DE60123841T2

DE60123841T2 - Hygieneüberwachung

Info

Publication number: DE60123841T2
Application number: DE60123841T
Authority: DE
Inventors: J. Steven Arlington SAUL; Cheryl B. Assonet FRANCISCO; Robert J. Brentwood MARKOVSKY; S. Robert Reading SALTER; E. Stanley Boston CHARM
Original assignee: Charm Sciences Inc
Current assignee: Charm Sciences Inc
Priority date: 2000-08-01
Filing date: 2001-08-01
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2021-08-02
Also published as: US20070154973A1; US20040028608A1; EP1358459A4; EP1358459B1; US7229783B2; DE60123841D1; AU2001283066A1; WO2002010708A2; EP1358459A2; ATE342497T1; WO2002010708A3

Description

Sauberkeit spielt an industriellen Stätten sowie an Stätten der Gesundheitsfürsorge eine entscheidende Rolle. Wesentliche Quellen mikrobieller Kontamination sind die Oberflächen der Ausrüstung, die zum Umgang mit, der Lagerung oder der Weiterverarbeitung von Nahrungsmitteln verwendet werden. Solche Kontamination kann zu einer verringerten Haltbarkeit von Produkten führen und, falls Pathogene vorhanden sind, zur Übertragung von Krankheit. Mikrobielle Kolonien entwickeln sich schnell. Kontinuierliche Überwachung von Oberflächen, z.B. eine Überwachung der Hygiene, kann vor der Ausbreitung einer Krankheit schützen.
Historisch betrachtet wurde die mikrobielle Kultivierung zur Bestimmung der Anwesenheit von Mikroorganismen eingesetzt. Diese Kultivierung ist jedoch zeitaufwendig und die in Echtzeit erforderliche Rückkopplung („real-time feedback") zum Reinigungspersonal und dem Personal für Herstellung von Nahrungsmitteln ist deshalb nicht verfügbar. Folglich kann ein Nahrungsmittel, das Oberflächen ausgesetzt war, für die später festgestellt wird, dass diese potentiell gefährliche Mikroorganismen enthalten, in die Nahrungsmittelversorgung eintreten.
Chromatographische Lateralfluss-Teststreifen wurden für eine Vielzahl diagnostischer Zwecke verwendet. Der hier beschriebene Test verwendet einen Lateralfluss-Teststreifen, um ein Mittel zur schnellen, sensitiven, nutzerfreundlichen Hygieneüberwachung von Oberflächen bereitzustellen. Material, das von einer Oberfläche abgetupfert wurde, kann durch Reaktionen detektiert werden, die die hier beschriebenen Reaktionswege einbeziehen.
Jüngste Aufmerksamkeit richtete sich auf die Probleme von Biofilmen. Biofilme werden erzeugt, wenn Mikroorganismen auf eine Oberfläche gelangen und an deren mikroskopischen Rissen und Spalten anhaften. Der Organismus beginnt zumeist unmittelbar mit der Erzeugung eines Polysaccharid-artigen Materials, welches innerhalb von Stunden als Klebstoff zur Anheftung von Bakterien und Viren an die Oberfläche wirkt. Die Biofilme sind gegen routinemäßig eingesetzte Sanitärtechniken resistenter als ihre freilebenden Ebenbilder. Es ist daher entscheidend, schnelle Ergebnisse zu liefern, bevorzugt innerhalb weniger Minuten.
Nahrungsmittel-Rückstände auf Oberflächen sind Nährstoffe für das schnelle Wachstum von Mikroorganismen und für den sich potentiell ergebenden Biofilm. Solche Nahrungsmittel-Rückstände sind ebenfalls eine Quelle für die Kreuzkontamination für andere Nahrungsmit telprodukte, die später der gleichen Kontaktoberfläche ausgesetzt sind. Eine einwandfreie Überwachung der Hygiene sollte daher die Detektion eines breiten Bereiches an Kontaminanten, einschließlich der Biofilme als auch rückständiger Nahrungsmittel, einschließen.
Während der 1990-er Jahre wurden verschiedene schnelle und effektive Testverfahren und -vorrichtungen zur Detektion der Kontamination von Oberflächen entwickelt. Solche Verfahren detektieren die Mikroben nicht direkt sondern detektieren stattdessen Marker, wie beispielsweise ATP, die ein Indikator für entweder die Anwesenheit von Mikroben oder das Vorkommen einer Kontamination durch ein rückständiges Nahrungsmittel auf einer Oberfläche sind.
Eine solche Vorrichtung ist der POCKETSWAB^® (POCKETSWAB^® ist eine eingetragene Marke von Charm Sciences, Inc. aus Lawrence, Massachusetts), die auf Oberflächen schnell und effizient ATP detektiert. Die POCKETSWAB^®-Vorrichtung detektiert ATP über die Reaktion von Luciferin und Luciferase, die/das in Gegenwart von ATP Licht emittiert. Die Lichtemission wird unter Verwendung eines Luminometers gemessen. Es ist erwünscht und die primäre Aufgabe dieser Erfindung, einen schnellen visuellen Test zur Überwachung der Hygiene bereitzustellen und dabei den Bedarf nach einem Luminometer oder anderen Lesegeräten abzuschaffen.
Auf dem Gebiet sind verschiedene Tests erhältlich, die ein schnelles und sichtbares Ergebnis bereitstellen und dabei den Grad der Sauberkeit der Oberfläche reflektieren. Solche Tests sind für die Verwendung in beispielsweise Restaurants und Supermärkten von Interesse, in denen ein Instrument zum Auslesen von Ergebnissen nicht akzeptabel wäre, entweder aufgrund des erforderlichen großen Volumens oder weil diese nicht gesichert werden können oder aufgrund der fehlenden Einfachheit bei der Verwendung.
Ein solcher Test wird durch Celsis International, PLC aus Cambridge, United Kingdom unter der Marke SPOTCHECK^TM vermarktet. Das SPOTCHECK^TM-Gerät verwendet eine zyklische „Komproportionierungs"-Reaktion, um ATP zu detektieren (siehe US-Patent Nr. 6,043,047, erteilt am 28. März 2000, und die internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 00/36139, veröffentlicht am 22. Juni 2000).
Ein Beispiel für ein Verfahren zur Detektion von anorganischem Phosphat wird durch N. Conrath et al., „A novel enzyme sensor for the determination of inorganic phosphate", Analytica Chimica Acta 309 (195) 47–52 (1995), beschrieben. Dieses Verfahren erfordert jedoch erfahrenes Laborpersonal, ist zeitaufwendig und erfordert eine (entsprechende) Ausrüstung.
Ein Verfahren zur Detektion von Kohlenhydrat in einer Probe wird durch Johnson J.A. & Fusaro R.M (1979), Analytical Biochemistry, Band 98, Seiten 47–52, beschrieben, welches sich auf die spezifische Bestimmung des Kohlenhydrat-Anteils im Rattenleber-Homogenat in einem einzelnen Schritt unter Verwendung aufgereinigter Amyloglucosidase bezieht.
Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, einen Test zur Abdeckung eines breiten Spektrums bereitzustellen, um die Hygiene einer Oberfläche durch Detektion einer Vielzahl an organischen und anorganischen Materialien, Nahrungsmittel-Rückständen und Mikroorganismen zu überwachen.
