DD211874A5

DD211874A5 - Verbesserter proben-teststreifen und testverfahren fuer okkultes blut

Info

Publication number: DD211874A5
Application number: DD83251341A
Authority: DD
Inventors: Josefina T Baker; Paul J Lawrence; Charles W Townsley
Original assignee: Smithkline Diagnostics Inc
Priority date: 1982-05-28
Filing date: 1983-05-27
Publication date: 1984-07-25
Also published as: EP0095302A1; IL68767A0; GR79286B; NO161196B; NZ204343A; NO161196C; JPS58215557A; IE54507B1; PH23572A; PT76748B; ATE18307T1; PT76748A; ES8404513A1; CA1216501A; KR840004505A; ZA833856B; KR900005485B1; CS259514B2; DK231083A; NO831871L

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein verbesserter Proben-Teststreifen zur Bestimmung von okkultem Blut. Er enthaelt ein mit Saeure behandeltes absorbierendes Substrat, das Gujak-Harz als Test-Reagenz enthaelt. Der Teststreifen wird mit einem gepfferten Entwickler entwickelt. Der Proben-Teststreifen kann unabhaengig von dem ph-Wert der zu pruefenden Probebenutzt werden und eignet sich deshalb auch zum Test von anderen Proben als Stuhl, beispielsweise zur Bestimmung von okkultem Blut im Magensaft.

Description

Titel der Erfindung:

"Verbesserter Proben-Teststreifen und Testverfahren für okkultes Blut"

Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die Anwendung der Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der medizinischen Tests, insbesondere der Prüfungen zur Bestimmung von okkultem Blut

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Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Proben-Teststreifen und Verfahren zum Auffinden von okkultem Blut im Stuhl sind bereits bekannt. Beispielsweise sind in der US-PS 3 996 006 Streifen beschrieben, die ein die Probe aufnehmendes Blatt zwischen einer vorderen und einer hinteren Platte aufweisen. Sie haben mindestens eine Öffnung in der vorderen Platte und eine öffnung in der hinteren Platte sowie drehbare Abdeckungen zum Verschließen dieser Öffnungen. Im Falle eines Tests für okkultes Blut

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im Stuhl ist das die Probe aufnehmende Blatt üblicherweise ein Papier, das mit Guajakharz imprägniert oder beschichtet ist. Sine Entwicklerlösung, beispielsweise eine Peroxidlösung, wird durch die Öffnung in der hinteren Platte zugeführt. Ein solcher Teststreifen ist unter der Bezeichnung "Hemoccult" auf dem Markt.

Das Testverfahren verläuft kurz erläutert folgendermaßen:

Eine Stuhlprobe wird durch eine Öffnung der vorderen Platte auf das Guajak-Papier gestrichen. Die Platte wird dann

abgedeckt und die Klappe der hinteren Platte geöffnet. "^:J Eine Entwicklerlösung, wie Wasserstoffperoxid, wird durch die entsprechende Öffnung in der hinteren Platte auf das Guagak-Papier aufgebracht. Wenn Blut in dem Stuhl enthalten ist, färbt die Guajak-Seaktion das Papier blau. Die blaue Farbe ist auf die durch Hämoglobin katalysierte Oxidation des Guajakharzes zurückzuführen:

H₂O₂

Guajakharz farblos -> , oxidiertes Guajakharz

Hämoglobin blaue Farbe

Einer der mit diesem Guajak-Test verbundenen Nachteile besteht darin, daß die durch Hämoglobin katalysierte Entstehung einer blauen Färbung vom pH-Wert abhängt. Die Entwicklerlösung arbeitet unterhalb eines bestimmten pH-Wertes nicht reproduzierbar. Der pH-Wert für erfolgreiche Durchführung des vorstehend erläuterten bekannten Systems reicht von etwa 4,0 bis 7,0, wobei der günstigste pH-Wert bei 5,5 bis 6,0 liegt. Deshalb wird nur eine geringe oder möglicherweise überhaupt keine Färbung bemerkt, wenn Hämoglobin mit dem mit Guajakharz behandelten Substrat in einem Medium zusammenkommt, das einen wesentlich anderen als den günstigsten pH-Wert aufweist.

