DE60114443T2 - Verfahren zur identifizierung von listeria-monozytogenen und kulturmedium - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein chromogenes Substrat, das den direkten Nachweis von pathogenen Bakterien der Gattung Listeria, genauer gesagt der Spezies Listeria monocytogenes, gestattet.
  • Die Erfindung betrifft auch die Kombination von zwei Substraten, von denen das eine eine beträchtliche Spezifität für die Spezies Listeria monocytogenes und das andere gegebenenfalls eine Spezifität für die Gattung Listeria aufweist. Außerdem betrifft sie ein Kulturmedium, das solch ein Substrat oder solch eine Substratkombination enthält. Schließlich betrifft sie ein Nachweisverfahren, bei dem solche Kulturmedien verwendet werden.
  • Seit vielen Jahren werden bestimmte Substrate verwendet, um den Nachweis des Vorhandenseins bzw. Fehlens von Enzymaktivitäten, die für Mikroorganismen charakteristisch sind, zu gestatten. Aufgrund der Auswahl der Substrate, nämlich ob eine Reaktion stattfindet oder nicht, kann die Spezies einer Gruppe von Mikroorganismen charakterisiert oder zwischen Stämmen und/oder Spezies einer gegebenen Gattung von Mikroorganismen unterschieden werden.
  • Synthetische Enzymsubstrate, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, setzen sich aus zwei Teilen zusammen, nämlich einem ersten Teil, der für die nachzuweisende Enzymaktivität spezifisch ist und im Folgenden Zielteil genannt wird, und einen zweiten Teil, der als Marker dient und im Folgenden Markerteil genannt wird.
  • Diese bestimmten Substrate können fluoreszierend oder chromogen sein. Eigentlich ist es der zweite Teil, der Markerteil, wo das Produkt seiner Reaktion mit einer oder mehreren anderen Verbindungen – siehe in diesem Zusammenhang die Patentanmeldung PCT/FR99/00781, die an die Anmelderin ausgegeben wurde – der fluoreszierend oder chromogen ist, wenn er nicht mehr mit dem ersten Teil, dem Zielteil, kombiniert ist.
  • Die Isolation und Identifikation des Bakteriums Listeria monocytogenes ist ein wesentliches Problem bei der Überwachung der Landwirtschafts- und Nahrungshygiene und der medizinischen Bakteriologie. Unter den Bakterien der Gattung Listeria ist nur von der Spezies Listeria monocytogenes bekannt, dass sie humanpathogen ist. Sie kann Listeriose verursachen, die manchmal (in 25 bis 30 % aller Fälle) bei immungeschwächten Personen, Kleinkindern oder schwangeren Frauen tödlich ist. Die anderen Listeria-Spezies sind nicht pathogen oder nur tierpathogen. Dies ist insbesondere bei Listeria ivanovii der Fall.
  • Obwohl in den letzten Jahrzehnten die Gefahr der Listeriose beim Menschen in den meisten entwickelten Ländern zurückgegangen ist, wird von der modernen Gesellschaft immer mehr Sicherheit gefordert, wobei zwar sporadisch auftretende Fälle akzeptiert, Epidemien jedoch nicht toleriert werden können.
  • In Frankreich wird zum Beispiel bei der Politik der Risikobekämpfung der nachgelagerte Bereich (Kontaminationsrate in den Verarbeitungsprodukten) gegenüber dem vorgelagerten Bereich (Kontamination der landwirtschaftlichen Produkte) mit Vorrang behandelt. Demgemäß wären 15 bis 60 % der Geflügelschlachtkörper, 3 bis 36 % der Schweineschlachtkörper und 7 bis 28 % der Rinderschlachtkörper mit Listeria kontaminiert.
  • Im Rahmen der Diagnose von bakteriellen Infektionen beim Menschen ist es jedoch wichtig, Listeria monocytogenes eindeutig von den anderen Bakterien der Gattung Listeria spp., die nicht pathogen sind, zu unterscheiden.