Zusammenfassung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist eine neue und verbesserte, Nutzer-freundliche und ein breites Spektrum abdeckende Testvorrichtung, ein -system und ein angepasstes -verfahren, die/das so angepasst wurde, dass sie/es eine visuelle Bestimmung von Oberflächenkontamination bereitstellt. Es ist Ziel des Tests, schnell – innerhalb einer Minute – die Anwesenheit bestimmter biologischer Materialien zu detektieren, die Indikatoren einer nicht-einwandfreien oder nicht-adäquaten Reinigung und Sauberkeit darstellen. Die Testergebnisse sind qualitativ; ein positives Ergebnis deutet die Anwesenheit von Rückständen und die Notwendigkeit einer Säuberung an.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Überwachung der Hygiene einer Oberfläche bereitgestellt, die frei von der Gegenwart biologischer Kontamination sein soll, wobei das Verfahren umfasst: (a) Gewinnen einer Probe von dieser Oberfläche; (b) Zugabe eines oder mehr Reagenzes/ien zu der Probe zur Umwandlung eines Kohlenhydrats in freie Glucose und (c) Detektion der Gegenwart oder Abwesenheit von freier Glucose in dieser Probe, wobei die Gegenwart dieser freien Glucose ein Indikator für die Kontamination auf der Oberfläche ist. Bevorzugt wird die biologische Kontamination aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus: Nahrungsmittel-Rückständen, Mikroorganismen und einer Kombination aus Nahrungsmittel-Rückständen und Mikroorganismen.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Vorrichtung zur Detektion biologischen Materials in einer flüssigen Probe bereitgestellt, wobei die Vorrichtung umfasst: (a) ein Flüssigkeits-absorbierendes Material zur Aufnahme der Probe; (b) Reagenzien zur Umwandlung des biologischen Materials in freie Glucose und (c) Reagenzien zur kolorimetrischen Detektion dieser freien Glucose.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein Reaktionsschema, das zur allgemeinen Hygieneüberwachung eingesetzt werden kann;
2 ist ein Reaktionsschema, das eingesetzt werden kann, wenn die Sensitivität gegenüber dem Lebewesen-Gewebe von besonderer Wichtigkeit ist;
3A ist eine schematische Ansicht des VERICLEEN^TM-Tupfers, der aus der Testvorrichtung entnommen wurde;
3B ist eine Seitenansicht in Durchsicht des VERICLEEN^TM-Tupfers;
4 ist eine Seitenansicht des VERICLEEN^TM-Teststreifens innerhalb der optionalen Blisterverpackung, wobei die Abdeckung der Verpackung teilweise abgezogen wurde, um die Benetzungslösung und den Kapillarfluss-Teststreifen aufzudecken;
5 ist eine Seitenansicht des VERICLEEN^TM-Teststreifens, der einen Zwischenraum oder eine Lücke beinhaltet, um Diffusion von Färbemitteln zu verhindern;
6 ist eine Seitenansicht des Benetzungsmittel-Spenders, der an einem Teststreifen-Behältnis befestigt ist; und
7 ist eine Ansicht des VERICLEEN^TM-Teststreifens.
Beschreibung der Ausführungsformen
Das Ziel des schnellen, einstufigen Assaytests zur Überwachung der Hygiene ist die schnelle Detektion (innerhalb einer Minute, bevorzugt innerhalb von zwei Minuten) der Gegenwart von biologischem Material als Indikator für Reinigung und Sauberkeit. Die zwei, innerhalb des gleichen Einzeleinsatz-Tests detektierten, Materialien sind Glucose und Phosphat. Glucose wird direkt detektiert. Phosphat wird indirekt durch die Reaktion von Maltose-Phosphorylase mit Maltose und Erzeugung von Glucose detektiert.
Zum Assaysystem werden Enzyme zugegeben, um das Spektrum des Assays durch Umwandlung von biologischem Material in Glucose und optional in Phosphat zu steigern. Die Materialien werden stabilisiert, zur Entfernung von Phosphat, Adenosin-Triphosphat (ATP), Adenosin-Diphosphat (ADP), Glucose und Glucosidase aufgereinigt und in eine POCKETSWAB^®- oder eine Lateralfluss-Teststreifen-Form gebracht, die beide Einzel-Assay-Formen darstellen, die eine einfache Test-Form und eine schnelle Analyse ermöglichen.
Anorganisches Phosphat kommt in der Natur ubiquitär vor. Es ist am Energie-Metabolismus und an Aktivierungsreaktionen in Pflanzen, Lebewesen und Mikroorganismen beteiligt. Anorganisches Phosphat stellt bei vielen Verbindungen eine wichtige Komponente dar und ist, als ein wesentliches biologisches Mineral, allein in signifikanten Mengen vorhanden. Phosphate werden in der Nahrungsmittelindustrie umfangreich verwendet, einschließlich ebenfalls ihrer Verwendung als Additive in Milchprodukten, Cerealien, Fleisch(-sorten) und Softdrinks.
Entsprechend sind Kohlenhydrate, einschließlich Zuckern, in und auf biologischen Materialien in signifikanten Mengen vorhanden. Beispielsweise ist Glucose in Blut, Früchten und Honig vorhanden. Saure Phosphatase ist in bestimmten Lebewesen-Geweben endogen und alkalische Phophatase tritt in Fäkalien auf. Die Detektion von Phosphat, Phosphatase und Glucose markiert die Kontamination. Andere Kohlenhydrate, einschließlich Zuckern, können zur Detektion in Glucose umgewandelt werden. Beispielsweise kann Lactose, ein Milchzucker, durch β-Galaktosidase in Glucose umgewandelt werden. Sucrose, die in verarbeiteten Nahrungsmitteln verwendet und in Rohrzucker und Früchten und als Invertzucker in verarbeiteten Nahrungsmitteln gefunden wird, kann durch Sucrase oder Invertase in Glucose umgewandelt werden.
Der Test verwendet verschiedene Reaktionswege zur Detektion von biologischem Material. Ein Reaktionsweg verwendet Maltose und Maltose-Phosphorylase zur Detektion von Phosphat. In der Probe vorhandenes Phosphat reagiert mit Maltose und Maltose-Phosphorylase und wandelt Maltose in Glucose und Glucose-1-phosphat um. Die gebildete Glucose wird kolorimetrisch durch Verfahren detektiert, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Der Test verwendet ebenfalls zusätzliche Reaktionswege zur Steigerung der Sensitivität. Diese zusätzlichen Reaktionswege führen zu einer verstärkten Bildung von entweder Phosphat oder Glucose oder von beiden.
Der Teststreifen besteht aus Nitrozellulose, die anhaftend auf eine Polystyrol-Verstärkung gebunden ist, wobei ein Ende ein Polster mit einem die Probe absorbierenden Bereich in Flüssigkeits-Fluss-Kontakt („fluid-flow-contact") mit der Nitrozellulose aufweist und das andere Ende ein Behältnis mit einem Oberflächen-Benetzungsmittel aufweist, das optional daran angebracht ist oder darin eingebunden ist. Das Behältnis mit dem Oberflächen- Benetzungsmittel kann ebenfalls in die Verpackung des Teststreifens eingebunden sein. Das Behältnis für das Benetzungsmittel kann beispielsweise in der Form eines aufreißbaren Beutels oder eines Behältnisses mit abziehbarem Deckel vorliegen.
Innerhalb des Teststreifens befinden sich Reagenzien, die biochemische Reaktionswege zur Umwandlung von gewöhnlichem biologischen Oberflächenmaterial in Glucose und optional Phosphat bereitstellen. Ebenfalls innerhalb des Teststreifens befinden sich Reagenzien zur kolorimetrischen Detektion von Glucose. Alle Reagenzien sind stabilisiert, zur Entfernung von Phophat, ATP, ADP, Glucose und Glucosidase aufgereinigt und entweder auf den Lateralfluss-Teststreifen aufgesprüht, in das absorbierende Polster eingebunden oder mit der Benetzungslösung gemischt.
Innerhalb des Teststreifens kann ebenfalls, bevorzugt an dem Ende, das gegenüber dem die Probe absorbierenden Ende liegt, ein Bereich mit einer Positivkontrolle zur Verwendung beim Vergleich der Farbänderung und zur Bestätigung, dass ein ausreichender Probenfluss stattgefunden hat, enthalten sein.
Verschiedene Ausführungsformen umfassen Reagenzien für drei (optional, vier oder fünf oder mehr) getrennte Reaktionswege.
Reaktionsweg 1:

A. Verwendung von Apyrase zur Umwandlung von ADP und ATP in Phosphat und
B. Verwendung von Maltose-Phosphorylase zur Umwandlung von Phosphat und Maltose in Glucose und Glucose-1-phosphat.