Infolge des vorstehend erwähnten Nachteils ist der derzeit benutzte Teststreifen für die Prüfung auf die

Anwesenheit von okkultem Blut in Proben, die einen niedrigen pH-Wert aufweisen, v/ie Magensaft, der einen pH-Wert unter 2 haben kann, nicht geeignet. Die Feststellung von Verbindungen, die im Mageninhalt normalerweise nicht anwesend sind, insbesondere die Anwesenheit von okkultem Blut ist jedoch von erheblicher Wichtigkeit für den klinischen Befund. Blut im Mageninhalt kann aus verschiedenen Quellen stammen. Hierzu gehören Blut, das nach einer Verletzung außerhalb des Magen-Darm-Trakts verschluckt wurde, sowie Blutungen im Magen-Darm-Trakt. Bei bestimmten Erkrankungen, wie Magenkrebs, Magengeschwür und Gastritis, kann Blut im Magen anwesend sein. Die Aufnahme von Alkohol und verschiedenen Arsneistoffen, wie Aspirin, andere Analgetika und Corticosteroide,kann Verletzungen der Magenschleimhaut-Zellen und möglicherweise Magenblutungen hervorrufen. Verletzungen im Magen und anschließende Blutungen wurden auch bei Patienten berichtet, die zur Behandlung schwerer Verletzungen oder Verbrennungen in Krankenhäuser eingeliefert wurden. Diese Art von Verletzungen können innerhalb von 24- Stunden nach dem ursprünglichen Trauma auftreten und zu akuten lebensbedrohenden Magenblutungen führen. Eine frühe Entdeckung von okkultem Blut im Magen—Darm-Trakt wäre deshalb für die Diagnose all der vorstehend aufgeführten Erkrankungen in frühem Stadium von größter Wichtigkeit, da sie dann noch mit größerer Wirksamkeit behandelt werden können.

Es wurden bereits Versuche unternommen, das mit Guajakharz imprägnierte Papier oder den Teststreifen gegen Änderungen des pH-Wertes sowie gegen einwirkende Stoffe, v/ie Peroxidasen, zu stabilisieren. In der DE-OS 27 16 060· ist der Zusatz von Pufferstoffen oder Chelatbildnem zum Guajak-Papier beschrieben, um die vorstehend erläuterten Schwierigkeiten zu überwinden. Die größte Notwendigkeit für eine Pufferung besteht dann, wenn das zu prüfende Medium stark vom günstigsten pH-Bereich abweicht, wie es

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beispielsweise bei Magensaft der Fall ist, oder wenn klei ne Mengen Katalysator, wie Hämoglobin, aufzufinden sind.

Ziel der Erfindung:

Ziel der Erfindung ist es, einen verbesserten Proben-Teststreifen für okkultes Blut bereitzustellen, der unabhängig von Änderungen im pH-Wert der Probe benutzt werden kann.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Teststreifen zur Prüfung auf okkultes Blut bereitzustellen, der von Änderungen im pH-Wert!des zu prüfenden Stoffes nicht beeinflußt wird und der auch für andere Proben als Stuhl angewendet werden kann. Eine weitere Aufgäbe der Erfindung ist die Bereitstellung eines geeigneten qualitativen Tests zur Hilfe bei der Diagnose von Magen-Darm-Erkrankungen durch Erüherkennung von okkultem Blut im Magensaft. Schließlich ist es Aufgabe der Erfindung, einen Proben-Teststreifen bereitzustellen, bei dem falsche positive Reaktionen, die auf die Gegenwart' von Peroxidasen, Eisen, Kupfer oder chemischen Stoffen, wie Cimetidin, zurückzuführen sind, ausgeschlossen werden können.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß der Proben-Teststreifen von Änderungen im pH-Wert der Probe nicht beeinflußt wirtl und falsche positive Reaktionen infolge der Gegenwart von Peroxidasen, Metallionen oder Cimetidin vermieden werden, wenn die Puffersubstanzen in die Entwicklerlösung einverleibt werden,statt nach dem Stand der Technik in das Guajak-Papier imprägniert zu werden.