  • Der Nachweis und die Isolation von Listeria spp., werden traditionellerweise mit selektiven Kulturmedien durchgeführt. Die selektiven Medien Palcam (Van Netten et al., J. Food Microbiol. (1988), 6, S. 187-188) und Oxford (Curtis et al., Lett. Appl. Microbiol. (1989), 8, S. 85-98) gehören zu den am häufigsten verwendeten Medien. Mit diesen Medien können alle Spezies der Gattung Listeria spp. nachgewiesen werden. So müssen mit den typischen Kolonien, die beobachtet werden, anschließend ergänzende Identifikationstests, wie mikroskopische und/oder biochemische und/oder immunologische und/oder genetische Tests, durchgeführt werden, um eine Zugehörigkeit zu der Spezies Listeria monocytogenes zu bestätigen.
  • Nun werden aber durch diese zusätzlichen Arbeitsschritte die Analysedauer verlängert und die Analysekosten erhöht. Sie erfordern eine Vielzahl von Reaktanten und die Durchführung von Arbeiten durch Fachkräfte. Außerdem stellen dadurch, dass Kolonien, die einer Identifikation unterzogen werden, zufällig entnommen werden, die zusätzlichen Arbeitsschritte häufig eine Fehlerquelle dar oder sind zumindest der Grund für weniger Genauigkeit und Verlässlichkeit der Ergebnisse. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn die Listeria monocytogenes-Kolonien auf dem Isolationsmedium im Vergleich zu anderen Kolonien, die von anderen Listeria-Spezies gebildet werden, stark in der Minderheit sind.
  • In dem an die Anmelderin ausgegebenen Patent EP-B-0.496.680 wird ein bakteriologisches Analyseverfahren zur Differenzierung der Spezies Listeria monocytogenes von anderen Bakterien der Gattung Listeria beschrieben. Gemäß diesem Verfahren wird ein Nachweismedium verwendet, das ein chromogenes oder fluorogenes Substrat, das von einem Glycinaminopeptidase genannten Enzym hydrolysiert werden kann, umfasst. Das verwendete Medium kann auch gegebenenfalls ein Fermentationssubstrat und/oder ein reduzierbares Substrat und/oder ein enzymatisch hydrolysierbares Substrat enthalten, wie das α-Mannosidase-Substrat, dessen chemische Transformation es gestattet, die in der zu analysierenden Probe vorhandene Listeria-Spezies zu charakterisieren.
  • Diese sehr interessante Methode weist insofern einen Hauptnachteil auf, als die Spezies Listeria monocytogenes die einzige Spezies ist, die keine enzymatische Glycinaminopeptidase-Aktivität aufweist. Es kann daher die gesamte Gattung Listeria nachgewiesen werden, mit Ausnahme der Spezies Listeria monocytogenes, die pathogen ist. Der Nachweis von Listeria monocytogenes durch eine negative Aktivität ist daher nicht einfach, da bei der Verwendung eines Negativtests Spezifität fehlt, wenn eine Mutante vorliegt oder wenn die anderen Spezies einem Druck ausgesetzt sind und nicht mit einer normalen Aktivität reagieren.
  • In der Publikation „Seperation of pathogenic and apathogenic Listeria monocytogenes by 3 in-vitro reaction" [Unterscheidung zwischen pathogenen und apathogenen Listeria monocytogenes durch 3 In-vitro-Reaktionen], Groves, R. D. et al., Journal of Clinical Microbiology, Bd. 5, Nr. 6, 1977, wird die Verwendung von Substanzen, die aufgrund ihrer Spaltung durch ein spezifisches Enzym aktiviert werden, jedoch nicht die Verwendung von Esterasesubstraten, beschrieben.
  • In der Publikation „Enhance haemolysis agar EHA an improved selective and differential medium for isolation of Listeria monocytogenes" [„Enhanced haemolysis agar" (EHA), ein verbessertes Selektiv- und Differentialmedium für die Isolation von Listeria monocytogenes], Cox, L. J. et al., Food Microbiology (London), Bd. 8, Nr. 1, 1998, die ein Verfahren zur Isolation von Bakterien der Gattung Listeria monocytogenes betrifft, wird die Verwendung von Esterasesubstraten weder beschrieben noch nahegelegt.
