DE2940165C2

DE2940165C2 - Glucoseindikator und Testvorrichtung mit dem Glucoseindikator

Info

Publication number: DE2940165C2
Application number: DE2940165A
Authority: DE
Inventors: Marvin A. Elkhart Ind. Genshaw
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1978-11-24
Filing date: 1979-10-03
Publication date: 1981-08-06
Also published as: GB2036963B; JPS575520B2; JPS5581597A; DE2940165B1; CA1114268A; FR2442272A1; US4211845A; GB2036963A

Description

Die Erfindung betrifft einen Diagnoseindikator zum Nachweis der Anwesenheit von Glucose in Flüssigkeiten und insbesondere ein Indikatorsystem für die Bestimmung und Bewertung von Glucose in Industrie- und Körperflüssigkeiten. Die Erfindung ist besonders für die Bestimmung der Gegenwart und der Menge von Glucose im Urin und im Blut zur Unterstützung des Arztes bei seiner Diagnose für die Behandlung von Diabetes geeignet.

Die Bestimmung von Glucose in Körperflüssigkeiten, wie Urin oder Blut, ist nicht nur bei Diabetes-Patienten erforderlich, die ihre Zuckeraufnahme kontrollieren müssen, sondern ist auch in solchen Situationen wichtig, bei denen die Untersuchung einer großen Anzahl von Personen auf Glucose im Urin oder im Blut als öffentliche Gesundheitsmaßnahme erforderlich ist. Weil eine Frühdiagnose und eine ständige Überwachung bei Diabetes so wichtig ist, muß ein Glucosetest, der für den Arzt für die Diagnose und Kontrolle von größtem Wert ist, schnell und einfach durchführbar sein, um dem Kliniker zu nützen und empfindlich genug sein, um bedeutungsvolle Veränderungen der Glucose im Urin oder Blut anzuzeigen.

Es gibt eine Anzahl an Methoden zum Bestimmen oder Bewerten der Menge von reduzierenden Zuckern in Körperflüssigkeiten. Einige ältere Methoden basieren auf der Verwendung von alkalischen Kupferlösungen, die mit dem zu untersuchenden Material erhitzt werden und dabei Kupfer(I)oxid ausfällen. Diese älteren Verfahren haben den Nachteil, daß ein gewisser Grad an Geschicklichkeit und Vertrautheit mit der Meßvorrichtung erforderlich ist und deshalb die wünschenswerte Einfachheit und Genauigkeit für eine schnelle Bestimmung nicht immer gegeben sind.

Diagnostische Tabletten verfahren, wie sie in US-PS 23 87 244 beschrieben werden, haben eine große Anwendung gefunden, weil diese Verfahren von ungeübten Personen durchgeführt werden können und sie eine billige, schnelle und einfache Methode für die tägliche Bestimmung des Urins darstellen. Obwohl die Verwendung einer Diagnosetablette gegenüber den älteren Verfahren vorteilhaft ist, ist es doch noch erforderlich, einen Versuch durchzuführen und dies bedeutet, daß eine gewisse Sorgfalt in der Zusammenstellung und bei der anschließenden Handhabung der Zusammenstellung vorliegen muß, um die Möglichkeit einer unerwünschten Wärmeerzeugung durch zufälliges Befeuchten der Diagnosetabletten zu eliminieren.

Die Entwicklung von Reagenzstreifen mit imprägnierten Stellen, welche ein Reagenzsystem enthalten, das Glucoseoxidase, Peroxidase und ein chromogenes Indikatorsystem enthält, ist ein wesentlicher und wichtiger Durchbruch für die Erzielung einer einfachen, schnellen und praktischen Methode zur Bestimmung und Bewertung der Anwesenheit von Glucose in Flüssigkeiten. In den US-Patentschriften 29 81 606, 30 92 465, 31 64 534 und 32 98 789 werden halbquantitative Messungen von Blutglucose unter Verwendung von Reagenzstreifen beschrieben, welche ein Testsystem aufweisen, das auf einer enzymatischen Reaktion von Glucoseoxidase beruht. Die Anwendung eines solchen Teststreifens ermöglicht dem Anwender eine unmittelbare Bewertung des Glucosegehaltes einer Blutprobe

so und in Verbindung mit einem Beugungscolorimeier kann man quantitative Ergebnisse erzielen, die absolut vergleichbar sind mit den älteren und wesentlich schwierigeren Laboratoriumsverfahren.

