DE1075869B

DE1075869B -

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Publication number: DE1075869B
Application number: DENDAT1075869D
Authority: DE
Priority date: 1955-06-09
Publication date: 1960-02-18
Also published as: DE1255354B; GB843221A; IT559141A; CH360517A; GB808742A; FR1153709A; CH350126A; IT591820A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Diagnostiziermittel zum Nachweis und zur Bestimmung von Glukose in Flüssigkeiten, insbesondere in Urin.

Das erfindungsgemäße Diagnostiziermittel eignet sich zum Nachweis und zur Bestimmung des Gehalts vieler reduzierenden Zuckern, insbesondere jedoch zum Nachweis von Glukose in Körperflüssigkeiten. Die Bestimmung von Glukose in Körperflüssigkeiten, beispielsweise Urin, ist nicht nur für Diabetiker von größter Wichtigkeit, die ihre Zuckeraufnahme kontrollieren müssen, sondern ist auch dann wichtig, wenn der Nachweis einer Krankheit im öffentlichen Interesse liegt und eine große Anzahl von Menschen zur Feststellung ihres körperlichen Zustandes untersucht werden sollen.

Zur Bestimmung oder Schätzung der in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Urin, vorhandenen Reduktionsmitteln hat man hauptsächlich alkalische Kupferlösungen verwendet, die man mit dem zu untersuchenden Material erhitzt, so daß Kupferoxyd ausfällt. Man hat Glukose auch dadurch bestimmt, daß man die bei der Reaktion verbrauchte Sauer stoff menge manometrisch mißt. Das dabei entstehende Wasserstoffsuperoxyd wird durch Katalase zerstört.

Die Verfahren weisen den Nachteil auf, daß ihre Anwendung eine gewisse Fertigkeit und Vertrautheit mit der Handhabung von Meß vorrichtungen, wie z. B. Pipetten u. dgl., und die Verwendung von flüssigen Reagenzien erforderte, von denen einige, insbesondere die alkalischen, gefährlich zu handhaben und schlecht zu transportieren sind.

In der USA.-Patentschrift 2 387 244 ist eine diagnostische Tablette beschrieben, die wegen ihrer einfachen Anwendbarkeit und Genauigkeit der Bestimmung weitgehend Anwendung gefunden hat, zumal die Untersuchung im Gegensatz zu den älteren Verfahren von ungelernten Personen durchgeführt werden konnte.

Alle diese Mittel und Verfahren haben aber den einen Nachteil gemeinsam, daß sie zur Durchführung die Anwendung von Wärme erforderlich machen. Bei dem älteren Verfahren wurde diese Wärme durch einen Bunsenbrenner oder eine andere äußere Wärmequelle zugeführt.

Gemäß der obengenannten Patentschrift wurde die Notwendigkeit einer äußeren Wärmequelle dadurch umgangen, daß in einer Tablette mit einem Glukosereagenzgemisch eine »eingebaute« Wärmequelle vorgesehen ist, wodurch das Verfahren älteren überlegen war. Es war aber auch bei diesem verbesserten Verfahren noch Wärme notwendig, was bedeutete, daß eine gewisse Vorsicht beim Vermischen und bei der Handhabung der Zubereitung aufgewendet werden mußte, um die Möglichkeit einer unbeabsichtigten

Diagnostiziermittel zum Nachweis
von Glukose in Flüssigkeiten

Anmelder:

Miles Laboratories, Inc.,
Elkhart, Ind. (V.St.A.)

Vertreter: Dr.-Ing. F. Wuesthoff, Dipl.-Ing. G. Puls

und Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. E. Frhr. v. Pechmann,

Patentanwälte, München 9, Schweigerstr. 2

Beanspruchte Priorität:
V. St. v. Amerika vom 9. Juni 1955

Alfred Henry Free, Elkhart, Ind. (V. St. A.),
ist als Erfinder genannt worden

Hitzeentwicklung durch zufälliges Befeuchten der Zubereitung auszuschalten.

Es wurde nun ein neuartiges und äußerst wertvolles Mittel zum Nachweis von Glukose in verschiedenen Stoffen einschließlich Körperflüssigkeiten, z. B. Urin, gefunden, das einfach anzuwenden ist, keine Wärme erfordert und auch nicht die vielen Nachteile älterer Zubereitungen, Nachweismittel oder -verfahren aufweist.

