DE2050481C3

DE2050481C3 - Diagnostiziermittel zur halbquantitativen Bestimmung von Glukose in Urin

Info

Publication number: DE2050481C3
Application number: DE19702050481
Authority: DE
Inventors: Kenneth Allen Haden Billy Harper Hendershot William Fred Elkhart Ind Johnson La Veil Rolfson Salt Lake City Utah Blake, (VStA)
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1969-10-15
Filing date: 1970-10-14
Publication date: 1977-08-11

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Diagnostiziermittel zur halbquantitativen Bestimmung von Glukose in Urin, das in einem saugfähigen Träger Glukoseoxidase, ein wasserlösliches Jodid und eine Substanz mit Peroxidaseaktivität enthält.

Der Nachweis von Glukose im Urin sowie die Bestimmung ihrer Konzentration ist von großer Wichtigkeit für Diabetiker, die durch entsprechende Diät ihre Zucker aufnahme regulieren müssen und deren Glukosegehalt im Urin daher regelmäßig untersucht werden muß. Neben seiner Eignung für regelmäßige Urinuntersuchungen von Diabetikern durch die Patienten selbst oder durch Ärzte, sollte ein Glukoseindikator auch wirksam für Routineurinanalysen in Krankenhäusern und auch Praxen angewandt werden können zum Nachweis von Diabetes und für Reihenuntersuchungen, zur Unterscheidung von Glukosurie von anderen Meliturien und ähnlichem.

Da die frühzeitige Diagnose und regelmäßige Überwachung bei Diabetes so wichtig sind, muß ein Urinzuckertest, wenn er von größtmöglichem Wert sein soll, möglichst schnell und einfach genug sein, daß ihn jeder Patient leicht selbst ausführen kann, genau genug für den Kliniker und empfindlich genug, um Änderungen in dem Zustand des Patienten anzuzeigen. Darüber hinaus muß das Diagnostiziermittel genügend quantitativ sein, um eine Zunahme der Glukosekonzentration genau zu messen und es dadurch zu ermöglichen, zwischen verschiedenen medizinischen Zuständen zu unterscheiden.

Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Zucker im Urin sind in der klinischen Chemie bekannt. Ein derartiges Verfahren verwendet den Benedictschen Kupfer-Reduktionstest. Ein anderes verwendet ein alkalisches Kupfer-Reduktionsmittel in Tablettenform, das sich bei der Lösung selbst erwärmt, und ein weiteres umfaßt einen Test, der nur auf der Wirkung von Enzymen beruht.

Die CH-PS 3 39 755 sowie das DT-GBm 19 05 260 beschreiben Mittel zum Nachweis von Zucker (Glukose bzw. Glukose und Saccharose), bestehend aus einem saugfähigen Träger, der mit Glukoseoxidase, Peroxidase und als Indikator einem Jodid imprägniert ist. Derartige Diagnostiziermittel zum Nachweis von Glukose sind jedoch nicht ausreichend quantitativ, d. h., sie reagieren nicht auf eine geringe Zunahme von Glukose in Körperflüssigkeiten wie Urin. Wenn ein derartiges Diagnostiziermittel in eine Urinprobe eingetaucht wird, die Glukose enthält, und sofort wieder daraus entfernt wird, wird ein Überschuß der Probeflüssigkeit an dem Diagnostiziermittel zurückgehalten und verhindert dadurch, daß der atmosphärische Sauerstoff an der Reaktion teilnehmen kann und dadurch verläuft die Reaktion gewissermaßen cyclisch, d.h., es wird angenommen, daß - wenn kein Sauerstoff an der 1 estreaktion teilnehmen kann, da sich eine Flüssigkeitsschicht über dem Diagnostiziermittel befindet — ein Teil des freien Jods als Oxidationsmittel für die reduzierte Glukoseoxidase wirkt, die bei der Reaktion entsteht. So ist das Jodid nicht nur als Indikatorsubstanz wirksam, sondern nimmt an der Glukoseoxidase-Glukose-Reaktion teil.