  • In der Druckschrift FR 2 687 028 wird ein Kulturmedium für den Nachweis von Bakterien der Gattung Salmonella und nicht von Listeria monocytogenes beschrieben.
  • In der Publikation „Comparison of five typing methods for the epidemiological study of Listeria monocytogenes" [Vergleich von fünf Bestimmungsmethoden für die epidermiologische Untersuchung von Listeria monocytogenes], Kerouaton et al., International Journal of Food Microbiology, Bd. 43, Nr. 1-2, werden Verfahren zur Unterscheidung zwischen mehreren Stämmen von Listeria monocytogenes, jedoch nicht für den spezifischen Nachweis des Vorhandenseins von Listeria monocytogenes beschrieben.
  • In der Publikation „Haemolysins and extra cellular enzymes of Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii" [Haemolysine und extrazelluläre Enzyme von Listeria monocytogenes und Listeria ivanovii], Barclay R. et al., Journal of Medical Microbiology, Bd. 30, Nr. 2, 1989, wird die Verwendung von Esterasesubstraten für den Nachweis von Bakterien der Gattung Listeria beschrieben, jedoch keine Differenzierung zwischen Listeria monocytogenes und Listeria ivanovii gestattet.
  • Außerdem ist es bekannt, chromogene Medien, mit denen die für die Gattung Listeria spezifische β-Glucosidaseaktivität nachgewiesen werden kann, zu verwenden.
  • So wird in den Patenten der Vereinigten Staaten Nr. 5,962,251 und US 5,364,767 ein Verfahren zur Identifikation von Mikroorganismen, das zwei Chromogene umfasst, beschrieben; die Verwendung von Esterasesubstrat für die Identifikation von Listeria monocytogenes wird jedoch nicht beschrieben.
  • Weiterhin ist es für eine genauere Unterscheidung, bei der ebenfalls chromogene Medien verwendet werden, möglich, zwischen den Spezies Listeria monocytogenes und Listeria ivanovii und anderen Listerien dadurch zu unterscheiden, dass man die für Phosphatidylinositol spezifische Phospholipase-C-Aktivität (PI-PLC) nachweist.
  • Es wurde nämlich nachgewiesen, dass die PI-PLC von gewissen Spezies der Gattung Listeria, wie Listeria monocytogenes und Listeria ivanovii in das Kulturmedium sezerniert wird (Leimeister-Wächter et al., Mol. Microbiol. (1991) 5(2), S. 361-366; J. Mengaud et al., Mol. Microbiol. (1991) 5(2), S. 367-372 und Goldfine et al., Infection and Immunity (1992) 60(10), S. 4059-4067). Man weiß auch, dass diese beiden Spezies mit Hilfe von indirekten Verfahren identifiziert werden können (Notermans et al., App. und Env. Microbiology (1991), Bd. 57 Nr. 9, S. 2666-2670.
  • In der Patentanmeldung WO-A-99/04032 wird ein Kulturmedium, das ein für Listeria monocytogenes und für Listeria ivanovii spezifisches chromogenes Substrat enthält, beschrieben; es handelt sich um ein Phosphatidylinositolderivat, wie das Ammoniumsalz von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-myo-inositol-1-phosphat, das einen direkten Nachweis von diesen beiden Spezies, also in einem Schritt, und daher ihre Unterscheidung von anderen Listeria-Spezies ermöglicht.
  • Auch in den folgenden Schriften beruft man sich auf die Verwendung von PI-PLC für den bakteriologischen Nachweis:
    • • WO-A-98/38332, die im Wesentlichen ein Verfahren und einen Test für den Nachweis von PI-PLC mittels eines Substrats, das von solch einem Enzym gespalten wird, wobei eines der Spaltprodukte des Substrats chromogen ist und die Identifikation von pathogenen Listerien gestattet, betrifft, sowie
    • • WO99/48899, in der eine auf 4-Methylumbelliferon basierende fluorogene Verbindung vorgeschlagen wird, mit der eine Enzymaktivität, PI-PLC, die in zahlreichen Spezies Clostridium species, Listeria ivanovii, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis und auch Listeria monocytogenes vorliegt, nachgewiesen werden kann.