Phosphat kann in freier Form auf einer Oberfläche oder als Phosphat in Form von ADP oder ATP auftreten. Die Phosphat-Komponente von ATP/ADP kann durch Apyrase freigesetzt werden. Apyrase enthält ADPase- und ATPase-Aktivität und kann daher ATP oder ADP in AMP und Phosphat umwandeln. Das freigesetzte Phosphat und das endogene Phosphat werden durch die Reaktion von Maltose mit Phosphat und Maltose-Phosphorylase und Erzeugung von Glucose und Glucose-1-phosphat detektiert. Die durch die Reaktion von Maltose mit Phosphat in Gegenwart von Maltose-Phosphorylase gebildete Glucose wird, wie im Reaktionsweg 3 beschrieben, detektiert.
Reaktionsweg 2: Umwandlung von Zucker in Glucose
Kohlenhydrate, einschließlich Zuckern, kommen in und auf biologischen Materialien in signifikanten Mengen vor. Zur Detektion können viele Zucker in Glucose umgewandelt werden. Beispielsweise kann Lactose, ein Milchzucker, durch β-Galactosidase in Glucose umgewandelt werden. Sucrose, die in verarbeiteten Nahrungsmitteln verwendet wird und in Rohrzucker, Früchten und als Invertzucker in verarbeiteten Nahrungsmitteln gefunden wird, kann durch Sucrase oder Invertase in Glucose umgewandelt werden. Die durch diese Reaktionen gebildete Glucose wird, wie im Reaktionsweg 3 beschriebe, detektiert.
Reaktionsweg 3: Detektion von Glucose
Im Stand der Technik sind Reaktionen zur kolorimetrischen Detektion von Glucose gut bekannt. Beispielsweise werden β-D-Glucose + O₂ + H₂O durch Glucose-Oxidase in D-Glucon-δ-Lacton + H₂O₂ umgewandelt. Das durch die oben gezeigte Reaktion gebildete Wasserstoffperoxid wandelt, in Verbindung mit einem Peroxidase-Enzym, wie beispielsweise Meerrettich-Peroxidase, ein farbloses Substrat in einen Farbstoff, der leicht sichtbar ist, um. Es kann eine Mutarotase enthalten sein, um die Sensitivität durch Umwandlung von α-D-Glucose, verknüpft mit Phosphorylierung, zu β-D-Glucose zur Umsetzung mit der Glucose-Oxidase zu steigern.
Andere Reaktionswege:

A. Glucosephosphat, wie beispielsweise Glucose-1-phosphat, das durch die Reaktion von Maltose mit Phosphat und Maltose-Phosphorylase gebildet wird, Reaktionsweg 1B, oder das anders in der Probe enthalten ist, kann durch Phosphatase, beispielsweise saure Phosphatase, gespalten werden, um sowohl Glucose als auch Phosphat zu erzeugen. Die Bereitstellung von Phosphatase als Testreagenz steigert daher die Sensitivität des Tests.
B. In bestimmten Umgebungen ist die Detektion von Phosphatase wichtig. Zur Detektion von Phosphatase kann Glucosephosphat, beispielsweise Glucose-6-phosphat, als Testreagenz bereitgestellt werden. Falls Phosphatase in der Probe enthalten ist, kann Glucose-6-phosphat gespalten werden, um Glucose und Phosphat zur Detektion, wie zuvor beschrieben, zu erzeugen.

Sensitivität
Die folgenden Testergebnisse vergleichen POCKETSWAB^® von Charm Sciences, Inc., das sowohl auf dem Gerät von Charm Sciences, Inc. LUMINATOR^® als auch dem Firefly-Gerät mit diesem neuen einstufigen Assaytest, der als VERICLEEN^TM-Test bezeichnet wird (VERICLEEN^TM ist eine eingetragene Marke von Charm Sciences, Inc. aus Lawrence, Massachusetts), ausgelesen wurde. Die VERICLEEN^TM-Tupfer („swabs"), die kein Lesegerät erfordern, sind im Vergleich zu POCKETSWAB^® vorteilhaft, welches ein Lesegerät erfordert.
Testbestandteile
Die hier beschriebenen Testergebnisse wurden unter Verwendung der folgenden Testbestandteile erzeugt, die in eine Einzeleinsatz-Vorrichtung aufgenommen wurden, die ähnlich zu der ist, die im US-Patent Nr. 5,827,675, erteilt am 27. Oktober 1998; und 5,965,453, erteilt am 12. Oktober 1999 (Testvorrichtung, System und Verfahren zur Detektion von Testproben); beschrieben wurde. Es sollte festgehalten werden, dass vor der Verwendung für alle Reagenzien nachgewiesen sein muss, dass diese frei von Glucose- und Phosphat-Kontamination sind; andernfalls müssen diese unter Verwendung der Dialyse, Entsalzung, Enzym-Behandlung oder eines anderen geeigneten Verfahrens aufgereinigt werden.
Beispiel 1
Substrat-Zusammensetzung

Maltose (etwa 470 μg)
EHSPT (etwa 125 μg)
4-Aminoantipyrin (etwa 62 μg)

Alle drei Reagenzien werden zunächst getrennt voneinander in einem Stabilisierungspuffer lyophilisiert und anschließend optional in einer Zellulose-Tabletten-Formulierung vereinigt.
Beispiel 2
Enzym-Zusammensetzung:

Maltose-Phosphorylase (etwa 1,5 Einheiten)
Meerrettich-Peroxidase (etwa 5 Einheiten)
Glucose-Oxidase (etwa 12,5 Einheiten)
β-Galactosidase (etwa 1 Einheit)
Apyrase (etwa 1,7 Einheiten)

Alle Enzyme werden separat lyophilisiert und anschließend optimal in einer Zellulose-Tabletten-Formulierung vereinigt.
Beispiel 3
Flüssigkeits-Reagenzkammer („liquid niblet"):

Steriles deionisiertes Wasser mit 1 mM Calciumchlorid und einem Konservierungsstoff.

Vergleich zwischen VERICLEEN^TM von Charm Sciences, Inc.'s und POCKETSWAB^®
Probenvorbereitung:
Feststoffe: beinhaltet Früchte, Gemüse, Eiscreme, Fleisch, Brot und Mehl.

* 20 %-iger Extrakt: 2 g Nahrungsmittel + 8 ml deionisiertes Wasser; mit einem Gewebe-Mischer 30 Sekunden lang kneten; Feststoffe absetzen lassen.
* Alle Verdünnungen aus dem 20 %-igen Extrakt in deionisiertem Wasser herstellen.

Flüssigkeiten: beinhaltet Orangensaft, Milch, Eier und Wasser bzw. Limo („soda").

* Produkt „wie vorliegend" ist ein 100 %-iger Extrakt
* Alle Verdünnungen aus dem 100 %-iger Extrakt in deionisiertem Wasser herstellen

Assay:

1. 50 μl Extrakt direkt in Tupfer („swab") injizieren;
2. Die Tupfervorrichtung durch Drehung aktivieren;
3. Beim PKS-Assay unverzüglich auf dem Firefly-Analysegerät auszählen und
4. Bei VERICLEEN^TM die Zeiterfassung einrichten; die Zeit notieren, wenn eine violette Farbe erscheint.