Die US-PS 30 92 465 betrifft ein Diagnostiziermittel zum Nachweis von Glukose, bestehend aus einem saugfähigen Träger, der mit einem Enzym mit Glukoseoxidase-Aktivität, einer Substanz mit Peroxidase-Aktivität und einem Indikator imprägniert ist, der in Gegenwart der Peroxidase oxidiert wird. Dieses Prüfmittel ist mit einem semipermeablen Überzug versehen, um störende Teilchen der zu untersuchenden Flüssigkeit, insbesondere rote Blutkörperchen bei der Untersuchung von Blut von dem Indikatorsystem fernzuhalten. Nach dieser Druckschrift werden Indikatorsubstanzen angewandt, bei denen das Problem der »Cyclisierung« nicht auftritt.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Diagnostiziermittel zur halbquantitativen Bestimmung von Glukose in Urin zu entwickeln, das imstande ist, auch kleine Unterschiede bzw. Änderungen der Glukosekonzentration im Urin anzuzeigen und das eine gute Stabilität besitzt. Das Diagnostiziermittel soll durch einfaches Eintauchen und Ablesen angewandt werden können und jeweils eine bestimmte Menge der Probe aufnehmen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Diagnostiziermittel zur halbquantitativen Bestimmung von Glukose in Urin, bestehend aus einem saugfähigen Träger, der imprägniert ist mit einer Kombination von Glukoseoxidase, einer Substanz mit Peroxidase-Aktivität und einem Indikator, der in Gegenwart von Peroxid oxidiert wird und bei dem zumindest ein Teil des Trägers überzogen ist mit einem semipermeablen hydrophoben Film, der gebildet worden ist durch Sättigung zumindest eines Teils des saugfähigen Trägers mit einer Lösung einer hydrophoben, einen semipermeablen Film bildenden polymeren Substanz in einem organischen Lösungsmittel, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Indikator ein wasserlösliches Jodid ist und der Filmüberzug durch Verwendung einer 0,5- bis l°/oigen Überzugslösung hergestellt wurde.

Die Konzentration der polymeren Substanz in der zur Herstellung des Filmes angewandten Lösung ist kritisch.

Es hat sich gezeigt, daß die Eigenschaften des Diagnostiziermittels deutlich verschlechtert werden, wenn eine Lösung angewandt wird, die mehr als 1%' polymere Substanz enthält. Besonders hat sich ein Diagnostiziermittel, das mit einer Lösung imprägniert worden ist, die entsprechend der US-PS 30 92 465 2% polymere Substanz enthielt, zur Bestimmung von Glukose in Urin als vollständig ungeeignet erwiesen.

Das Diagnostiziermittel enthält vorzugsweise zusätzlich einen blauen Farbstoff und/oder einen Puffer, der ι ο den pH-Wert auf 3,4 bis 7,2 einstellt

Es hat sich gezeigt, daß wenn man einen semipermeablen hydrophoben Film auf die Oberfläche des enzym» tischen Glukosediagnostiziermitteis aufbringt, dieser Film bzw. die Membran die Adhäsion überschüssiger Flüssigkeit verhindert und es dadurch ermöglicht, daß der atmosphärische Sauerstoff an der Testreaktion teilnehmen kann. Dadurch kann das Jodid in freies Jod übergehen und als Indikatorsubstanz wirken.

Die für das erfindungsgemäße System geeigneten Jodsalze sind solche, die in einem wäßrigen System leicht dissoziieren und das charakteristische Jodidion bilden. Beispiele für Jodsalze, die als Indikatorsubstanzen geeignet sind, sind Kaliumiodid, Natriumiodid und Ammoniumjodid. Außer daß die Salze ionisierbar sein sollen, darf der kationische Teil des Moleküls die enzymatisch« Katalyse der Glukoseoxidation nicht stören. Von den geeigneten Jodiden ist aus wirtschaftlichen Gesichtspunkten und der Leichtigkeit mit der es erhältlich ist, Kaliumiodid für die vorliegende Erfindung bevorzugt.