  • In dieser letztgenannten Schrift wird die Tatsache, dass die Phospholipase-C-Enzymaktivität nicht für Listeria monocytogenes spezifisch ist, da sie auch in anderen Spezies, auch in einer anderen Listerie, nämlich Listeria ivanovii vorliegt, postuliert.
  • Es ist jedoch anzumerken, dass chromogene Esterasesubstrate einfacher zu synthetisieren und preisgünstiger sind als PI-PLC-Substrate. Außerdem ist es vorteilhaft, statt einem natürlichen Substrat ein chromogenes Substrat zu verwenden, da der visuelle Nachweis einfacher ist: statt einem Hof um die Kolonien treten gefärbte Kolonien auf. Dieser Vorteil findet sich auch bei Kulturen, die aus einer Mehrzahl von Mikroorganismen bestehen: jede Kolonie hat seine spezifische Farbe, während sich der Hof um zwei unterschiedliche Kolonien erstrecken kann.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Nachweisverfahren vorzuschlagen, das es ermöglicht, zwischen der Spezies Listeria monocytogenes und allen anderen Listeria-Spezies zu unterscheiden. Dieses Ergebnis wird dadurch erhalten, dass man mindestens eine metabolische Aktivität, die bis jetzt nicht für den Nachweis von Listerien und die Unterscheidung von Listeria monocytogenes von anderen Spezies der Gattungen Listeria verwendet wurde, nachweist. Es handelt sich um eine Esteraseaktivität, die stark von Listeria monocytogenes und sehr schwach bei den anderen Spezies der gleichen Gattung ausgeprägt ist und zweitens um mindestens eine Aktivität, die bei allen oder einigen Listerien vorliegt, wie Osidase oder Phosphatase oder Aminopeptidase, mit der der Farbkontrast zwischen Listeria monocytogenes und den anderen Spezies der gleichen Gattung verstärkt werden kann. Auf diese Spezies und Weise ist es möglich, Listeria monocytogenes und andererseits Listeria ivanovii und Listeria innocua, bei denen es sich um die am häufigsten isolierten Spezies handelt und deren enzymatische Eigenschaften denen von Listeria monocytogenes sehr ähnlich sind, auseinanderzuhalten.
  • Zu diesem Zweck betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Substrats zum direkten Nachweis von pathogenen Listeria monocytogenes Bakterien, wobei die Erfindung dadurch gekennzeichnet ist, dass das Substrat durch eine Esteraseaktivität, die sich von der für Phosphatidylinositol (PI-PLC) spezifischen Phospholipase-C-Aktivität unterscheidet, gespalten wird, wobei die Esteraseaktivität für Listeria monocytogenes spezifisch ist, und dass es einen Zielteil umfasst, der aus einer Fettsäure mit einer Kohlenstoffkette einer Länge von 4 bis 20 Kohlenstoffatomen zusammengesetzt ist.
  • Ist die PI-PLC-Aktivität eine Esteraseaktivität, so ist Listeria ivanovii esterasenegativ während sie PI-PLC-positiv ist und kann daher mit Listeria monocytogenes verwechselt werden. Im Gegensatz zum Stand der Technik und zum Nachweis von PI-PLC, wo nicht zwischen Listeria monocytogenes und anderen Listerien unterschieden werden kann, gestattet die vorliegende Erfindung einen spezifischeren Nachweis von Listeria monocytogenes.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Esteraseaktivität eine spezifische Enzymaktivität, d. h. sie spaltet die Esterbindung zwischen dem Markerteil und dem Zielteil, die das Substrat bilden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die gespaltene Bindung eine Esterbindung zwischen einer vom Markerteil getragenen Alkoholfunktion und einer den Zielteil bildenden organischen Säure.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Markerteil aus einem Chromogen zusammengesetzt, wie etwa einem Indoxyl, das aus einem der folgenden Bestandteile zusammengesetzt sein kann:
    • • 5-Brom-3-indoxyl oder
    • • 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl oder
    • • 6-Chlor-3-indoxyl oder
    • • 5-Brom-6-chlor-3-indoxyl oder
    • • 6-Brom-3-indoxyl.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielteil aus einer Fettsäure mit einer Kohlenstoffkette einer Länge von 4 bis 10 Kohlenstoffatomen zusammengesetzt.