Es liegen jedoch Anzeichen dafür vor, daß einige der chromogenen Indikatoren, die man in der Vergangenheit in solchen Reagenzstreifen verwendet hat, tumorgen oder mutagen sind. Zu den verdächtigen Verbindungen gehören Stofte, wie o-Tolidin, Benzidin und 2,7-Diaminofluoren, die alle als chromogene Indikatoren für den Nachweis von Glucose in Flüssigkeiten angewendet worden sind. Deshalb besteht ein Bedarf an Indikatorsystemen, die sicherer sind als einige dieser älteren Indikatoren und die mindestens gleichwertig sind.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Glucoseindikatorsystem zu zeigen. Verbunden mit dieser Aufgabe ist es, einen verbesserten Glucoseindikator zu zeigen, der zwischen Glucose und anderen

reduzierenden Substanzen unterscheidet und der geringe Mengen an Glucose in Flüssigkeit, insbesondere in einer wäßrigen Flüssigkeit nachweist. Eine Aufgabe der Erfindung ist es auch, eine billige, schnelle und einfache Vorrichtung zum Nachweis der Gegenwart und der Menge von Glucose in einer Flüssigkeit zu zeigen und eine weitere Aufgab;- ist es, einen Glucoseindikator zu zeigen, der in der Lage ist. Glucose in einer Testprobe innerhalb eines Zeitintervalls von etwa 30 bis etwa 120 Sekunden nachzuweisen. Dabei soll erfindusgsgemäß auch ein nicht-mutagenes Indikatorsystem zum Nachweis von Glucose in Flüssigkeiten gezeigt werden.

Erfindungsgemäß wird ein Glucoseindikator gezeigt, der ein Enzymsystem enthält, welches Glucoseoxidaseaktivität aufweist, eine Substanz mit peroxidativer Aktivität und als farbbildende Substanz die durch Wasserstoffperoxid in Gegenwart der erwähnten Substanz mit peroxidativer Aktivität durch Wasserstoffperoxid oxidierbar ist, eine Mischung aus £yringaldazin und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin. Das Molverhältnis von 3,3',5,5'-Tetramethy!benzidin zu Syringaldazin kann im Bereich von etwa 1 : 8 bis etwa 8 :1 liegen, wobei ein bevorzugtes Verhältnis dieser Indikatoren im Bereich von 2:6 bis 1:1 und insbesondere 3:5 beträgt. 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin ist nicht-tumorogen und nicht-mutagen, Syringaldazin ist strukturell nicht mit irgendeinem bekannten Carzinogen oder Mutagen verwandt. Vorteilhafterweise ergibt die Kombination von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin und Syringaldazin einen Glucoseindikator, der in einem entsprechend ausgebildeten Instrument in der Lage ist, quantitativ Gesamtblutglucosewerte im Bereich von 10 bis 40 mg/100 ml quantitativ zu messen.

Andere und weitere Ziele, Vorteile und Ausluhrungsformen der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor.

Die Figur ist eine grafische Darstellung, welche die Beziehung zwischen drei Reagenzstreifen (hergestellt gemäß Beispiel II) und DEXTROST1X®-Reagenzstreifen (Arnes Company, Elkhart, Indiana/USA) zeigt.

Nachfolgend bedeutet der Ausdruck »Flüssigkeit« Körperflüssigkeiten, wie Blutserum, Blutplasma, Urin, Rückenmarksflüssigkeit und darüber hinaus auch wäßrige Lösungen, die Harnstoff enthalten. Obwohl die häufigste und bevorzugteste Anwendung der erfindungsgemäßen Testvorrichtung und des Verfahrens bei Körperflüssigkeiten, wie Blut und Urin, liegt, ist es doch ersichtlich, daß die Testvorrichtung auch auf Industrieflüssigkeiten in gleicher Weise anwendbar ist.