.Gegenstand der Erfindung ist ein Proben-Teststreifen zur Prüfung auf okkultes Blut, gekennzeichnet durch ein mit Säure behandeltes absorbierendes Substrat, das Guajakharz als Testreagens enthält.

Vorzugsweise umfaßt das Substrat ein Blatt Saugpapier.

Die Säure, mit der das Substrat behandelt wird, ist vorzugsweise Citronensäure.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Be- J Stimmung der Anwesenheit von okkultem Blut im Magensaft, gekennzeichnet dadurch, daß man die Magensaft-Probe auf ein mit Säure behandeltes absorbierendes Substrat aufbringt, das Guajakharz als Testreagenz enthält, eine gepufferte Entwicklerlösung auf das Substrat aufbringt und feststellt, ob sich das Substrat blau verfärbt.

In dem genannten Verfahren enthält die Entwicklerlösung vorzugsweise Wasserstoffperoxid..

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Prüfsatz zur Bestimmung der Anwesenheit von okkultem Blut im Magensaft, gekennzeichnet durch ein mit Säure behandeltes absorbierendes Substrat, das Guajakharz als Testreagenz enthält und ein eine gepufferte Entwicklerlösung enthaltendes Gefäß, welche mit dem genannten Reagenz reagiert und das Substrat blau färbt.

Schließlich ist Gegenstand der Erfindung eine wäßrige Entwicklerlösung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an etwa Λ bis 5°p Wasserstoffperoxid und gepuffert mit 0,2 M Citronensäure/Natriumcitrat mit einem pH-Wert von etwa 5,8.

Vorzugsweise wird der genannten Entwicklerlösung ein nichtionisches Netzmittel zugesetzt.

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Aus dem Puffern der Entwicklerlösung anstelle der Imprägnierung des Guajak-Papiers mit einem Puffer ergeben sich, mehrere größere Vorteile. Die Menge an Puffer, die auf das Guajak-Papier aufgebracht v/erden kann, ist durch die Saugfähigkeit des Papiers begrenzt. Wenn eine starke Pufferwirkung erforderlich ist, ist somit die Pufferung des Entwicklers wirksamer. Perner ist eine gleichmäßige Verteilung des Puffers auf dem Papier schwierig zu erreichen. Durch Pufferung des Entwicklers ist der pH-Wert nicht, auf denjenigen des Substrates begrenzt, d.h. der pH-Wert' kann geändert werden. Wenn das Papier einmal imprägniert ist, ist dagegen der pH-Wert definiert und begrenzt. Eine große Salzkonzentration auf dem Papier beeinflußt ferner andere Reagenzien und ändert die physikalischen Eigenschaften des Papiers selbst. Durch Pufferung der Entwicklerlösung ergibt sich dagegen keine Änderung im Herstellungsverfahren des Proben-Teststreifens. Somit ist diese !Lösung sehr wirtschaftlich.

Die vorteilhaftesten Ergebnisse werden bei kombinierter Verwendung von mit Säure behandeltem Guajak-Papier und gepuffertem Entwickler erhalten. Es wurde festgestellt, daß die Säurebehandlung des Guajak-Papiers falsche positive Tests mit Cimetidin ausschließt und die Wechselwirkung mit Peroxidasen vermindert. !Ferner verhindert die Säure im Gua.jak-Papier unerwartet erweise eine blaue Verfärbung des Guajakharzes während der Lagerung, die sonst durch Oxidation an der Luft auftreten kann. Der gepufferte Entwickler ist erforderlich, um die Entdeckung des Hämoglobins unter den im Guajak-Harz vorliegenden sauren Bedingungen zu ermöglichen. Dies wird durch die Ergebnisse der folgenden Versuche veranschaulicht.

Proben von synthetischem Magensaft mit einem Gehalt von 0,05 nig Hämoglobin und 30 ^¹S Cimetidin pro ml werden bereitet. Dann werden 25 /ul Proben auf "Hemoccult"-Streifen

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ifferten

aufgebracht und mit gepufferten und nichtgepuj Entwicklern entwickelt. Die"Hemoccult"-Streifen werden dann durch Säurebehandlung des Guajak-Papiers vor dem Aufbringen und Entwickeln der Proben angesäuert. Die Ergebnisse dieser Prüfungen sind in den nachstehenden Tabellen: I und II zusammengefaßt.