  • Das Substrat ist vorzugsweise aus 5-Brom-4-chlor-3-indolylbutyrat, 5-Brom-4-chlor-3-indolyloctanoat, 5-Brom-4-chlor-3-indolylnonanoat oder 5-Brom-4-chlor-3-indolyldecanoat zusammengesetzt.
  • Gemäß einer Ausführungsvariante ist das Substrat mit mindestens einem anderen Substrat gekoppelt, das das Ermitteln mindestens einer anderen Enzymaktivität der gesamten oder eines Teils der Spezies Listeria ermög licht.
  • Falls zwei Substrate vorliegen, weist das Substrat, das das Ermitteln der Esteraseaktivität, mit Ausnahme des Enzyms PI-PLC, ermöglicht, eine andere Färbung als das andere Substrat auf, was das Ermitteln einer anderen Enzymaktivivität als die vorangehend definierten Esteraseaktivität ermöglicht.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die andere Enzymaktivität der gesamten oder eines Teils der Spezies Listeria eine Osidase-, Phosphatase- oder Aminopeptidaseaktivität.
  • Der Markerteil des anderen Substrats basiert vorzugsweise auf:
    • • 5-Brom-3-indoxyl oder
    • • 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl oder
    • • 6-Chlor-3-indoxyl oder
    • • 5-Brom-6-chlor-3-indoxyl oder
    • • 6-Brom-3-indoxyl.
  • Bezüglich des 6-Chlor-3-indoxyls ist solch ein Molekül besonders gut in dem Patent US-A-5,364,767 beschrieben, wo es im Wesentlichen mit N-Acetyl-β-D-galactosaminid, mit N-Acetyl-β-D-glucosaminid, mit Butyrat, mit Octanoat, mit dem p-Toluidinphosphatsalz, mit Sulfat oder mit β-D-Glucopyranosid kombiniert ist. Es kann auch auf 5-Brom-6-chlor-3-indoxyl basieren.
  • Gemäß einer Ausführungsvariante ist das andere Substrat aus Folgendem zusammengesetzt:
    • • 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-β-D-glucosid oder
    • • 6-Chlor-3-indolyl-β-D-glucosid oder
    • • 6-Chlor-3-indolyl-β-D-cellobiosid oder
    • • 6-Chlor-3-indolyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid oder
    • • 6-Chlor-3-indolyl-α-D-mannosid oder
    • • 6-Chlor-3-indolylphosphat.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Reaktionsmediums zum direkten Nachweis von Listeria monocytogenes, wobei mindestens ein Substrat wie oben definiert verwendet wird.
  • Genauer gesagt weist das Substrat, das das Ermitteln einer sich von der PI-PLC-Aktivität unterscheidenden Esteraseaktivität ermöglicht, eine Konzentration von 20 mg/l bis 3 g/l oder vorzugsweise von 50 mg/l bis 1 g/l, oder vorzugsweise von 100 bis 600 mg/l, oder ungefähr 250 mg/l, auf.
  • Genauer gesagt umfasst das Medium mindestens ein anderes Substrat, das das Ermitteln einer anderen Aktivität, wie etwa einer Osidase-, Phosphatase- oder Aminopeptidaseaktivität, ermöglicht, in einer Konzentration von 10 mg/l bis 500 my/l, vorzugsweise von 50 bis 300 mg/l, und noch stärker bevorzugt von 100 bis 200 mg/l, auf.
  • Das Medium ist vorzugsweise ein Agar-Agar-Medium oder ein flüssiges Medium.