Im weitesten Sinne umfaßt die Erfindung ein Indikatorsystem aus einem Enzymsystem mit Glucoseoxidaseaktivität und einer Substanz, die eine Farbänderung zusammen mit einer oder mehreren Verbindungen, die sich während der Reaktion des Enzyms mit den bei der Reaktion mit der Glucose enthaltenden Flüssigkeit gebildeten Verbindungen bilden, ergibt. Bei einem Versuch wird Glucose in einer Flüssigkeitsprobe in Gluconsäure überführt. Wasserstoff, der durch Glucoseoxidase von der Glucose entfernt wird, vereint sich mit atmosphärischem Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid. In Gegenwart der Peroxidase oxidiert Wasserstoffperoxid Jen Indikator und bildet die für den Nachweis erforderliche Färbung.

Anwendbare Glucoseenzyme sind solche, die mit der zu prüfenden, glucosehaltigen Flüssigkeit ein vorbestimmtes Reaktionsprodukt, wie Wasserstoffperoxid, bilden. Man kann z. B. Glucoseoxidase aus Schimmel verwenden. Diese werden im allgemeinen als flavoproteinartig bezeichnet, weil sie als prostetische Gruppe oder als Coenzymin Flavin oder Isoalloxazin enthalten.

Vorzugsweise ist ein zweifaches Enzymsystem anwesend: Ein Enzym wandelt Glucose unter Bildung von Wasserstoffperoxid um, während das andere Enzym peroxidative Aktivität aufweist Substanzen mit peroxidativer Aktivität, die. erfindungsgemäß verwendet werden können, können aus verschiedenen organischen

ίο oder anorganischen Quellen gewählt werden. Pflanzenperoxidase, wie Meerrettichperoxidase oder Kartoffelperoxidase, können angewendet werden. Anorganische Verbindungen mit Peroxidaseaktivität schließen Jodide, wie Natrium- und Ammoniumjodide, und Molybdate, wie Kalium- und Ammoniummolybdate, ein. Darüber hinaus kann man Urohämin und eine Anzahl anderer Porphyrinsubstanzen mit peroxidativer Aktivität anwenden. Weitere Substanzen, die keine Enzyme sind, aber peroxidative Aktivität aufweisen, wie Verbindungen vom Typ des Eisensulfocyanats, Eisentannats, Ferriferrocyanids, Kaliumchromsulfats und dergleichen, können auch verwendet werden.

Die farbbildende Mischung gemäß der Erfindung die mit der Peroxidase und peroxidaseähnlichen Substanzen unter Bildung einer Farbe in Gegenwart von Wasserstoffperoxid reagiert, ist eine Mischung aus 3,3',5,5'-TetramethyIbenzidin und Syringaldazin in einem Molverhältnis von etwa 1 : 8 bis etwa 8 : 1. wobei das bevorzugte Verhältnis dieser farbbildenden lndikatoren zwischen etwa 2 : 6 bis 1 :1 und vorzugsweise bei 3:5 liegt. Die farbbildende Mischung ergibt ein Farbspektrum im Bereich von hellgrün, entsprechend etwa 25 mg Glucose/100 ml Blut, über mittelpurpur, entsprechend etwa 100 mg Glucose/100 ml Blut, bis zum dunkelpurpur, entsprechend etwa 400 mg Glucose/ 100 ml Blut. In einfacher Weise erhält man ein Spektrum mit einer ausgeprägten Farbschattierung für die unterschiedlichen Glukosemengen. Obwohl die einzelnen Indikatoren als brauchbar für die Bestimmung von Glucose bekannt sind, ergibt die spezielle Kombination einen erheblichen Vorteil bei der Technik zum Erzielen von genau reproduzierbaren Ablesungen bei gegebenen Glucosemengen und ergibt einen Farbbereich, der mit handelsüblichen colorimetrischen Ausrüstungen abgelesen werden kann.

Da die für die Messung der Glucose im Blut verwendete Zusammensetzung z. B. bei einem pH im Bereich von pH 4 bis pH 7,5 gehalten werden soll, wird für diesen Zweck ein Puffersystem aus tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan, Malonsäure und Dinatriummalonat rr.it Vorteil angewendet.