Blindtest:

* Die Tupfervorrichtungen ohne Entfernung des Tupfers betreiben

POCKETSWAB^®-Blindläufe	VERICLEEN^TM-Blindläufe
Firefy-RLA Auslesung
0	Farbentwicklung nach 6 Minuten
0	Farbentwicklung nach 5,5 Minuten
0	Farbentwicklung nach 6 Minuten

Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3
Tabelle 4
Tabelle 5
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung der Testsensitivität der oben beschriebenen Hygieneüberwachung gegenüber Phosphat durch eine zyklische Reaktion bereitgestellt. Phosphatase, wie beispielsweise saure Phosphatase, die als Testreagenz enthalten ist und in der Probe vorhanden sein kann, spaltet gebundenes Phosphat, wie beispielsweise Glucose-1-phosphat und Glucose-6-phosphat, in dessen Bestandteile Glucose und Phosphat, die beide innerhalb des Assaysystems detektiert werden. Glucose-1-phosphat und Glucose-6-phosphat können aus der Probe stammen und ebenfalls, im Falle von Glucose-1-phosphat, als Reaktionsprodukt des Kohlenhydrat-Substrats mit Phosphat in Gegenwart eines geeigneten Enzyms, wie zuvor beschrieben, erzeugt werden. Das Reaktionsprodukt Glucose-1-phosphat wird durch Phosphatase abgebaut und mehr Glucose für die Farbänderungsreaktion und mehr Phosphat zur Kombination mit dem Kohlenhydrat-Substrat wird, wie zuvor beschrieben, erzeugt.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung stellt eine Möglichkeit zur Freisetzung von Phosphat und Glucose aus gewöhnlich vorgefundenen Oberflächenkontaminanten, wie beispielsweise Adenosin-Triphosphat (ATP), Adenosin-Diphosphat (ADP), Biofilmen, Kohlenhydraten, Mikroben und Phosphatasen bereit. Ein Verfahren zur Freisetzung von Phosphat und Glucose aus solchen Kontaminaten schließt die Verwendung von Enzymen ein, z.B. Phosphatase, beispielsweise Apyrase und Glucose-Phosphatase, und Enzymen, wie beispielsweise hydrolytischen Enzymen, um Kohlenhydrate abzubauen, die aus mehr als einem Saccharid aufgebaut sind (komplexe Kohlenhydrate), um die Glucose-Komponenete freizusetzen, z.B. den Abbau von Lactose durch β-Galactosidase, den Abbau von Sucrose durch Invertase und den Abbau von Stärke durch Amylase. Ein Verfahren zur Freisetzung verschiedener Moleküle wie beispielsweise ATP, ADP und Glucose aus Mikroben schließt die Verwendung von Lyse-Reagenzien ein. Es kann eine Mutarotase enthalten sein, um die Sensitivität durch Umwandlung von α-D-Glucose, verknüpft mit Phosphorylierung, zu β-D-Glucose für die Umsetzung mit Glucose-Oxidase zu steigern.
Die Gegenwart von saurer Phosphatase auf einer Oberfläche ist ein Indikator für die Kontamination mit bestimmtem Lebewesen-Gewebe. Eine getrennte Ausführungsform der Erfindung schließt einen zusätzlichen Weg zur Detektion von Phosphatase ein. Solche Verfahren können im Assaysystem unter solchen Umständen enthalten sein, in denen die Detektion von Phosphatase verhältnismäßig wichtiger ist als die Steigerung der Test-Sensitivität gegenüber Phosphat, z.B. falls die Detektion von Gewebe eines Lebewesens, z.B. eines Muskels oder Blutes, verhältnismäßig wichtiger ist im Vergleich zu der allgemein angestiegenen Sensitivität gegenüber Phosphat. Dennoch können die oben beschriebenen Verfahren zur Steigerung der Test-Sensitivität gegenüber Phosphat durch Bereitstellung von Phosphatase als Reagenz in der Praxis nicht mit den Verfahren zur Detektion von Phosphatase in einer Probe kombiniert werden. Verfahren zur Detektion von Phosphatase schließen die Bereitstellung von Glucose-6-phosphat oder Glucose-1-phosphat als ein Testreagenz ein. Die in der Probe vorhandene Phosphatase wird beispielsweise Glucose-6-phosphat in dessen Bestandteile Glucose und Phosphat spalten.
Eine Ausführungsform der Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur schnellen kolorimetrischen Bestimmung der Hygieneüberwachung von Oberflächenkontamination, wobei das Verfahren umfasst: Zugabe eines Phosphorylase-Enzyms und eines Kohlenhydrat-Substrats zu einer Probe, die Phosphat enthält, um ein Reaktionsprodukt aus freier Glucose und Phosphat, gebunden an ein Saccharid, zu erzeugen; Abspalten des freien Phosphats von diesem gebundenen Phosphat; Abspalten der freien Glucose aus komplexen Kohlenhydraten; Freisetzen oder Extrahieren von intrazellulärem Phosphat und Änderung der inneren Umwandlung („interconversion") von α-D-Glucose in β-D-Glucose, wobei die freie Glucose in einer kolorimetrischen Reaktion als ein Maß für die Oberflächenkontamination detektiert wird.
Eine andere Ausführungsform beinhaltet ebenfalls ein Verfahren zur schnellen, kolorimetrischen Bestimmung der Hygieneüberwachung von Oberflächenkontamination, einschließlich einer Kontamination mit Phosphat und Phosphatase, wobei das Verfahren umfasst: Zugabe eines Phosphorylase-Enzyms und eines Kohlenhydrat-Substrats zu einer Probe, die Phosphat enthält, um ein Reaktionsprodukt aus freier Glucose und Phosphat, gebunden an ein Saccharid, zu erzeugen; Abspalten des freien Phosphats vom gebundenen Phosphat; Abspalten der freien Glucose aus komplexen Kohlenhydraten; Freisetzen von intrazellulärem Phosphat und Katalysieren der inneren Umwandlung („interconversion") von α-D-Glucose in β-D-Glucose, wobei die freie Glucose in einer kolorimetrischen Reaktion als ein Maß für die Oberflächenkontamination detektiert wird.