  • Gemäß einer Ausführungsvariante beinhaltet das Medium ein Mittel, das es ermöglicht, Listeria monocytogenes von Listeria welshimeri und Listeria seeligeri zu unterscheiden, nämlich:
    • • Zugabe mindestens eines durch Listeria welshimeri und Listeria seeligeri und nicht durch Listeria monocytogenes azidifizierten Kohlenhydrats (zum Beispiel Xylose und/oder D-Tagatose) oder
    • • Zugabe mindestens eines durch Listeria monocytogenes und eventuell Listeria innocua und/oder Listeria ivanovii und/oder Listeria grayii azidifizierten Kohlenhydrats oder
    • • Zugabe mindestens eines Substrats, das das Aufdecken einer für mindestens Listeria welshimeri und Listeria seeligeri jedoch nicht für Listeria monocytogenes spezifischen Osidase-(β-Maltosidase) und/oder Phosphatase- und/oder Aminopeptidase-(L-glycinaminopeptidase)-Aktivität ermöglicht, oder
    • • Zugabe mindestens eines natürlichen Substrats aus Phospholipase (PLC), wie etwa Phosphatidylinositol (PI) und/oder Phosphatidylcholin (PC).
  • Gemäß einer besonderen Ausführungsform umfasst das Medium ein selektives Mittel, das es ermöglicht, Listeria monocytogenes von mindestens den folgenden Spezies zu unterscheiden
    • • Staphylococcus aureus,
    • • Bacillus thuringiensis,
    • • Enterococcus faecalis,
    • • Escherichia coli,
    • • Pseudomonas aeruginosa und
    • • Candida albicans.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das selektive Mittel aus mindestens einem der folgenden Bestandteile zusammengesetzt:
    • • Lithiumchlorid,
    • • Ceftazidim,
    • • Amphoterizin B,
    • • Fosfomyzin und/oder
    • • Colistin.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Nachweis von pathogenen Bakterien der Spezies Listeria monocytogenes, das Folgendes umfasst:
    • • Beimpfung eines wie oben definierten Kulturmediums mit einer Probe, die die pathogenen Bakterien enthalten kann,
    • • Inkubation des mit der Probe beimpften Kulturmediums und
    • • Bestimmung der Anwesenheit der pathogenen Bakterien anhand der charakteristischen Farbe und Intensität des Substrats oder der Substrate.
  • Gemäß einer Ausführungsvariante wird die Probe, die pathogene Bakterien enthalten kann, vor dem Beimpfen eines wie oben definierten Kulturmediums angereichert.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsvariante des Verfahrens wird die Bestimmung der Anwesenheit der pathogenen Bakterien anhand der charakteristischen Farbe und Intensität des Substrats oder der Substrate nach 18 bis 24 Stunden Inkubation vorgenommen.
  • Schließlich schlägt die Erfindung eine Verwendung eines Substrats vor, das aus einem wie oben definierten Zielteil und einem hemmenden Teil zur spezifischen Hemmung von Listeria monocytogenes während der Freisetzung des hemmenden Teils zusammengesetzt ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft daher im Wesentlichen den Nachweis der humanpathogenen Spezies Listeria monocytogenes im Vergleich zu den anderen Spezies der Gattung Listeria.
  • Die enzymatische Esteraseaktivität ist ein gutes Nachweismittel für die Spezies Listeria monocytogenes im Vergleich zu den anderen Spezies der Gattung Listeria, mit Ausnahme der spezifischeren, PI-PLC genannten, Esteraseaktivität.
  • Der oben beschriebene Stand der Technik zeigt also die fehlende Spezifität von PI-PLC, die für eine Spezies von Lipiden spezifisch ist, zwischen z. B. der Spezies Listeria monocytogenes und Listeria ivanovii. PI-PLC hydrolysiert die Phosphatidylinositolderivate zwischen dem Glycerin und dem anorganischen Phosphat. Bei dem chromogenen Substrat schneidet das Enzym wie unten beschrieben zwischen dem Marker und dem an das Inositol gebundenen anorganischen Phosphat.
  • Figure 00140001
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Esterasen hydrolysieren die Lipide, die eine oder mehrere Fettsäuren, deren Kettenlänge vorzugsweise 7 bis 10 Kohlenstoffatome beträgt, enthalten. Diese Esterasen hydrolysieren wie unten beschrieben die Esterbindungen zwischen einem Alkohol und einer organischen Fettsäure.