Ein Copolymer aus Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid kann zur Bildung des Glucoseindikators der vorliegenden Erfindung geeignet sein. Ein solches Copolymer wird unter dem Handelsnamen GANTREZ AN von der GAF Corporation vertrieben. Wird dieses Copolymer in einem Alkohol gelöst, so bildet es ein teilverestertes Derivat und wird das Copolymer in Wasser gelöst, so bildet es ein Säurederivat. Da die erfindungsgemäß hergestellten Testvorrichtungen typischerweise aus wäßrig-alkoholischen Lösungen der Testverbindungen hergestellt werden, enthalten sie entweder ein Säurederivat oder ein teilverestertes Derivat oder eine Mischung der Derivate. Die Gegenwart des vorerwähnten Copolymerderivats, zusammen mit Polyvinylpyrrolidon mit z. B. einem Molekulargewicht von etwa 40 000, verstärkt die Farbe ganz erheblich, wenn farbbildende Indikatoren durch

Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Pcroxidnse oxidiert werden. Diese Farbverstärkung macht eine noch schärfere Unterscheidung der verschiedenen Farbschattierungen für unterschiedliche Glucosegehaltniveaus in einer gegebenen Flüssigkeitsprobe möglich. Dies ist für den Arzt besonders wichtig, der einen beginnenden diabetischen Zustand diagnostizieren muß.

Der erfindtungsgemäße Glucoseindikator kann in Form eines behandelten Papiers, von in Flaschen befindlichen Reagentien, zerbrechbaren Kapseln, welche den Indikator in Reagenzform enthalten, eine Pille oder eine Tablette, die man in Wasser oder Alkohol gibt, oder die man zu der auf Glucose zu untersuchende Flüssigkeit gibt, oder als fester alkoholischer Gel, der das Reagenz enthält, vorliegen.

Als Pille oder Tablette kann der Indikator eine wärmeerzeugende Substanz enthalten, wie Litniurnchiorid, "wodurch beim Einbringen in Wasser Wärme erzeugt wird und sich dadurch die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht.

Ein bevorzugter Glucoseindikator wird hergestellt, indem m&n eine geeignete Trägermatrix mit der Glucoseindika'.orzusamniensetzung in Form eines flüssigen Reagenzes behandeil. Der Ausdruck »Trägermatrix« bezieht sich auf wasseraufnehmende und nichtwasseraufnehmende Matrizes, die unlöslich sind und ihre strukturelle Integrität beibehalten, wenn sie Wasser oder anderen physiologischen Flüssigkeiten ausgcsel/l werden. Geeignete wasseraufnehmende Matrizes sind Papier, Zellulose. Holz, synthetische Harzvliese, gewebte und nicht-gewebte Vliese und dergleichen. Matrizes, die kein Wasser aufnehmen, sind Glasfasern und organische plastische Materialien, wie Polypropylen und dergleichen. Die Trägermatrix kann getränkt, eingetaucht, besprüht oder mit dem flüssigen Reagenz bedruckt werden und anschließend wird die Trägermatrix in geeigneter Weise getrocknet. / B. in der Umgebung oder durch Luftumwälztrocknung. Die Matrix kann in geeigneter Weise an einem unlöslichen Trägeneil befestigt werden, z. B. einem organoplastischen Streifen, der beispielsweise aus Polystyrol besteht, und die Befestigung kann in geeigneter Weise. z. B. durch zweiseitig klebendes Klebeband erfolgen.

Wird die Testzusammensetzung zum Nachweis von Glucose im Blut angewendet, so wird die Oberfläche der imprägnierten Trägermatrix normalerweise mit einem halbdurchlässigen transparenten Schutzfilm aus Äthylzellulose oder einem anderen geeigneten Material überzogen. Dies kann man vornehmen indem man eine Schicht aus Äthylzellulose, gelöst in Benzol, aufbringt. z. B auf die Oberfläche der imprägnierten Trägermatrix, und dann das Lösungsmittel durch Verdampfungstrocknung entfernt.

('.Iiirnseindikatoren in Form von behandelten Traeermatrizes werden oft vor Gebrauch über erhebliche Zeiträume gelagert und deshalb ist es wünschenswert, daß man Reagentien wählt, die nicht leicht an der Luft autoxidabel sind. Es ist auch zweckmäßig, die Trägermatrix ve Licht zu schützen und in einigen Fällen ist es wünschenswert, die Trägermatrix in feuchtigkeitsabweisenden Verpackungen, die erst kurz vor ihrer Anwendung geöffnet werden, aufzubewahren. Die Reagenzbestandteile können auch so gewählt werden, daß man unterschiedliche Grade der Empfindlichkeit erhält. Durch eine geeignete Wahl der Reagentien können verschiene Farben gebildet werden, welche verschiedene Konzentrationen an Glucose anzeigen anstelle nur einer Farbe, die in der Farbiniensität variiert.