Das Diagnostiziermittel besteht erfindungsgemäß aus einem saugfähigen Träger, der ein Enzym, das Oxydaseaktivität für Glukose aufweist und einen Indikator enthält, der in Gegenwart eines Reaktionsproduktes, das sich bei der Berührung des Enzyms mit der Glukose bildet, eine Farbreaktion gibt.

Der Indikator besteht zweckmäßigerweise aus einem System von Peroxydase und einer Verbindung, die in Gegenwart von Hydroperoxyd eine Farbreaktion ergibt. Als Enzym· verwendet man vorzugsweise GIukoseoxydase. Für den Träger hat sich besonders gut Katalase erwiesen, der man noch einen Puffer zusetzen kann, der bei Berührung mit der zu untersuchenden Flüssigkeit den p_H-Wert zwischen etwa 2 und 8 hält.

Bei der Berührung des Diagnostiziermittels mit der zu prüfenden Flüssigkeit entsteht eine Farbveränderung, deren Ausmaß ein Zeichen für die Menge der vorliegenden Glukose ist. Das Verfahren, das in einigen seiner Durchführungsformen im folgenden beschrieben

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wird, ist so einfach, daß man es als qualitative Probe und sogar als quantitative Bestimmung, auch durch ungelernte Personen verwenden lassen kann, die lediglich in der Lage sein müssen, das Vorliegen oder die Abwesenheit einer Farbveränderung festzustellen.

Beispiel 1

Eine diagnostische Tablette mit einem Gewicht von etwa 300 mg wird nach üblichen Misch- und Tablettierverfahren hergestellt, so daß sie als einen wesentliehen Bestandteil ein Glukoseoxydase-Katalase-Enzym enthält. Die Tablette kann zweckmäßigerweise etwa 5 mg Enzym mit einer hinreichenden Menge Laktose, Bentonit, einfachen anorganischen Salzen, Borax, Stärke und ähnlichen Füllstoffen, die man beim Tablettieren verwendet, enthalten.

Da eine gewisse Sauerstoffmenge notwendig ist, um die in Frage kommende Reaktion durchzuführen, kann man sauerstoffliefernde Stoffe, beispielsweise Strontiumperoxyd, Bariumperoxyd, Natriumpyrophosphatperoxyd, Natriumperborsilikat und ähnliche Stoffe zugeben. Der für die Reaktion erforderliche Sauerstoff kann auch aus sauerstoffhaltigen Verbindungen, wie Iodaten und verwandten Verbindungen, zugeführt werden. Selbstverständlich ist die in der Tablette zu verwendende Enzymmenge variabel, wobei jedoch genügend Enzym vorliegen muß, um die Oxydation der gesamten in der Probe der zu analysierenden Körperflüssigkeit vorliegenden Glukose zu Glukonsäure zu katalysieren. Zusätzlich zu den genannten Bestandteilen gibt man eine genügende Menge eines Indikators zu, der eine Farbveränderung bei einem p_H-Wert unterhalb des normalen p_H-Werts von Körperflüssigkeiten bewirkt und der insbesondere bei einem p_H-Wert von 4,5 oder darunter die Farbe ändert. Beispiele für solche Indikatoren sind Methylorange, Kongorot.

Bei der Verwendung gibt man einen oder wenige Tropfen der zu untersuchenden Körperflüssigkeit, z.B. Urin, auf die Tablette. Wenn Glukose in der Körperflüssigkeit vorhanden ist, katalysiert das Enzym die Oxydation der Glukose zu Glukonsäure, und ein Farbwechsel an der Oberfläche der Tablette zeigt die Anwesenheit von Glukose in der Flüssigkeit an.

Die Tabletten können auch eine geringe Menge eines C Og-entwickelnden Substanzpaars enthalten, um die Berührung der Flüssigkeit mit den festen Stoffen, aus denen die Tablette besteht, zu erleichtern. Auch oberflächenaktive Mittel können vorteilhaft sein, um ein Benetzen der Tablette durch die Flüssigkeit zu erleichtern.

Es ist gegebenenfalls auch möglich, den Indikator aus der Tablette wegzulassen und die Untersuchung so durchzuführen, daß man die indikatorfreie Tablette auf ein Untersuchungspapier legt, das so behandelt worden ist, daß es bei einem p_H-Wert von etwa 4,5 oder darunter die Farbe ändert, einige Tropfen der zu untersuchenden Körperflüssigkeit auf die Tablette gibt und die gegebenenfalls stattfindende Farbreaktion auf der Fläche beobachtet, die durch die Flüssigkeit im Umkreis der Tablette benetzt ist.