Eine Ausführungsform der Erfindung umfasst eine Vorrichtung zur schnellen kolorimetrischen Hygieneüberwachung, wobei die Testvorrichtung umfasst: einen Kapillarfluss-Teststreifen, der zwei Enden aufweist, wobei der Teststreifen an einem ersten Ende ein, die flüssige Probe absorbierendes, Material enthält; Reagenzien zur Umwandlung von biologischem Material in Glucose, wie beispielsweise durch Bereitstellung mehrerer biochemischer Reaktionswege; und Reagenzien zur kolorimetrischen Detektion von Glucose, wobei eine flüssige Probe aus einem Material auf dem ersten Ende absorbiert wird und durch Kapillarwirkung fließt und mit Reagenzien in Kontakt kommt, die biochemische Reaktionswege zur Umwandlung von biologischem Material in Glucose bereitstellen, und kolorimetrische Detektion von Glucose.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung umfasst eine Vorrichtung zur schnellen kolorimetrischen Hygieneüberwachung, die eine oder mehr Reaktions-Zone(n) aufweist, enthaltend auf oder in einer Kapillar-Membran, umfassend Reagenzien zur Umwandlung von biologischem Material in Glucose und Phosphat und Reagenzien, die in der Gegenwart von Phosphat und einem geeigneten Enzym bestimmte biologische Materialien in Glucose umwandeln; und Reagenzien zur kolorimetrischen Detektion von Glucose, wobei eine flüssige Probe aus einem Material auf dem ersten Ende absorbiert wird und durch Kapillarwirkung durch den Reagenzien-enthaltenden Teststreifen fließt, der eine visuell detektierbare Anzeige (Auslesung) in Gegenwart von Glucose erzeugt.
Eine Ausführungsform der Erfindung umfasst eine Vorrichtung zur Hygieneüberwachung durch die Detektion von biologischem Material in einer Testprobe aus oder auf einem Material, wobei die Testvorrichtung umfasst: einen Tupfer zur Aufnahme der Testprobe und eine Reagenzkammer, umfassend voneinander getrennte, Tupfer-punktierbare Membranabschnitte für ein oder mehr Reagenz(ein) und eine Lösung; eine Enzym-Reagenz-Zusammensetzung, bevorzugt in Tablettenform, umfassend Glucose-Oxidase, Meerrettich-Peroxidase, Maltose-Phosphorylase, Apyrase, β-Galactosidase und Phosphatase; eine Substrat-Reagenz-Zusammensetzung, bevorzugt in Tablettenform, umfassend 4-Aminoantipyren, Mutarotase, EHSPT (Trindersches Reagenz TOOS) und Maltose; und ein flüssiges Reagenz, umfassend eine Pufferlösung und eine Lyse-Lösung, wobei die Probe nacheinander mit dem flüssigen Reagenz, dem Enzym-Reagenz und dem Substrat-Reagenz in Kontakt gebracht wird und eine Farbänderung oder ein Ausbleiben davon als ein Maß für die Hygiene beobachtet wird.
Die Testvorrichtung verschiedener Ausführungsformen der Erfindung liegt in Form des POCKETSWAB^® vor, der in US-Patent Nr. 5,965,453 beschrieben ist, erteilt am 12. Oktober 1999 (Testvorrichtung, -system und -verfahren zur Detektion von Testproben); US-Patent Nr. 5,985,675, erteilt am 16. November 1999 (Testvorrichtung zur Detektion eines Analyten); und US-Patent Nr. 6,180,395, erteilt am 30. Januar 2001 (Reagenzkammer für Testvorrichtung und Testvorrichtung). In diesen Ausführungsformen enthält die Vorrichtung einen mit Schaum bestückten („foam-tipped") oder anderen Absorber-artigen Tupfer oder Stab zur Probenaufnahme von der Oberfläche, die überwacht werden soll. Der Tupfer kann zuvor mit einer Benetzungslösung angefeuchtet werden.
Nach der Probenaufnahme auf den Tupfer wird der Tupfer verwendet, um eine Reihe von „Reagenzkammern" („niblets") zu punktieren und dabei die notwendigen Reagenzien freizu setzen und zu aktivieren. Der Begriff „Reagenzkammer" („niblet") bezieht sich auf eine Reagenzkammer in Form eines Zylinders, die/der Reagenzien enthält und an beiden Enden mit einer Sonde-punktierbaren Membran versiegelt ist.
In bestimmten Ausführungsformen enthält die erste Reagenzkammer („niblet"), die in Kontakt mit dem Tupfer kommt, Co-Faktoren und Pufferverbindungen, um die nachfolgenden Reaktionen zu optimieren, und eine antimikrobielle oder antifungale Verbindung, um einer Kontamination vorzubeugen. In anderen Ausführungsformen kann die erste Reagenzkammer („niblet") zusätzlich bakterielle Lyse-Reagenzien enthalten.
Nachdem der Tupfer mit dem Reagenz der ersten Reagenzkammer in Kontakt gekommen ist, wird der Tupfer mit dem Material in der zweiten Reagenzkammer („niblet") bevorzugt durch Punktierung der Membrane in Kontakt gebracht, die die erste und zweite Reagenzkammer voneinander trennt, was dazu führt, dass die Reagenzien von der ersten Reagenzkammer („niblet") in die zweite fließen und sich mit den Reagenzien in der zweiten Reagenzkammer („niblet") mischen. Die zweite Reagenzkammer („niblet") enthält ein oder mehr Reagenz(ein), bevorzugt Tabletten, enthaltend Enzyme, Substrate und Biochemikalien. Bestimmte Ausführungsformen beinhalten zwei Tabletten in der zweiten Reagenzkammer („niblet"), die im Allgemeinen als „Substrat-Tablette" und „Enzym-Tablette" bezeichnet werden.
In einigen Ausführungsformen beinhaltet die Substrat-Reagenz-Zusammensetzung Maltose, Glucose-Phosphate, wie beispielsweise Glucose-1-phosphat oder Glucose-6-phosphat, TOOS und 4-Aminoantipyrin, und das Enzym-Reagenz beinhaltet Maltose-Phosphorylase, Meerrettich-Peroxidase, Glucose-Oxidase, Mutarotase, β-Galactosidase und Apyrase. In anderen Ausführungsformen können Enzyme zur Umwandlung anderer Kohlehydrate in Glucose, beispielsweise Amylase, Sucrase (Invertase) enthalten sein.
In einer anderen Ausführungsform wird Glucose-6-phosphat vom Substrat-Reagenz entfernt. Eine solche Ausführungsform wird weniger sensitiv gegenüber Phosphatase aus einer Probe reagieren. Stattdessen wird Phosphatase zum Enzym-Reagenz oder Substrat-Reagenz zugegeben. Die zugegebene Phosphatase wird das Glucose-1-phosphat-Reaktionsprodukt aus Maltose und Phosphat spalten und zusätzliches Phosphat und Glucose erzeugen, wobei die Test-Sensitivität gegenüber Phosphat durch den zusätzlichen Zyklus der Phosphatgruppe aus Glucose-1-phosphat gesteigert wird, um mit Maltose und Maltose-Phosphorylase kombiniert zu werden. Es wird bevorzugt, dass, obwohl die Reagenzien besonderer Ausführungsformen als „Tabletten" oder „Flüssigkeiten" beschrieben sind, die Reagenzien in der Testvor richtung in einer Vielzahl von Formen verwendet werden können und dieser zugeführt werden können, wobei die Formen getrennt voneinander oder in Kombination hergestellt werden, einschließlich eines Feststoffs, einer Flüssigkeit, eines Pulvers, einer gefriergetrockneten Form, einer Emulsion, einer Suspension, einer Tablette oder jeder anderen Form, die einem Fachmann bekannt ist.