Gewünschtenfalls kann eine Träsrermairix so behandelt werden, daß sie eine Hintergrundfärbung mit einer bestimmten Farbe aufweist, z. B. gelb, so daß die Farbe, die durch die Testreaktion gebildet wird, sich mit der Hintergrundfarbe mischt und unterschiedliche Färbun-■> gen ergibt, die den Konzentrationen der zu untersuchenden Flüssigkeit oder Lösung entspricht. Es kann besonders wünschenswert sein, die Matrix gelb zu färben, wenn die gebildete Farbprobe blau ist.
Für ganz genaue Bestimmungen von Glucosekonzen-

to trationen kann man eine fotoelektrische Colorimetric oder Spektrofotometrie zur Bestimmung der Farbanzeigung anwenden. Das EYETONE-Beugungscolorimeter (Arnes Company. Devision of Miles Laboratories Inc.) ist ein tragbares Instrument, das zur quantitativen

1") Messung der Gesamtblutglucose bestimmt ist. zusammen mit DEXTROSTIX®-Reagenzstreifen (Arnes Company, Devisiun of Miles Laboratories Inc.). Das EYETONE-Beugungscolorimcter mißt das an der Oberfläche der Reagenzfläche des Reagenzstreifens reflektierte Licht und wandelt diese Messung durch eine elektronische Schaltung in eine Ablesung um. die genau an einer kalibrierten, metrischen Skala des Instrumentes ablesbar isi und Blutglucose im Bereich von 10 bis 400 mg/100 ml anzeigt. Ie höher die Menge an

2¹S Blutglucose, um so dunkler ist der Streifen und um so weniger Licht wird reflektiert. Umgekehrt ist bei einem niedrigeren Blutglucoseniveau der Streifen heller und die Lichtreflektion größer. Die hier beschriebene, farbbildende Mischung ist besonders geeignet, weil sie

jo eine einzigartige Farbansprechiing ergibt, die mit dem EYETONE-Beugungscolorimeter in gleicher Weise gemessen werden kann, wie bei DEXTROSTIX-Reagenzstreifen Alternate kann man halbquantitalive Ergebnisse erzielen, wenn man den erfindungsgemäßen

i> Glucoseindikator anwendet und die Farbe dann mit einer Skala von Standardfarben vergleicht. d:e man mit bekannten Glucosekonzcntralionen unter Anwendung des gleichen Glucoseindikators erzielt hat.

Wie bereits erwähnt, kann man den crfindungsgemä-Ben Glucoseindikator anwenden, um die Gegenwart oder die Menge an Glucose in biologischen Flüssigkeiten, wie Urin oder Blut, festzustellen, jedoch ist der Indikator in gleicher Weise auch zur Bestimmung und Messung von Glucose in nicht-biologischen Flüssigkeiten. wie in Flüssigkeiten, die bei der Herstellung von Bier. Trockeneis, Getränkesirupen und dergleichen gebildet werden, geeignet.

Zur näheren Erläuterung der Erfindung dienen die nachfolgenden Beispiele, die aber nur den Umfang der Erfindung wiedergeben sollen, ohne diese zu beschränken.

Beispiel I

Ein Filterpapier (Eaton und Dikeman Nr. 204) wurde mit der nachfolgenden Lösung imprägniert:

Material

Menge

destilliertes Wasser 40 ml

Äthanol 40 ml

5%ige Lösung von GANTREZ AN-139 52 ml

(Stabilisator der GAF Corporation.
New York, N.Y. USA)

tris-Malonatpuffer (2,8 molares tris-Amin, 32 ml 1,4 molare Malonsäure,
1,4 molares Malonat)

1-orisel/mm

M ale ri;i I

Menge

Polyvinylpyrrolidon (10%ig in Wasser) 28 ml

Peroxidasc in 4,3 ml Glucoseoxidase 200 mg

(1000 Einheiten/ml)

und 19,3 ml destilliertes Wasser

Das imprägnierte Filterpapier wurde bei 6O⁰C getrocknet. Anschließend wurde das Papier imit einer Lösung imprägniert, die 1,5% Äthylzellulose !(Gewicht pro Volumen) in einer 4 : I Chloroform-Melhanol-Mischung. enthaltend 7,5 mmol 3,3'.5,5'-Tetramethylben/idin und 12,5 mmol Syringaldazin, enthielt. Das so imprägnierte Papier wurde bei 50"C getrocknet und zu Streifen geschnitten, die mittels eines beidseitig klebenden Klebebandes auf Polvstyrolstreifen geklebt wurden.