Beispiel 2

Eine Tablette von etwa 300 mg wird so hergestellt, daß sie vorzugsweise etwa 5 oder 10 mg Glukoseoxydase-Enzym, wie im Beispiel 1 beschrieben, gemeinsam mit einer genügenden Menge einer sauerstoffliefernden Verbindung, wie Strontiumperoxyd, enthält, so daß der gesamte zur Oxydation der in 1 cm³ Urin enthaltenden Glukose erforderliche Sauerstoff zugeführt wird, wobei die übrige Tablette aus Streck- und Zusatzmitteln, wie Stärke, Laktose, Boraten, beispielsweise Natriumborat oder anderen weißen oder vorzugsweise farblosen Verbindungen, besteht. Man kann eine hinreichende Menge eines C O₂-entwickelnden Substanzpaars hinzugeben, so daß die Tablette leicht zerfällt, wenn sie in den Urin geworfen wird. Das C O₂-entwickelnde Substanzpaar kann natürlich in unterschiedlichen Mengen vorliegen und kann 0,1 bis 50% und darüber des Gewichts der Tablette ausmachen. Auf jeden Fall wird nur eine so große Menge des C O₂-entwickelnden Substanzpaars verwendet oder braucht verwendet zu werden, um die Auflösung der Tablette zu fördern.

Außer einem p_H-Indikator in der Tablette oder in einem Versuchspapier ist es natürlich möglich, als Indikator Verbindungen zu verwenden, die mit der entwickelten Glukonsäure Farbsalze oder Additions komplexe der einen oder anderen Art bilden. Da die Glukonsäure bekanntlich leicht Chelate bildet, kann man farbbildende Salze von solchen Metallen, die mit der Glukonsäure Chelate bilden, in der Tablette oder dem Versuchspapier, das mit der Tablette verwendet wird, einverleiben. Beispiele für solche Metallsalze sind die farbbildenden Salze von Metallen wie Eisen, Kupfer, Nickel, Calcium, Barium, Magnesium u. dgl.

Eine weitere Variante des Verfahrens gemäß der Erfindung ist die Verwendung eines saugfähigen Papiers, Asbests od. dgl.

Man läßt dieses saugfähige Material sich in einer Lösung eines Glukoseoxydase-Katalase-Enzyms, wie oben beschrieben, vollsaugen, trocknet es und führt die Untersuchung durch Aufbringen von einem oder zwei Tropfen Urin oder einer anderen zu untersuchenden Körperflüssigkeit in Gegenwart von Sauerstoff oder einer sauerstoffliefernden Verbindung und eines Indikators zum Anzeigen der An- oder Abwesenheit von Glukonsäure oder gebildetem Wasserstoffperoxyd durch.

Die folgenden Beispiele erläutern andere Durchführungsformen der Erfindung, wobei man das auf Glukose zu untersuchende Material mit Glukoseoxydase, Peroxydase und einer chemischen Substanz in Berührung bringt, die ihre Farbe in Gegenwart von Peroxyd ändert.

Beispiel 3

Eine Ausführungsform des Diagnostiziermittels zum Nachweis von Glukose wurde wie folgt dargestellt:

Zu 10 cm³ Wasser gibt man 50 mg Glukoseoxydase, 5 mg Peroxydase, 100 mg Natriumacetat und 50 mg o-Toluidin-dichlorhydrat, Streifen eines saugfähigen Stoffes, d. h. Papier, z. B. Filterpapier, wurden in die Lösung eingetaucht, bei Zimmertemperatur getrocknet und waren dann zum Gebrauch fertig.

Beispiel 4

Das genannte Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß man an Stelle von o-Toluidin-dichlorhydrat die gleiche Menge Benzidin-dichlorhydrat verwendet.

Die gemäß Beispiel 3 und 4 behandelten Papierstreifen zeigen, wenn man sie mit einem Tropfen der glukosehaltigen Flüssigkeit in Berührung bringt, eine Farbentwicklung von Grün bis Blau, je nach der Konzentration der Glukose.