  • Figure 00150001
  • Versuch 1: Prüfung von mehreren Esterasesubstraten, die den gleichen chromogenen Marker, jedoch unterschiedliche Fettsäurekettenlängen aufweisen
  • Bei den geprüften chromogenen Esterasesubstraten handelt es sich um:
    • • 5-Brom-3-indolyl-octanoat, im Folgenden Blue-C8 genannt,
    • • 5-Brom-3-indolyl-nonanoat, im Folgenden Blue-C9 genannt sowie
    • • 5-Brom-3-indolyl-decanoat, im Folgenden Blue-C10 genannt.
  • In einer Mischung aus 40 % Dimethylsulfoxid und 60 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Tween 20) wird eine Stammlösung von Jedem Substrat zu 40 g/l hergestellt. Drei Medien des Typs Columbia werden mit einem ausreichenden Volumen überschichtet, um zu einer Substratendkonzentration von 250 mg/l zu gelangen. Dieses Medium wurde ausgehend von einer Suspension Stärke 2 auf der McFarland-Skala mit Mikroorganismen aus der Sammlung der Anmelderin oder der Sammlung ATCC durch Isolation in Form von drei Rundskalen isoliert. Die Schalen wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und 48 Stunden Inkubation visuell geprüft. Die Farbe dieser Kolonien sowie die Intensität der Färbung wurden aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten dargestellt:
    Figure 00160001
    Tabelle 1: Vergleichende Untersuchung von mehreren Esterasesubstraten, die den gleichen chromogenen Marker, jedoch unterschiedliche Fettsäurekettenlängen aufweisen
  • In Tabelle 1 oben sowie in den folgenden Tabellen bedeutet F die Farbe der Kolonien nach der Inkubation, I die Intensität dieser Farbe, das Symbol „-" ist gleichbedeutend mit der Abwesenheit von Farbe oder Intensität, und ID schließlich definiert die Inkubationsdauer. Es ist anzumerken, dass die Intensität der Farbe eine willkürliche Skala ist, die jedoch allen biologischen Proben und geprüften Medien gemeinsam ist. Diese Skala ist für diesen Versuch sowie für alle folgenden Versuche gültig. Sie kann folgendermaßen definiert werden:
    • • 0 bedeutet keine Aktivität,
    • • 0,1 bedeutet Spuren von Farben,
    • • 0,5 bedeutet sehr schwache Farbe,
    • • 1 bedeutet deutliche Farbe, jedoch mit schwacher Intensität,
    • • 1,5 bedeutet Farbe zwischen Farbe 1 und Farbe 2,
    • • 2 bedeutet klare Farbe mit mittlerer Intensität,
    • • 2,5 bedeutet Farbe zwischen Farbe 2 und Farbe 3,
    • • 3 bedeutet intensive Farbe,
    • • 3,5 bedeutet Farbe zwischen Farbe 3 und Farbe 4,
    • • 4 bedeutet hochintensive Farbe.
  • Nur die Stämme von L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri und L. welshimeri weisen eine graue Farbe auf; bei diesen Stämmen ist daher eine Esteraseaktivität ausgeprägt. Es ist anzumerken, dass unabhängig von der untersuchten Fettsäurekettenlänge intensitätsmäßig eine Abweichung von ungefähr einer Einheit zwischen den Stämmen von L. monocytogenes, die die höchsten Intensitäten aufweisen, und den Stämmen von L. innocua, L. welshimeri und L. seeligeri, die die niedrigsten Intensitäten aufweisen, vorliegt.
  • Für die weiteren Beispiele werden jedoch nur die von Octanoat und Nonanoat abgeleiteten Derivate untersucht werden.
  • Außerdem kann beobachtet werden, dass nur die Stämme von Listeria monocytogenes nach 24 Stunden eine Farbe aufweisen. Es ist daher möglich, Listeria monocytogenes von anderen Listeria-Spezies in Abhängigkeit von der Inkubationstemperatur zu unterscheiden.