Blutproben mit bekanntem Glucosegehalt wurden unter Anwendung der so hergestellten Streifen geprüft und /um Ablesen der entstandenen Farben wurde ein EYETON-Beugungscolorimeter verwendet. Vor der Anwendung war das EYTON E-Beugungscolorimeter mit neutralen Dichtekalibrierungschips und einem Glucosekalibrator kalibriert worden. Die niedrigste und die höchste Ablesung des EYETONE-Beugungscolonmeters wurde bei 50 und 400 mg/dl mit zwei neutralen Dichtekalibrierungschips eingestellt. Die Kalibrierung des Instrumentes wurde geprüft, indem man den Streifen mit einer Standardglucoselösung (130 mg/dl) während 1 Minute behandelte und dann die Ablesung auf dem EYETONE-Beugungscolorimeter ablas. Abweichungen wurden mittels eines Einstellkopfs so reguliert, daß die Einstellung 130 mg/di betrug.

Zum Ablesen der Streifen wurde folgende Verfahrensweise angewendet. Gesamtblut wurde mit einer Augenpipette auf den Streifen aufgebracht und 60 Sekunden reagieren gelassen. Danach wurde der Streifen mit Wasser gewaschen, trockengepreßt und unmittelbar danach mit einem kalibrierten EYETONE-Beugungscolorimeter abgelesen. Eine Eintragung erfolgte mit den bekannten Glucosewerten und dagegen wurden die Werte aufgetragen, die man mit dem Streifen des vorliegenden Beispiels erzielt hatte und dabei erhielt man eine gerade Linie mit einer Neigung von 0. +4. einer Unterbrechung bei 7,9 (intercept of — 7.9). einem /? = 0.99 und einer durchschnittlichen Standardabweichung von 7.4.

Wurden Versuche in gleicher Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, unter Verwendung von Dimethylaminoantipyrin. Aminoantipyrin oder Naphthalinindigo als iSfuuiiucnucS fvidtenSi. SO wüfuC eine fiicia äuSi cicfifiide Farbbildung beobachtet.

Beispiel II

Drei verschiedene Papierformulierungen wurden aus den folgenden Grundzusammensetzungen bereitet:

Eine erste imprägnierte Lösung wurde hergestellt aus den folgenden drei Lösungen. Lösung (a) enthielt 0.4 g des Natriumsalzes von Syringaldazin, zugegeben zu 35 ml heißem Wasser, und dazu wurden 3 g Polyvinylpyrrolidon gegeben. Lösung (b) enthielt 0.1 g Tetramethylbenzidin. 8 ml heißes Wasser, 25 ml Äthanol 12 ml 10⁰/oige (w/v) GANTREZ AN-139 und 20 ml 15 m Zitratpuffer, pH 4.8. Lösung (c) enthielt 0.8 ml Glucoseoxidase (5.Ox 10³IUZmI) und 123 mg Meerrettichperoxidase (90,81U/mg). Lösung (b) wurde zu Lösung (a) gegeben und zu dieser Mischung wurde Lösung (c) gegeben. Der End-pH der entstandenen Imprägnierlösung betrug 5,0 und es bildete sich in der Lösung eine Syringaldazinsuspension.

Eine zweite Imprägnierlösung wurde hergestellt aus 1,75% (w/v) Äthylzellulose in Chloroform.

Imprägniertes Papier wurde hergestellt, indem man E&D 204-Papier (Eaton und Dikeman) zuerst mit der ersten Imprägnierlösung sättigte und 15 Minuten bei 80⁰C in einem Umwälzofen trocknete. Das Papier wurde dann ein zweites Mal mit der nicht-wäßrigen zweiten Imprägnierlösung gesättigt und 10 Minuten bei 40⁰C getrocknet. Das imprägnierte Papier wurde auf einen Träger aus Plastik in solcher Weise aufgebracht, daß sich eine Matrix von 5x10 mm an einem Ende des Trägerteils befand.

Drei verschiedene Papierformulierungen wurden wie folgt hergestellt:

Papier 1 wurde wie beschrieben hergestellt.