Die Prinzipien der dem enzymatischen Glukosetest zugrunde liegenden Reaktion sind bekannt. Glukoseoxidase katalysiert die aerobe Oxidation von Glukose, wobei Glukonsäure und Wasserstoffperoxid entstehen. Bei dieser Reaktion vereinigt sich der von der Glukose abgespaltene Wasserstoff mit atmosphärischem Sauerstoff, wobei Wasserstoffperoxid entsteht Die Reaktion kann durch die folgende schematische Gleichung dargestellt werden:

Glukoseoxidase
Glukose + O₂ — > Glukonsäure + H₂O₂

Außer dem Enzym Glukoseoxidase muß das oben angegebene System außerdem eine Substanz mit Peroxidaseaktivität enthalten. Von den Substanzen mit derartiger Aktivität ist Meerrettich-Peroxidase oder Kartoffel-Peroxidase bevorzugt Außer diesen natürlich vorkommenden Peroxidasesubstanzen können andere organische Substanzen mit ähnlicher Aktivität ebenfalls verwendet werden. Beispiele für derartige andere Substanzen sind normales vollständiges Blut, rote Blutkörperchen allein, lyophilisiertes Gesamtblut, Urohämin, Metallporphyrine und ähnliche Verbindungen.

Um ein Diagnostiziermittel mit der gewünschten Stabilität, Reaktionsfähigkeit und Empfindlichkeit herzustellen, sollten die oben angegebenen Bestandteile, wenn sie mit der zu untersuchenden Flüssigkeit zusammenkommen, auf eine Wasserstoffionenkonzentration von ungefähr pH 3,4 bis 7,2 gepuffert sein, wobei ein Bereich von pH 5,0 bis 6,0 bevorzugt ist Es hat sich gezeigt, daß von den vielen Puffern, die verwendet werden können, um den pH-Wert der Bestandteile in dem gewünschten Bereich zu halten, ein Citronensäure-Matriumcitrat-Puffer die gewünschten Ergebnisse erreicht und dabei die enzymatischen Reaktionen in dem Diagnoistiziermittel besonders wenig stört. Es können jedoch auch andere Systeme verwendet werden, um gleiche pH-Bedingungen zu erhalten, wie Phosphat-, Tartrat- und Glutamat-Puffer-Systeme.

Neben der Verwendung eines Jodids als Chromogen, in dem, erfindungsgemäßen Testsystem, ist es vorzuziehen, daß eine 2. Indikatorsubstanz in dem Testmittel enthallten ist Hierbei hat es sich gezeigt, daß der Zusatz eines blauen Farbstoffs zu dein Testmittel dazu führt, daß das Diagnostiziermittel auf das Vorhandensein verschiedener Konzentrationen von Glukose deutlicher anspriuht, wobei bei einer zunehmenden Glukosekonzentration Farbtöne von Blau über verschiedene Grüntöne bis Braun auftreten. Es hat sich als günstig erwiesen, als derartigen blauen Farbstoff ein Chromogen zu verwenden, daß von Blau nach Farblos geht, wenn es durch Wasserstoffperoxid, das bei der Testreaktion entsteht oxidiert wird. In dieser Beziehung sind Farbstoffe, wie Indigokarmin und Brillantblau FCF, als Chromogene ideal geeignet. Andere Farbstoffsubstanzen, die erfindungsgemäß ebenfalls verwendet werden können, sind Anilinblau, Cyanolblau, Patentblau, Xylolblau V und Comassie-Brillantblau.

Außer den oben angegebenen Bestandteilen des Testrnittels, die aktiv an der Testreaktion teilnehmen, können andere Zusätze ebenfalls verwendet werden. Solche Zusätze sind unter anderem Dickungsmittel, die auch als Enzym-Stabilisatoren wirken. In dieser Beziehung hat es sich gezeigt, daß ein Diagnostiziermittel, das Substanzen, wie Polyvinylpyrrolidon, Natriumalginan. Gelatine, Rinderserumalbumin, Polyvinylalkohol und ein Interpolymer aus Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid, wie es in der USA-Patentschrift 34 53 180 beschrieben und im Handel unter dem Namen Gantrez AN bekannt ist, enthält, bevorzugt ist. Es hat sich gezeigt daß Diagnostiziermittel, die die oben angegebenen aktiven Bestandteile und außerdem Gantrez und PVP enthalten, ungewöhnlich stabil sind. Es hat sich gezeigt daß die Verwendung von Polyvinyl-pyrrolidon zur Bildung eines Farbkomplexes mit dem freien Jodid führt, wodurch die Wirksamkeit des Indikatorsystems verbessert wird. Daher ist die Verwendung von PVP für die erfindungsgemäßen Diagnostiziermittel bevorzugt.