Die Testvorrichtung verschiedener anderer Ausführungsformen der Erfindung liegt in Form eines Kapillarfluss-Teststreifens vor. Dieser Streifen besteht aus einer Kapillarfluss-Kapillarmembran, beispielsweise Nitrozellulose-Membran, die anhaftend auf eine Verstärkung gebunden ist, beispielsweise eine Polystyrol-Verstärkung, wobei ein Ende ein Polster mit einem die Probe absorbierenden Bereich in Flüssigkeits-Flusskontakt mit der Membran aufweist. Optional kann am Ende mit dem Probenpolster oder am anderen Ende der Test-streifen ein Behältnis mit einem Oberflächen-Benetzungsreagenz angeheftet haben oder dieser kann in der Verpackung enthalten sein. Das Behältnis mit dem Oberflächen-Benetzungsmittel kann eine Benetzungslösung enthalten. Das Behältnis mit der Benetzungslösung kann beispielsweise in Form eines aufreißbaren Beutels oder eines Behältnisses mit abziehbarem Deckel innerhalb der Verpackung des Teststreifens vorliegen. Alternativ kann die Oberflächen-Benetzungslösung in einem großen Behältnis enthalten sein, beispielsweise einer ausdrückbaren, aus Plastik bestehenden Spenderflasche oder einer Sprühflasche, die an dem Ende angeheftet ist, das dem Spender-Ende gegenüber liegt, bis zu einem Behältnis, in dem die Kapillarfluss-Streifen angebracht sind. Im optimalen Fall sollte die Benetzungslösung pH-neutral, nahrungsmittelkompatibel sein und nicht störend wirken. Das Behältnis für den Kapillarfluss-Streifen ist aus einem Licht-blockierenden Material geformt, um die Teststreifen zu schützen. Auf die Kapillarmembran des Teststreifens sind Reagenzien zur Erzeugung von Glucose und Phosphat aus üblichem biologischem Oberflächenmaterial und Reagenzien zur kolorimetrischen Detektion von Glucose aufgebracht.
In einem Beispiel des Kapillarfluss-Streifens werden Reagenzien in zwei Zonen bereitgestellt. Die zwei Reagenz-Zonen werden auf den Membranteil des Teststreifens in Flüssigkeits-Flusskontakt mit dem absorbierenden Polster aufgebracht. Optional können die Reagenzien durch Aufsprühen auf den Streifen aufgebracht werden. Gemäß einer Ausführungsform enthält die erste Reagenz-Zone ein Kohlenhydrat-Substrat, z.B. Maltose und Glucose-6-phosphat. Gemäß einer alternativen Ausführungsform enthält die erste Reagenz-Zone das Kohlenhydrat-Substrat und eine Phosphatase, z.B. saure Phosphatase. Die zweite Reagenz-Zone enthält Reagenzien zur kolorimetrischen Detektion von Glucose, z.B. TOOS, Glucose-Oxidase, Mutarotase, Meerrettich-Peroxidase und 4-Aminoantipyren. In der zweiten Rea genz-Zone sind ebenfalls Enzyme enthalten, wie z.B. Maltose-Phosphorylase und Apyrase und ein oder mehr hydrolytische(s) Enzym(e), wie beispielsweise β-Galactosidase.
Die Reagenzien in dieser Vorrichtung sind in der Lage, in die/der Membran zu fließen, und mit der Probe und miteinander zu reagieren. Jenseits der zweiten Reagenz-Zone ist ausreichend Kapillarfluss-Raum enthalten, damit Farbreagenzien die Farbe in Gegenwart eines Target-Materials ändern und ein leicht auslesbares sichtbares Ergebnis bereitstellen. Der Raum jenseits der zweiten Reagenz-Zone ist ausreichend klein, um einen definierten Bereich für die aufzutretende Farbänderung zu erzeugen. Die Farbänderung beginnt am Ende der Kapillarmembran und dehnt sich nach hinten hin aus. Die Bereitstellung des Raumes zwischen der zweiten Reagenz-Zone und dem Ende der Kapillarmembran ermöglicht, dass sich eine breitere, stärker sichtbare Linie entwickelt. Am Ende der Kapillarmembran befindet sich ein Luftspalt, um zu vermeiden, dass das Reagenz jenseits des Endes dieser Membran fließt, sowie eine Benetzungslösung zur Lösung vom Nahrungsmittel-Rückstand und zur Durchdringung vom Biofilm.
Alle Reagenzien sind stabilisiert, zur Entfernung von Phosphat-, Glucose- und Maltoseabbauenden Enzymen aufgereinigt, z.B. Glucosidase, und entweder auf die Kapillarfluss-Membran aufgesprüht oder ins absorbierende Polster eingebunden.
Das Testvorrichtungssystem und -verfahren wird lediglich zum Zweck der Veranschaulichung in Verbindung mit einer Reihe veranschaulichender Testvorrichtungen und Testverfahren unter Einsatz verschiedener Testvorrichtungen beschrieben.
Beispiel 4
Der Lateral- oder Kapillarfluss-Streifen besteht aus einer Nitrozellulose-Membran, auf die zwei Regionen, Zonen oder Linien aus Reagenzien unter Verwendung einer geeigneten Herstellungsausrüstung aufgebracht wurden, wie beispielsweise solche, die durch BioDot, Inc. hergestellt werden. Optional ist die Membran mit einem absorbierenden Polster aus Zellulosepapier überlagert. Eine Region besteht aus allen Enzymen, die für die Farbreaktion erforderlich sind, den Enzymen für die Freisetzung von Phosphat und Glucose, und den zwei Substraten, die für die Farbentwicklung notwendig sind. Vor der Verwendung müssen alle Enzyme aufgereinigt werden, um jede Zucker- oder Phosphat-Kontamination zu entfernen, z.B. durch Entsalzung. Die zweite Linie enthält eine Zusammensetzung aus Glucose-freier Maltose und einer aufgereinigten sauren Phosphatase. Die Nitrozellulose wird auf eine Verstärkung aus Polystyrol aufgebracht und optional in eine aus Plastik bestehende Blister- artige Vorrichtung verpackt. Die Vorrichtung enthält, falls diese in eine Blister-artige Vorrichtung verpackt ist, optional eine Blase, in die ein Oberflächen-Benetzungsmittel zugegeben wird; die Blase kann mit einer abziehbaren Folie verschlossen sein.
Die auf die Kapillarmembran aufgetragenen Reagenzien sind die gleichen wie diejenigen, die als Reagenzien oder Tabletten für den Tupfer-artigen Assay verwendet werden. Dennoch ist die pro Test erforderliche Menge jeder Komponente signifikant niedriger für alle Reagenzien. Die ungefähre Menge jedes Reagenzes und dessen im Tupfer-Test verwendete entsprechende Menge sind in Tabelle 6 aufgeführt, in einer Ausführungsform, enthaltend Glucose-6-phosphat, und in Tabelle 7, in einer Ausführungsform, enthaltend saure Phosphatase.
Die mit der in Tabelle 6 beschriebenen Ausführungsform erzeugten Ergebnisse sind in Anhang 1 aufgeführt.
Tabelle 6
Anhang 1
Testdaten