Papier 2 wurde hergestellt wie beschrieben, mit der Ausnahme, daß als Lösung (b) eine solche verwendet wurde, die kein Telramethylbenzidin 2", enthielt.

Papier 3 wurde wie beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß als Lösung (a) eine solche verwendet wurde, die kein Syringaldazin enthielt.

in Blutproben mit einem bekannten Glucosegehalt wurden geprüft unter Verwendung von Streifen, die aus dem so hergestellten imprägnierten Papier zubereitet worden waren und die entstandenen Farben wurden mit einem EYETONE-Beugungscolorimeter abgelesen. Vor

jj der Anwendung war das EYETONE-Colorimeter mit neutralen Dichtechips und einem Glucosekalibrator kalibriert worden. Die niedrigste und die höchste Ablesung des EYETONE-Beugungsco'orimelers wurden bei 50 und bei 400 mg/dl mil zwei neutralen

au Dichtechips eingestellt. Die Kalibrierung des Instrumentes wurde kontrolliert durch Ablesen von DEX-TROSTIX-Sireifen mit einer Standardglucoselösung (130 mg/dl) während einer Minute und Ablesen mittels des EYETONE-Beugungscolorimeters. Abweichungen

•n wurden durch Einstellung des Kontrollknopfes auf 130 mg/dl eingestellt.

Zum Ablesen der Streifen wurde folgende Verfahrensweise angewendet: Gesamtblut wurde mit einer Augenpipette auf die Strafen aufgebracht und 60 Se-

H) künden reagieren gelassen. Nach dieser Zeit wurden die Streifen mit Wasser gewaschen, trockengepreßt und mit dem kalibrierten EYETONE-Beugungscolorimeter 20 Sekunden nach dem Waschen abgelesen. Diese Streifen wurden hinsichtlich ihres Verhaltens mit den DEXTROSTIX-Streifen verglichen, die in gleicher Weise behandelt worden waren, mit der Ausnahme, daß die Ablesungen unmittelbar nach dem Waschen erfolgten, wie dies in der Gebrauchsabweisung gefordert wird-

bf) Streifen aus den Papieren 1. 2 und 3 sowie aus DEXTROSTIX-Reagenzstreifenstandard wurden mit Gesamtblullösungen geprüft, welche Glucose in Mengen von 62 mg/dl, 130 mg/dl, 165 mg/dl und 270 mg/dl enthielten und die Ergebnisse werden in F i g. 1 gezeigt.

hS Es ist ersichtlich, daß die Formulierung, weiche eine Mischung aus Tetramethylbenzidin und Syringaldazin enthielt in guter Übereinstimmung war mit den zur Zeit im Handel befindlichen DEXTROSTIX-Reasenzstrei-

fen und dem EYETON E-Beugungscolorimeter, während die Einzelindikatoren unbefriedigende Übereinstimmungen ergaben.

Beispie! Ill

Filterpapier (Eaton und Dikeman Nr. 204) wurde mit der folgenden Lösung imprägniert:

Material

Menge

destilliertes Wasser 20 ml

Äthanol 20 ml

5%ige Lösung von GANTREZ AN-139 26 ml

tris-Malonatpuffer (2,8 rnol tns-Arnin, 16 ml

1,5 mol Malonat)

Polyvinylpyrrolidon (10% in Wasser) 14 ml

Meerrettichperoxidase in 1,5 ml Glucose- 100 mg oxidase (1221 U/ml) in 9,7 ml destilliertem Wasser

Das imprägnierte Filterpapier wurde bei 60⁰C getrocknet. Anschließend wurde das getrocknete Filterpapier mit einer Lösung imprägniert aus 1,5°'o Äthylzellulose (w/v) in einer 4 :1 Chloroform-Methanol-Mischung, enthaltend 7,5 mmol Tetramethylbenzidin und 12,5 mmol Syringaldazin.

Das imprägnierte Papier wurde bei 5O⁰C getrocknet und zu Streifen geschnitten, die dann auf Polystyrolträger mittels eines doppelseitig klebenden Klebebandes aufgebracht wurden.