Wie oben angegeben, hat es sich bei Verwendung eines Jodidsalzes als Indikatorsubstanz bei einem emymatischen Glukosetestsystem als notwendig erwiesen, dafür zu sorgen, daß das Anhaften von überschüssiger Flüssigkeitsprobe an dem Diagnostiziermittel weitgehend oder vollständig vermieden wird. In diesem Zusammenhang hat es sich gezeigt daß eine semipermeable Membran, wie Äthylcellulose, ein derartiges Festhalten von Wasser verhindert. Andere Celluloseverbindungen und folienbildenden Substanzen, die die gleiche Wirkung erzielen, können ebenfalls verwendet werden. Derartige Substanzen sind die Celluloseether und -ester sowie verschiedene andere hydrophobe, folienbildende polymere Substanzen. Äthylcellulose hat sich für die erfindungsgemäßen Zwecke als besonders vorteilhaft erwiesen.

Was die genauen Mengenverhältnisse der aktiven Bestandteile betrifft hat es sich gezeigt, daß ein weiter Konzentrationsbereich verwendet werden kann. Als allgemeine Richtlinie können die folgenden Konzentrationsbereiche dienen. Diese Werte sind auf die Lösung bezogen, in der die Bestandteile des Testsystems auf den Träger aufgebracht werden.

Bestandteile

Menge pro
100 ml Lösung

Glukoseoxidase	16 000-33 000
	Einheiten
Peroxidative Substanz	40—60 mg·)
Jodid	l-2g
Zweites Chromogen
(blauer Farbstoff)	1—20 mg
Folienbildendes Polymer	0,5-1 g")

IO

*) Bezogen auf eine Probe von 3000 Worthington-Einheiten (WE)/mcg. **) Gelöst in einem organischen Lösungsmittel wie Benzol.

15

Wie zu Anfang bemerkt, soll das Testmittel vorzugsweise auf oder in einem Träger enthalten sein, wobei man die Kombination von Testmittel und Träger so verwenden kann, daß man sie nur in die zu untersuchende Flüssigkeit eintaucht und das Ergebnis abliest. Das kann durch verschiedene Verfahren erreicht werden, z. B. dadurch, daß man ein saugfähiges Material mit einer Lösung des Testmittels imprägniert und anschließend das imprägnierte Diagnostiziermittel trocknet, wodurch ein fein verteiltes, trockenes, inniges Gemisch der Bestandteile durch Adhäsionswirkung fest auf der Oberfläche des Trägers haftet Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung des Diagnostiziermittels besteht darin, daß man einen saugfähigen Träger mit einer Lösung oder mit Lösungen des Testmittels imprägniert und anschließend trocknet. Wenn ein saugfähiger Träger verwendet wird, kann er aus verschiedenen Materialien bestehen, z. B. aus Filterpapier, Holzstreifen, synthetischen faserigen Plastikmaterialien, gewebten oder nicht gewebten Stoffen usw. Das bevorzugte saugfähige Material ist Filterpapier mit einer Dicke von ungefähr 0,25 bis 0,5 mm. Nachdem der Träger mit dem Grundtestmittel imprägniert und getrocknet ist, kann die semipermeable Membran dadurch aufgebracht werden, daß man das Diagnostiziermittel in eine Lösung aus dem polymeren Folienbildner in einem organischen Lösungsmittel eintaucht und ein zweitesmal trocknet. Ein anderes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Diagnostiziermittel besteht darin, daß man das Testmittel einfach mit einer folienbildenden polymeren Substanz vermischt und ein derartiges Gemisch an einen Träger oder einen Handgriff fixiert.

Im folgenden wird die Anwendung eines erfindungsgemäßen Diagnostiziermittels beschrieben. Bei der Durchführung des Glukosetests wird das Diagnostiziermittel in die zu untersuchende Flüssigkeit eingetaucht, die normalerweise eine Urinprobe ist und sofort wieder daraus entfernt. Das wird deshalb getan, weil der pH-Wert des nassen Diagnostiziermittels normalerweise von dem in dem Testmittel enthaltenen Puffer bestimmt werden muß. Wenn das Diagnostiziermittel längere Zeit in der Flüssigkeit bleibt, bestünde die Gefahr, daß die Bestandteile des Diagnostiziermittels aus dem Träger in die Flüssigkeit ausgelaugt würden. Ein derartiges Auslaugen wird jedoch im wesentlichen durch Anwendung der oben beschriebenen semipermeabler! Membran vermieden. Die durch das Vorhandensein von Glukose in der Testflüssigkeit entwickelte Farbe wird dann durch visuellen Vergleich mit einer vorher hergestellten Farbkarte bestimmt Verschiedene instrumente^ Verfahren können auch angewandt werden, um die entwickelte Farbqualität zu bestimmen.