Tabelle I

Gepufferter und ungepufferter Entwickler mit gewöhnlichen "Hemoccult"-Streifen; Ablesung nach 30 Sekunden

.pH-Wert der Probe	HÄMOGLOBIN	ungepuffer ter Ent wickler	CIMETIDIN.	X ungepuf-.; ferter Entwickler
1,32	gepufferter Entwickler	1	gepufferter Entwickler	1
2,20	3	3	0	2
3,60	3	4	--- o	2
4,32	4	4	0	2
5,60	4	3	0	4
6,37	4	3	0	4
4	0

Tabelle II

Mit Säure behandelte und unbehandelte Streifen mit gepuffertem Entwickler

Streifen	EÄMCGL03IN	2	5	keine	2	Säure	CIMETIDIN'.;.	2	5	keine	Säure	5
Ablese- .	Säure	5	5		5		Säure	0	0			0
min. ^ >		5	5	0,5	5	5		0	0	0,5	2	5
£1.32	0,5	5	5	3	5	5	0,5	0	0	0	0	5
\ 5. 60	2			5		5	0		0	1
ο 6.37	5		4	5	0		0	3
	5			0

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Die "Hemoccult"-Streifen werden durch Behandlung der Mitte des Guagak-Papiers mit.25 μΐ Ο,ΊΜ Citronensäure angesäuert. Das Papier wird vor dem Gebrauch unter Normalbedingungen trocknen gelassen. Der gepufferte Entwickler enthält Wasserstoffperoxid in einem 0,2M Citronensäure/Citrat-Puffer mit einem pH-Wert von 5,8. Der ungepufferte Entwickler ist der handelsübliche "Hemoccult"-Entwickler, der Wasserstoffperoxid in Äthanol und Wasser enthält

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Die Intensität der blauen Färbung wird in einer Skala mit Werten von 1 bis 5 bewertet, wobei 0 farblos bedeutet. Aus Tabelle I ist zu sehen, daß bei der Verwendung des gepufferten Entwicklers mit dem üblichen "Hemoccult"-Streifen ein gleichmäßigerer positiver Hämoglobin—Test erhalten wird. Der gepufferte Entwickler eliminiert auch falsche positive Ergebnisse, die durch Cimetidin verursacht werden. Die Ergebnisse in Tabelle II zeigen, daß die Verwendung von angesäuertem Guajak-Papier zusammen mit gepuffertem Entwickler keine falschen positiven Ergebnisse infolge von Cimetidin ergibt, auch wenn die Ablesung des Testergebnisses verzögert ist und nach den vorgeschriebenen 30 Sekunden erfolgt. Es ist festzustellen, daß diese Behandlung den Test

auf Hämoglobin nicht beeinflußt

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Die durch Peroxidase katalysierte falsche positive Reaktion ist ebenfalls vom pH-Wert abhängig und die Katalyse nimmt mit abnehmendem pH-Wert ab. Es wurde festgestellt, daß die Säurebehandlung des GuaJak-Papiers vor dem Auf-

^ bringen der Probe eine durch -säurelabile Peroxidasen katalysierte falsche.positive Reaktion verhindert. Das be-" handelte Papier ergibt, wenn es mit einem gepufferten Entwickler verwendet wird, mit Hämoglobin enthaltenden Proben eine blaue Färbung, und beeinflußt die Prüfung auf Hämoglobin nicht. Beispielsweise ergibt synthetischer Magensaft vom pH-Wert 6,5, der gereinigte Meerrettich-

Peroxidase (2 Einheiten pro ml) enthält, bei der Prüfling mit "Hemoccult"-Streifen ein falsches positives Ergebnis. Wenn dagegen das Guajak-Papier mit Säure vorbehandelt ist und die genannte synthetische Magenflüssigkeit mit Peroxidase aufgebracht und mit der Säure 5 Minuten vor dem Entwiekeln umsetzen gelassen wird, wird keine blaue positive !Färbung erzeugt.