Farbchips, entsprechend Biulgiucosemengen von 25, 45, 90, 130, 175 und 250 mg/dl wurden ausgewählt. Lösungen aus Glucose in Blut mit Glucosemengen von 25, 45, 90, 130, 175, 250 und 350 mg/dl wurden hergestellt. Zwei Personen wurden gebeten, die Streifen abzulesen, indem sie Blut auf die Streifen mit einer Augenpipette aufbrachten, die Umsetzung für eine Minute ablaufen ließen, mit Wasser wuschen und die Farbe gegenüber den Chips verglichen (die Lösungen waren für die Ableser nur durch Buchstaben unterscheidbar). Folgende Ergebnisse wurden erzielt

Lösung

(Glucosekonzentration in mg/dl)

Ableser 1

Ableser 2

A (90)
B (250)
C (45)
D (130)
E (90)
F (25)
G (90)
II (350)
1(25)
J (130)
K (175)

130
250

45
130
130

90
250

25
175
130

130
250

45
130
130

25

90
250

25
130
175

Obwohl die Übereinstimmung nicht perfekt ist, ist die Verwendung der Streifen zur qualitativen Bestimmung von Glucosemengen im Blut zusammen mit den Farbchips möglich.

Aus dem folgenden geht hervor, daß es erfindungsgemäß möglich ist, alle die vorerwähnten Aufgaben und Ziele der Erfindung zu erreichen, zusammen mit anderen Vorteilen, die den System anhaften. Die Erfindung stellt somit eine verbesserte Verfahrensweise zur Bestimmung von Glucose dar. Das gezeigte Glucoseindikatorsys'.em ist einfach, billig, schnell und leicht anwendbar.

Für den Fachmann ist ersichtlich, daß eine Reihe von Additiven den Reagenzlösungen zugegeben werden können. Solche Additive sind geeignete Konservierungsstoffe, Verdickungsstoffe, Befeuchtungsstoffe, Suspensionsmittel und dergleichen, sowie auch inerte Farben, um einen gleichmäßigen Farbhintergrund zu schaffen. Anstelle eines Überzugs aus Äthylzellulose können andere Überzugszusammensetzungen, wie Hydroxyäthylzellulose, Zelluloseacetat, Zellulosebutyrat, Zellulosenitrat, Zelluloseacetat, -propionat und dergleichen in Form eines halbdurchlässigen Films oder Überzugs verwendet werden.

Eine Reihe weiterer Modifikationen und Veränderungen sind möglich, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Glucoseindikator aus Glucoseoxidase, einer Substanz mit Peroxidaseaktivität und einer durch Wasserstoffperoxid in Gegenwart der Peroxidase farbbildenden Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß die farbbildende Substanz eine 'Mischung aus 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin und Syringaldazin ist.

2. Glucoseindikator gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin und Syringaldazin in einem Molverhältnis von etwa 1/8 bis etwa 8 :1 vorliegen.

3. Glucoseindikator gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 3,3',5,5'-Teti^-amethylbenzidin und Syringaldazin in einem Molverhältnis von etwa 2 : 6 bis etwa 1 :1 vorliegen.

4. Glucoseindikator gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin und Syringakiazin in einem Molverhältnis von 3 :5 vorliegen.

5. Testvorrichtung, gekennzeichnet durch eine Trägermatrix, welche einen Glucoseindikator gemäß Ansprüchen 1 oder 2 enthält.

6. Testvorrichtung zur Bestimmung von Glucose in einer Flüssigkeit aus einem feuchtigkeitsaufnehmendcn Material, welches eine Mischung enthält, die im wesentlichen aus einem Enzymsystem besteht, das eine Substanz mit Glucoseoxidaseaktivität, eine Substanz mit peroxidativer Aktivität, Polyvinylpyrrolidon, ein Derivat eines Copolymers aus Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid, ein Puffersystem, bestehend im wesentlichen aus einem tris-(Hydroxymethyl)-aminmethan, Malonsäure und Dinatriummalonat und einer Indikatormischung, die in Gegenwart einer Peroxidase und einer Substanz mit peroxidativer Aktivität oxidiert wird und die dabei ihre Farbe verändert, enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Indikatormischung im wesentlichen aus einer Mischung aus 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin und Syringaldazin in einem Molverhältnis von etwa 1 : 8 bis 8 :1 besteht.

7. Testvorrichtung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Testvorrichtung eine halbdurchlässige Beschichtung aus einem transparenten Äthylzellulosefilm über dem imprägnierten, wasseraufnahmefähigen Material enthält.