I. Assay, in welchem eine Lösung eines Nahrungsmittelprodukts an der Luft auf einer Arbeitsplatte getrocknet wurde, anschließend mit einer Benetzungslösung rehydratisiert und mit einem Teststreifen abgestreift wird.
II. Assay, in welchem eine nasse Lösung des Nahrungsmittelprodukts von der Plastikoberfläche mit einem Teststreifen abgestreift wird.

Tabelle 7
Die Materialien sind stabilisiert, zur Entfernung von Phosphat, ATP, ADP, Glucose und Glucosidase aufgereinigt und in eine POCKETSWAB^®- oder Kapillarfluss-Membran-Form gebracht, die beide Einzel-Assay-Formen darstellen, die ein einfaches Testen und eine schnelle Analyse ermöglichen.
Die 1 veranschaulicht die allgemeine Verwendung des Reaktionsschemas der Erfindung, die insbesondere zum Testen eines breiten Bereichs von Kontaminanten verwendbar ist. Maltose reagiert mit Phosphat aus der Probe in Gegenwart von Maltose-Phosphorylase zur Bildung von α-D-Glucose und β-D-Glucose-1-phosphat. β-D-Glucose wird farbig, wenn diese mit bestimmten gut bekannten Reagenzien zusammengebracht wird. α-D-Glucose wird natürlicherweise in β-D-Glucose umgewandelt. Die Geschwindigkeit der natürlichen Umwandlung kann durch Mutarotase gesteigert werden. Das β-D-Glucose-1-phosphat wird in Gegenwart von saurer Phosphatase (als ein Testreagenz) zu Phosphat und β-D-Glucose abgebaut (die Phosphatase aus der Probe wird ebenfalls β-D-Glucose-1-phosphat abbauen). Die Glucose gelangt in die Farbreaktion unter Verstärkung der Farbe aus der ersten Glucose und das Phosphat reagiert mit mehr Maltose (einem Testreagenz) und erzeugt mehr Glucose und letztendlich mehr Phosphat und mehr Farbe, bis das Maltose-Reagenz erschöpft ist oder die Reaktion in anderer Weise inhibiert wird. Der oben beschriebene Phosphat-Zyklus erzeugt einen sensitiven Test für Phosphat in der Probe. Das Reaktionsschema beinhaltet ebenfalls Beispiele der Umwandlung von gewöhnlichem biologischem Material in Glucose und Phosphat. Lyse-Reagenzien setzen ATP und ADP aus Mikroben frei und Apyrase spaltet das Phosphat. Kohlenhydrate werden zur Freisetzung von Glucose zur Detektion hydrolisiert.
Die 2 veranschaulicht das Reaktionsschema, das insbesondere zur Detektion einer Kontamination von rohen oder teilweise gekochten Fleischprodukten verwendbar ist. Als ein Reagenz wird Glucose-6-phosphat (oder alternativ Glucose-1-phosphat) zugegeben, um eine zusätzliche Quelle für Phosphat und Glucose zu beinhalten, wenn saure Phosphatase in der Probe enthalten ist. In der durch dieses Reaktionsschema gezeigten Ausführungsform ist saure Phosphatase nicht ein Reagenz sondern wird stattdessen durch die Probe bereitgestellt. Falls saure Phosphatase nicht vorhanden ist, gelangt das Glucose-6-phosphat nicht in die Reaktion und lediglich das Phosphat aus der Probe erzeugt Glucose. Die Farbe wird durch die Glucose erzeugt.
Die 3A & B beschreiben die Erfindung in Form der Tupfer-artigen Vorrichtung. Bei Verwendung der Tupfer-artigen Vorrichtung der Erfindung wird der Tupfer 1 durch Greifen des Tupferhandgriffs 2 aus dem Körper 3 entfernt und es wird eine 4'' × 4''-Oberfläche, beispielsweise eine Nahrungsmittel-Kontaktoberfläche, unter Verwendung des zuvor angefeuchteten Tupfers 1 abgetupfert. Der Tupfer 1 wird anschließend wieder in den Körper 3 eingebracht und in Längsrichtung durch die Abdeckung 9 der in Form eines Mikroröhrchen vorliegenden Testeinheit 4 und durch die Abdeckung 10 der Flüssigreagenz-Kammer 5 und in die Tabletten-Kammer 6, der eine Enzym-Tablette 7 und eine Substrat-Tablette 8 enthält, verschraubt. Die auf den Boden der in Form eines Mikroröhrchens vorliegenden Testeinheit 4 freigesetzte Flüssigkeit wird innerhalb von 60 Sekunden violett, falls die Oberfläche „schmutzig" ist, diese beispielsweise eine Kontamination mit einem Nahrungsmittel-Rückstand aufweist.
Die 4 veranschaulicht die Erfindung in der Streifen-artigen Kapillarfluss-Vorrichtung, die in eine Blisterverpackung eingepackt ist. Bei Verwendung der Streifentest-artigen Kapillarfluss-Vorrichtung der Erfindung wird die Abdeckung der Blisterverpackung 12 nach hinten abgezogen und die Oberflächen-Benetzungslösung wird aus dem Behältnis 11 auf die zu überwachende Oberfläche freigesetzt. Der Anwender fährt fort, die Abdeckung 12 nach hinten abzuziehen, um den Teststreifen 13 freizulegen.
Die 5 ist eine Seitenansicht des VERICLEEN^TM-Teststreifens. Während der Griffbereich 14 verwendet wird, wird das absorbierende Polster 15 verwendet, um die zu überwachende Oberfläche abzutupfern. Die Probe wird auf das Probenpolster 15 absorbiert und fließt durch Kapillarwirkung über die erste Reagenz-Zone 19 zur zweiten Reagenz-Zone 20 (die Reagenz-Zonen 19 und 20 werden zur Veranschaulichung dargestellt). In der bevorzugten Ausführungsform sind die Reagenz-Zonen 19 und 20 leicht sichtbar oder unsichtbar. Der Probenfluss stoppt am Ende der Kapillarmembran 18. Positive Ergebnisse werden in der Farbänderungs-Zone 17 wiedergegeben. Die Farbänderung beginnt sich am Ende der Kapillarmembran 18 zu bilden und breitet sich nach hinten hin aus. Eine Lücke 21 ist enthalten, die ausreichend breit ist, um eine unerwünschte Diffusion von Farbe in die Abdeckung 22 der Verstärkung 23 zu vermeiden, wobei die Abdeckung 22 und die Verstärkung 23 zusammengenommen den Griffbereich 14 bilden. Die Linienentwicklung an der Spitze der Kapillar membran deutet etwa innerhalb einer Minute die Gegenwart eines Rückstandes und das Erfordernis nach einer Reinigung an. Alle gültigen Tests werden nach etwa fünf Minuten die Farbe ändern. Die Reagenz-Zonen 19 und 20 enthalten in Abhängigkeit der Erfordernisse des Anwenders die im Reaktionsschema von entweder 1 oder 2 dargestellten Reagenzien.
Die 6 ist eine Seitenansicht des Spenders für das Benetzungsmittel 24, der auf einem Licht-blockierenden Teststreifen-Behältnis 25 aufgebracht ist.
Die 7 veranschaulicht eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die einen Streifen aus Nitrozellulose enthält, der anhaftend an einen Polystyrol-Träger gebunden ist. Es werden verschiedene Reagenzien auf die Nitrozellulose in einer Serie von getrennten Zonen aufgesprüht und getrocknet. Die 7 enthält, wie im Folgenden beschrieben, sieben solcher räumlich voneinander getrennter Zonen:
Zone 1, 48, umfasst Apyrase und β-Galactosidase. Apyrase spaltet jedes ATP/ADP-freisetzende Phosphat, das in die Lösung entlang des Teststreifens in Zone 2 fließen wird. β-Galactosidase wandelt Lactose in Glucose um. Zone 2, 46, umfasst Maltose zur Reaktion mit Phosphat in Gegenwart der Maltose-Phosphorylase zur Erzeugung von Glucose. Zone 3, 44, besteht aus Maltose-Phosphorylase. Zone 4, 42, besteht aus Glucose-Oxidase zur Oxidation von Glucose in einer Reaktion, die Peroxid ergibt. Zone 5, 40, umfasst EHSPT (N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfo-propyl)-n-toluidin), gewöhnlich als TOOS bezeichnet; Zone 6, 30, besteht aus 4-Aminoantipyrin und Zone 7, 36, besteht aus Meerrettich-Peroxidase. Zonen 5, 6 und 7, 40, 30 bzw. 36, umfassen Reagenzien, die in Gegenwart von Peroxid ein Farbstoffpräzipitat erzeugen, das visuell beobachtet werden kann.
Es ist ebenfalls möglich, die oben beschriebenen sieben Zonen zu weniger Zonen zu kombinieren, z.B. drei Zonen, die mehrere Reagenzien pro Zone enthalten.
In der Praxis wird das Benetzungs-Reagenz auf die zu testende Oberfläche freigesetzt oder auf dem absorbierenden Polster 15 absorbiert. Indem der Streifen an dem Finger-Halte-Bereich 32 gehalten wird, wird das Probenpolster 15 verwendet, um die zu testende Oberfläche abzutupfern. Durch Benetzen der Oberfläche wird in der Flüssigkeit etwas von dem zu detektierenden Material suspendieren. Das zu detektierende Material wird durch den Streifen durch Abtupfern der nassen Oberfläche absorbiert. Die auf dem Streifen absorbierte Flüssigkeit wird anschließend lateral auf dem Streifen fließen. Nach Kontakt mit einem Flüssiganalyten werden die Reaktanden in den Zonen wieder gelöst und mit dem/den Analyt(en) in der oben beschriebenen Probe umgesetzt. Die Farbbildung mit Meerrettich-Peroxidase in der Reaktions-Zone 36 zeigt eine positive Probe an, während das Ausbleiben einer Farbe eine saubere Probe anzeigt.

