendem Materials; das so erhaltene getränkte Material wird dann in geeigneter Weise getrocknet.

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel

näher erläutert: „ . . .

Beispiel

Zu 2,751 destilliertem Wasser bei 85 C werden 25 g eines langkettigen Polymeren aus 3,6-Anhydro-D-Galactose und sulfatisierten D-Galactoseresten hinzugefügt. Die Mischung wurde dann so lange gerührt, bis die Feststoffe sich lösten. Dann wurden 25Og Polyvinylpyrrolidon hinzugefügt mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 40 000, und die Mischung wurde erneut gerührt, bis die Feststoffanteile sich

lösten. Darauf wurde die Lösung auf 25" C herabgekühlt und 250 ml denaturierten Alkohols hinzugefügt. Durch Mischen von 0,9 g rotem Farbstoff der Nr. 14 700 im »Colour-Index« bzw. Nr. 4 im Verzeichnis der »U.S.Food, Drug and Cosmetic (FD&C)

und 2,0 g rotem Farbstoff der Nr. 45430 im »Colour-Index« bzw. Nr. 3 im Verzeichnis der FD&C in 450ml destilliertem Wasser bei Raumtemperatur wurde eine Farbstofflösung erhalten, die dann mit der obengenannten Lösung gemischt wurde, später als Lösung A bezeichnet.

Eine Indikatorlösung wurde durch Auflösen von 50 g o-Tolidin-dihydrochlorid in 550 ml destilliertem Wasser bei 95⁰C hergestellt.

Durch Lösen von 154,2 g wasserfreier Zitronensäure und 679,2 g Natriumeitrat in 2,081 destilliertem Wasser bei Raumtemperatur wurde eine Pufferlösung hergestellt, zu der dann 1,81 denaturierten Alkohols zugegeben wurden. Die alkoholische Pufferlösung wurde dann mit der Indikatorlösung gemischt, und die resultierende Lösung wurde mit der Lösung A zusammeugegeben, um das als Lösung B bezeichnete Gemisch zu ergeben.

Eine Lösung eines Mischpolymerisates wurde hergestellt durch Mischen von 75 g eines handelsüblichen Mischpolymerisats aus Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid, mit 1,51 destilliertem Wasser bei 95° C. Nach Ablauf der Reaktion zwischen Mischpolymerisat und Wasser wurde die Lösung auf 25' C gekühit und mit destilliertem Wasser auf das ursprüngliche Lösungsvolumen nachgefüllt. Diese Lösung wurde dann zu Lösung B hinzugegeben, um die Lösung C zu erhalten.

Eine Lösung eines oberflächenaktiv :n Stoffes wurde durch Mischen von 25 g Natriumlauroylsarcosinat mit 250 ml destilliertem Wasser hergestellt. Diese Lösung wurde dann zu Lösung C hinzugefügt, um die Lösung D zu erhalten. Eine Enzymlösung wurde zubereitet durch Mischen von 5 g Meerrettichperoxydase und 760 ml eines flüssigen Glukoseoxydase-Produkts mit einer Aktivität von etwa lOOQGIukoseoxydaseeinheiten pro Milliliter. Diese Enzymlösung wurde dann zur Lösung D hinzugefügt, um die Lösung E zu bilden.

Ein Streifen saugfähigen Filterpapiers wurde dann durch die Lösung E hindurchgezogen, um das Filierpapier mit dem Reagenzgemisch der Lösung E zu tränken. Dieses wurde dann bei etwa 10O⁰C 10 Minuten lang getrocknet. Das getrocknete, behandelte Testfeld des erhaltenen Streifens hatte gleichmäßige Farbe und Struktur, keine sichtbaren diskreten Teilchen an der Oberfläche und dementsprechend eine ästhetisch angenehmes Aussehen.

Das so hergestellte Diagnostiziermittel wurde dann für einen Glukosetest in Urin verwendet. Er zeigte im Vergleich zu den mit zuvor bekannten Glukosereagenzien erhaltenen Farben eine verbessern Farbdifferenzierung, besonders bei niedrigen Glukosegehalten.

Das oben hergestellte Diagnostiziermittel zeigte die gewünschte Farbreaktion auf Glukose gleichförmig über das ganze getränkte Testgebiet und erwies außerdem ein hohes Maß an Stabilität, das eine ausgedehnte Haltbarkeit gewährt.

Claims

Patentanspruch:

DiagnostiziermiUcl Für Glukose in Flüssigkeiten, enthaltend auf einem saugfähigen Trägermaterial ein Enzym mit Glukoseoxydase-Aktivität, eine Substanz mit Peroxydase-Aktivität, Zitronensäure/Natriumcitrat-Puffer, o-Tolidindihydrochlorid, Polyvinylpyrrolidon, ein Polysaccharid, einen oberflächenaktiven Stoff und ein Derivat eines Mischpolymerisatsvon Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid, das sich von der Säureform oder der Teilesterform ableiten kann, dadurch gekennzeichnet, daß der oberflächenaktive Stoff Natriumlauroylsarcosinat ist und daß das Polysaccharid aus einem langkettigen Polymerisat aus 3,6 - Anhydro - η - Galactose und sulfatierten lvGalactoseresten besteht.