Wenn Katalase, wie dies zuweilen bei der Glukoseoxydase der Fall ist, vorliegt, sollte die verwendete Peroxydasemenge natürlich hinreichen, um die Wirkung der Katalase auszuschalten.

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In den vorhergehenden Beispielen hatte die verwendete Glukoseoxydase eine Aktivität von etwa 2600 Einheiten je Gramm, wobei defmitionsmäßig eine Einheit diejenige Enzymmenge darstellt, die bei 30° C die Aufnahme von 10 mm³ Sauerstoff durch eine in einer Warburg-Flasche enthaltene Glukoselösung verursacht. Die verwendete Peroxydase wurde aus Meerrettich gewonnen, und ihre Aktivität war von der gleichen Größenordnung wie die von Bluthämoglobin.

In den Zubereitungen gemäß Beispiel 3 und 4 spielt das Natriumacetat die Rolle eines Puffers und kann natürlich durch andere bekannte Puffer, z. B. Natriumcarbonat, Natriumeitrat u. dgl., ersetzt werden. Vorzugsweise verwendet man Puffer, die auf einen p_H-Wert von etwa 2 bis 8, vorzugsweise auf einen pH-Wert von 4 bis 8, puffern können.

Außer o-Toluidin, Benzidin und Salzen hiervon kann man als Indikatoren Substanzen, wie z. B. Gujacole, Orcinol, Pyrogallol, Gallussäure, Leukofafbstoffe, beispielsweise Leukomalachitgrün, Leukophenolphthalein u. dgl., verwenden. Man kann auch Iodide gemeinsam mit Stärke verwenden.

Das Diagnostiziermittel kann man natürlich auch als Pulver oder als gepreßte, vorzugsweise saugfähige Tabletten verwenden. Man kann wertvolle Tabletten herstellen, die außer den vorgenannten Substanzen Verdünnungsmittel, Füllstoffe u. dgl., ζ. Β. Stärke, Laktose, Bentonit usw., enthalten.

Mittels der Reagenzpapierstreifen, bei denen die Enzyme, der Puffer und der Indikator auf dem Papierstreifen aufgebracht wurden, oder mittels der Pulver oder Tabletten bestimmt man die Anwesenheit von 250 mg Glukose oder noch weniger in 100'cm^s Flüssigkeit, z. B. Urin.

Es ist möglich, das Verhältnis von Glukoseoxydase zu Peroxydase bei der Durchführung der Erfindung weitgehend zu variieren. Beispielsweise kann man den Glukoseoxydasegehalt hundertfach vermehren oder auch auf ein Zehntel der im Beispiel 3 und 4 angegebenen Menge vermindern, ohne den Test nachteilig zu beeinflussen. Es ist lediglich erforderlich, daß hinreichend Oxydase vorliegt, um die Oxydation von Glukose zu katalysieren, und hinreichend Peroxydase, um die eigene Enzymaktivität ohne Störung durch die Katalase auszuüben.

Die verschiedenen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Diagnostiziermittels lassen sich zur Bestimmung des Glukosegehalts nicht nur von Körperflüssigkeiten, einschließlich Blutserum, Vollblut, Urin u. dgl., sondern ganz allgemein zur Bestimmung des Glukosegehalts jeder glukosehaltigen Flüssigkeit verwenden.

Claims

Patentansprüche:

1. Diagnostiziermittel zum Nachweis von Glukose in Flüssigkeiten, insbesondere Urin, gekennzeichnet durch einen saugfähigen Träger, der ein Enzym, das Oxydaseaktivität für Glukose aufweist, und einen Indikator enthält, der in Gegenwart eines Reaktionsproduktes, das sich bei der Berührung des Enzyms mit der Glukose bildet, eine Farbreaktion gibt.

2. Diagnostiziermittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator ein System aus Peroxydase und einer Verbindung ist, die in Gegenwart von Hydroperoxyd eine Farbreaktion gibt.

3. Diagnostiziermittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als Enzym Glukoseoxydase enthält.

4. Diagnostiziermittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger noch Katalase enthält.

5. Diagnostiziermittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger einen Puffer enthält, der bei Berührung mit der Flüssigkeit den p_H-Wert zwischen etwa 2 und 8 hält.

In Betracht gezogene Druckschriften:
H. Stetter, »EnzymatischeAnalyse«, 1951, S. 130 und 131, 133, 134, 172.

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