Claims

Verfahren zur Überwachung der Hygiene einer Oberfläche, die frei von biologischer Kontamination sein soll, welches a) Gewinnen einer Probe von der Oberfläche, b) Zugabe eines oder mehr Reagenzes/ien zu der Probe zur Umwandlung eines Kohlehydrats in freie Glucose und c) Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit der freien Glucose in der Probe umfasst, wobei die Gegenwart der freien Glucose ein Indikator für Kontamination auf der Oberfläche ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die biologische Kontamination aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Nahrungsmittel-Rückständen, Mikroorganismen und einer Kombination von Nahrungsmittel-Rückständen und Mikroorganismen.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, welches weiterhin die Zugabe eines Phosphorylase-Enzyms und eines Kohlehydrat-Substrats zu der Probe umfasst, um, bei Vorliegen eines Phosphats in der Probe, ein Reaktionsprodukt in Form von freier Glucose und ein Reaktionsprodukt in Form eines Phosphat-gebundenen Saccharids zu erzeugen.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Phosphorylase-Enzym Maltose-Phosphorylase und das Kohlehydrat-Substrat Maltose umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 3, welches weiterhin das Abspalten eines anorganischen Phosphats von einem Phosphat-enthaltenden organischen Molekül umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Abspalten die Zugabe eines Phosphatase-Enzyms umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Phosphat-gebundene Saccharid-Reaktions-Produkt Glucose-1-phosphat ist, und wobei das Phosphatase-Enzym Phosphat von dem Glucose-1-phosphat abspaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Phosphatase-Enzym Apyrase umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Phosphatase-Enzym saure Phosphatase umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Phosphatase-Enzym Glucose-Phosphatase umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Phosphatase-Enzym ATP-Hydrolase umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Phosphatase-Enzym alkalische Phosphatase umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 3, welches weiterhin das Freisetzen von Phosphat aus einer biologischen Zelle der Probe, bevorzugt durch Lysieren der Zelle, umfasst.
Verfahren gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, welches weiterhin die Zugabe von Glucose-Phosphat zu einer Probe, von der angenommen wird, dass sie Phosphatase enthält, zur Erzeugung eines Reaktionsprodukts in Form freier Glucose und freiem Phosphat umfasst.
Verfahren gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, welches weiterhin das Einführen der Probe zu den Reagenzien durch eine oder mehr Membran-punktierbare Reagenzkammer(n) ("niblets") umfasst.
Verfahren gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, welches weiterhin das Einführen der Probe auf eine Kapillarfluss-Membran, welche Reagenzien zur Erzeugung von Glucose und Komponenten zur kolorimetrischen Detektion von Glucose enthält, umfasst.
Verfahren gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Kohlehydrat einen oder mehr Zucker umfasst.
Verfahren gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Kohlehydrat ein oder mehr komplexe(s) Kohlehydrat(e) umfasst.
Verfahren gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Reagenzien wenigstens ein hydrolytisches Enzym umfassen und das hydrolytische Enzym die Abspaltung von Glucose von dem Kohlehydrat katalysiert.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das hydrolytische Enzym eine Invertase ist.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das hydrolytische Enzym eine Amylase ist.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das hydrolytische Enzym eine Cellulase ist.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das hydrolytische Enzym β-Galactosidase ist.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das hydrolytische Enzym eine Sucrase ist.
Verfahren gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 1 bis 24, wobei die Reagenzien in einer Testvorrichtung vorliegen.
Verfahren gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 1 bis 24, wobei die Detektion die Zugabe eines oder mehr Reagenzes/ien zur kolorimetrischen Detektion zu der freien Glucose umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei die Reagenzien zur kolorimetrischen Detektion Glucose-Oxidase und -Peroxidase umfassen.
Verfahren gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Probe eine von einer Oberfläche erhaltene Flüssigkeit ist.
Verfahren gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, welches weiterhin das Katalysieren der inneren Umwandlung („interconversion") einer α-D-Glucose in β-D-Glucose umfasst.
Vorrichtung zum Nachweis biologischen Materials in einer flüssigen Probe, wobei die Vorrichtung a) ein Flüssigkeits-absorbierendes Material zur Aufnahme der Probe, b) Reagenzien zur Umwandlung des biologischen Materials in freie Glucose und c) Reagenzien zur kolorimetrischen Detektion der freien Glucose umfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 30, wobei die Reagenzien zur Umwandlung des biologischen Materials in freie Glucose ein oder mehr hydrolytische(s) Enzym(e) zur Abspaltung der freien Glucose von dem biologischen Material umfassen.
Vorrichtung gemäß Anspruch 30, wobei die Vorrichtung weiterhin ein Phosphorylase-Enzym und ein Kohlehydrat-Substrat umfasst, um, in Gegenwart von Phosphat, ein Reaktionsprodukt in Form von freier Glucose und ein Reaktionsprodukt in Form eines Phosphat-gebundenes Saccharids zu erzeugen.
Vorrichtung gemäß Anspruch 32, wobei ein Phosphatase-Enzym das anorganische Phosphat von einem organischen Molekül abspaltet.
Vorrichtung gemäß Anspruch 30, wobei die Reagenzien einem Benutzer auf einer oder mehr Reagenz-Zone(n) auf einem Lateralfluss-Teststreifen bereitgestellt werden.
Vorrichtung gemäß Anspruch 34, welche weiterhin einen verschlossenen Abschnitt umfasst, welcher ein Oberflächen-Benetzungsmittel enthält.
Vorrichtung gemäß Anspruch 34, wobei der Teststreifen wenigstens eine erste und eine zweite Reagenz-Zone umfasst und wobei die erste Reagenz-Zone Maltose und saure Phosphatase umfasst und die zweite Reagenz-Zone TOOS, Glucose-Oxidase, Meerrettich-Peroxidase, 4-Aminoantipyren, Maltose-Phosphorylase, Apyrase und β-Galactosidase umfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 34, wobei der Teststreifen wenigstens zwei Reagenz-Zonen umfasst und wobei die erste Reagenz-Zone Maltose und Glucose-6-phosphat umfasst und die zweite Reagenz-Zone TOOS, Glucose-Oxidase, Meerrettich-Peroxidase, 4-Aminoantipyren, Maltose-Phosphorylase, Apyrase und β-Galactosidase umfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 30, wobei das Flüssigkeits-absorbierende Material einen Tupfer zur Aufnahme der Testprobe umfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 38, welche weiterhin wenigstens einen punktierbaren Membranabschnitt umfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 39, wobei der Abschnitt ein Reagenz zur kolorimetrischen Detektion von Glucose enthält.
Vorrichtung gemäß Anspruch 39, wobei der Abschnitt Reagenzien zur Umwandlung biologischen Materials in Glucose enthält.
Vorrichtung gemäß Anspruch 30, welche weiterhin a) eine Enzym-Reagenz-Zusammensetzung, umfassend Glucose-Oxidase, Meerrettich-Peroxidase, Maltose-Phosphorylase, Apyrase und β-Galactosidase, b) eine Substrat-Reagenz-Zusammensetzung, umfassend 4-Aminoantipyren, TOOS und Maltose und ein Glucose-Phosphat, und c) eine Puffer-Reagenz-Zusammensetzung, umfassend eine gepufferte Lösung, umfasst, wobei die Probe nacheinander mit der Puffer-Reagenz-Zusammensetzung, der Enzym-Reagenz-Zusammensetzung und der Substrat-Reagenz-Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird und eine Farbänderung oder das Fehlen einer Farbänderung als Maß für die Hygiene beobachtet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die biologische Kontamination ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Adenosin-Triphosphat, Adenosin-Diphosphat, Biofilmen, Kohlehydraten, Mikroben und Phosphatase.