Dadurch wird die Genauigkeit des Tests erhöht, da die subjektive Farbbestimmung durch das menschliche Auge vermieden wird. Wie ebenfalls oben angegeben, wird durch den ausgezeichneten Farbgradienten, der sich aufgrund der beiden chromogenen Substanzen in dem Testmittel ergibt, ein derartiger subjektiver menschlicher Fehler weitgehend ausgeschaltet.

Eine spezielle Zusammensetzung eines erfindungsgemäßen Diagnostiziermittels wird in dem folgenden Beispiel beschrieben.

Beispiel

Die folgenden Komponenten wurden zur Herstellung von 100 ml eines Gemisches nach und nach miteinander vermischt

Bestandteile	Menge
1. Kaliumjodid	1g
2. Brillantblau FCF
(FD und C Blau Nr. 1)	10,4 mg
3. Destilliertes Wasser	53 ml
4. Citronensäure, wasserfrei	0,595 g
5. Natriumeitrat · 2 H2O	5,23 g
6.GantrezAN 139
(10%ige wäßrige Lösung)	10 ml
7. Polyvinylpyrrolidon
(10%ige wäßrige Lösung)	5 ml
8. Peroxidase	50 mg')
9. Glukoseoxidase	33 ml··)
*)3000 Worthington- Einheiten/mcg.
*·) 1000 Einheiten/ml.**

Man imprägnierte Filterpapier (Whatman 3 MM) mit der oben angegebenen Lösung, ließ es abtropfen und trocknete 7 min in einem Trockentunnel bei 85°C. Nachdem man es aus dem Trockentunnel entnommen hatte, tauchte man das imprägnierte Papier in eine Lösung aus 0,85 g Äthylcellulose in 100 ml Benzol. Anschließend trocknete man das Papier wieder, schnitt es in kleine Quadrate von ungefähr 5x5 mm und befestigte diese Quadrate am Ende eines flüssigkeitsundurchlässigen Streifens aus Plastikfolie von 5 mm χ 6 cm.

Die wie oben hergestellten Diagnostiziermittel wurden mit verschiedenen Urinproben, die Glukosemengen von 0 bis 2 Gew.-% enthielten, in Berührung gebracht. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Glukosekonzentration (g-%)

Farbentwicklung
in 1 min

blau

hellgrün

grün

braungrün

dunkelbraungrün

dunkelbraun

Wie aus den oben angegebenen Ergebnissen hervorgeht, wurden mit einem erfindungsgemäß hergestellten Diagnostiziermittel ausgezeichnete quantitative Ergebnisse für den Glukosegehalt erhalten. Mit einem im Handel erhältlichen Produkt bei dem o-Tolidin anstelle von Jodidsalz als Indikator verwendet wurde, war es möglich, die oben angegebenen Glukosekonzentrationen bis zu einem Wert von nicht mehr als 0,5 g-% Glukose ungefähr quantitativ abzuschätzen.

Claims

Patentansprüche:

1. Diagnostiziermittel zur halbquantitativen Bestimmung von Glukose in Urin, bestehend aus einem saugfähigen Träger, der imprägniert ist mit einer Kombination von Glukoseoxidase, einer Substanz mit Peroxidase-Aktivität und einem Indikator, der in Gegenwart von Peroxid oxidiert wird und bei dem zumindest ein Teil des Trägers überzogen ist mit einem semipermeablen hydrophoben Film, der gebildet worden ist durch Sättigung zumindest eines Teils des saugfähigen Trägers mit einer Lösung einer hydrophoben, einen semipermeablen Film bildenden polymeren Substanz in einem organischen Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator ein wasserlösliches Jodid ist und der Filmüberzug durch Verwendung einer 0,5- bis

1 %igen Überzugslösung hergestellt wurde.

2. Diagnostiziermittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen blauen Farbstoff enthält.

3. Diagnostiziermittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Puffer enthält, der das System auf einem pH-Wert von ungefähr 3,4 bis 7,2 hält.