Beispiele für Säuren, die sich zur Behandlung des Guajak-Papiers eignen, sind Salzsäure, Schwefe!säure, Citronensäure, Phosphorsäure und Oxalsäure. Daneben können auch andere starke organische und anorganische Säuren verwendet werden. Ein Beispiel für die Säurebehandlung des Guajak-Papiers wird nachstehend gegeben, 15

Ausführungsbeispiel

Lösung I

Lösung I 800 g

Citronensäure 768 g

Isopropanol 432 g

. Wasser JOO g.

Die Lösung II kann entweder durch Imprägnieren oder durch Drucken auf das Saugpapier aufgebracht werden,

Der Entwickler kann mit gedein bekannten Puffersystem, beispielsweise Citronensäure/iTatriumcitrat, Citronensäure/zweibasiges Hatriumphosphat, tris-Maleat oder EDTA gepuffert werden.

Die gepufferte Entwieklerlösung enthält vorzugsweise etwa 1 bis Jfo Wasserstoffperoxid. Der nachstehend

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Guajakharz	Lösung	II	7	,8	S
Isopropanol		92	,2	S

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beschriebene gepufferte Entwickler, der einen 0,2M Citronensäure/Citrat-Puffer mit einem pH-Wert von 5,8 enthält, wird vorzugsweise in vorliegender Erfindung verwendet.

Wasserstoffperoxid 2,17 S

Äthanol 32,87 g

Citronensäure , 0,75 g

Natriumeitrat - 4-,37 S

V/asser ^58,8Og

Triton X-100 1,04 g.

Vorzugsweise wird ein nichtionisches Netzmittel dem gepufferten Entwickler zugesetzt, um die Peroxidase-Inhibierung zu unterstützen. Besonders bevorzugt ist die Ver-Wendung eines Triton X-Netzmitteis, Polyäthylenglykolp-isooetylphenyläther.

Wenn ein gepufferter Entwickler zusammen mit einem Substrat aus säurebehandeltem Guajak-Papier verwendet wird, ergibt sich ein Proben-Teststreifen, der stabil ist und die Prüfung auf die Anwesenheit von okkultem Blut in Proben mit niedrigem pH-Wert, wie Magensaft, gestattet. Außerdem v/erden falsche positive Ergebnisse infolge von Cimetidin, Peroxidasen und Metallionen, wie Kupfer- und Eisenionen, ausgeschlossen.

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Claims

Erfindungsanspruch

1. Proben-Teststreifen zur Prüfung auf okkultes Blut, gekennzeichnet durch ein mit Säure behandeltes absorbierendes Substrat, das Guajak-Harz als Test-Reagenz enthält.
2. Streifen nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Substrat ein Blatt Saugpapier umfaßt.

3· Streifen nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Säure Citronensäure ist.
4. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von okkultem Blut im Magensaft, gekennzeichnet dadurch, daß man den Magensaft auf ein mit Säure behandeltes absorbierendes Substrat aufbringt, das'Guajak-Harz als Test-Keaganz enthält, eine gepufferte Entwicklerlösung auf das Substrat aufbringt und beobachtet, ob das Substrat sich blau verfärbt.

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5. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Entwicklerlösung Wasserstoffperoxid enthält.
6. Prüfsatz zur Bestimmung der Anwesenheit von okkultem Blut im Magensaft, gekennzeichnet durch ein mit Säure behandeltes absorbierendes Substrat, das Guajak-Harz als Test-Reagenz enthält und ein eine gepufferte Entwicklerlösung enthaltendes Gefäß, welche mit dem

Reagenz reagiert und das Substrat blau färbt. 10
7. Wäßrige Entwicklerlösung, gekennzeichnet dadurch, daß sie etwa 1 bis 5$ Wasserstoffperoxid, gepuffert mit 0,2M Citronensäure/Natriumcitrat mit einem pH-Wert von etwa 5₅8 enthält.
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8. Lösung nach Punkt 7₅ gekennzeichnet dadurch,, daß sie ein nichtionisches Netzmittel zugesetzt enthält.

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