  • Versuch 2: Prüfung von mehreren Esterasesubstraten, die unterschiedliche chromogene Marker auf Basis von Indoxyl aufweisen und als Fettsäure Octansäure beinhalten:
  • Bei den geprüften chromogenen Esterasesubstraten handelt es sich um:
    • • 5-Brom-3-indolyl-octanoat, im Folgenden Blue-C8 genannt,
    • • 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-octanoat, im Folgenden X-C8 genannt,
    • • 6-Chlor-3-indolyl-octanoat, im Folgenden Rose-C8 genannt, sowie
    • • 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-octanoat, im Folgenden Magenta-C8 genannt.
  • In einer Mischung aus 40 % Dimethylsulfoxid und 60 % Tween 20 wird eine Stammlösung von jedem Substrat zu 40 g/l hergestellt. Vier Medien des Typs Columbia werden mit einem ausreichenden Volumen überschichtet, um zu einer Substratendkonzentration von 250 mg/l zu gelangen. Dieses Medium wurde ausgehend von einer Suspension Stärke 2 auf der McFarland-Skala mit Mikroorganismen aus der Sammlung der Anmelderin oder der Sammlung ATCC durch Isolation in Form von drei Rundskalen isoliert. Die Schalen wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und 48 Stunden Inkubation visuell geprüft. Die Farbe dieser Kolonien sowie die Intensität der Färbung wurden aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten dargestellt:
    Figure 00190001
    Tabelle 2: Vergleichende Untersuchung von mehreren Esterasesubstraten, die unterschiedliche chromogene Marker auf Basis von Indoxyl und als Fettsäuren Octansäure aufweisen
  • Unabhängig von dem verwendeten Substrat wird die Abweichung der Intensität zwischen den Stämmen von Listeria monocytogenes und Listeria innocua beibehalten. Diese Abweichung ist jedoch bei den Markern 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl und 5-Brom-3-indoxyl stärker ausgeprägt.
  • Der beste Kontrast und die stärksten Intensitäten werden mit dem Marker 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl, der zu einer türkisen Farbe führt, erhalten.
  • Versuch 3: Nachweis einer Esteraseaktivität in einem Flüssigmedium:
  • Bei den geprüften chromogenen Esterasesubstraten handelt es sich um:
    • • 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-acetat, im Folgenden X-C2 genannt,
    • • 3-Indolyl-acetat, im Folgenden Y-C2 genannt,
    • • 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-butyrat, im Folgenden X-C4 genannt,
    • • 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-octanoat, im Folgenden X-C8 genannt,
    • • 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-octanoat, im Folgenden M-C8 genannt sowie
    • • 6-Chlor-3-indolyl-octanoat, im Folgenden R-C8 genannt.
  • Diese Substrate wurden in Näpfchen des Typs API-Teststreifen (geschütztes Warenzeichen) lyophilisiert. Vor der Verwendung werden die in diesen Näpfchen enthaltenen Substrate durch Zugabe eines Inokulationsmediums des Typs agarfreies Columbia-Medium wieder gelöst. Diese Näpfchen werden ausgehend von einer Suspension Stärke 2 auf der McFarland-Skala mit Mikroorganismen aus der Sammlung der Anmelderin oder der Sammlung ATCC beimpft. Die Teststreifen wurden acht Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 4, 6 bzw. 8 Stunden Inkubation visuell geprüft.
  • Die Intensität der Farbe dieser Kolonien wurde aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten dargestellt:
    Figure 00210001
    Tabelle 3: Vergleichende Untersuchung von mehreren Esterasesubstraten, die aus unterschiedlichen Chromogenen auf Basis von Indoxyl und aus Fettsäuren mit unterschiedlichen Kettenlängen zusammengesetzt sind
  • In Flüssigmedien sind die Substrate, die eine Kettenlänge von unter vier Kohlenstoffatomen aufweisen, nicht unterscheidungsfähig genug, um zwischen den unterschiedlichen Listeria-Spezies untereinander zu unterscheiden. Im Gegensatz dazu ermöglichen die Substrate X-C4 und X-C5 unter den geprüften Arbeitsbedingungen, zu einem Farbkontrast zwischen L. monocytogenes einerseits und den anderen Spezies der Gattung andererseits zu gelangen. Es weisen nämlich nur L. welshimeri und L. seeligeri Farbe auf, diese Farben sind jedoch sehr schwach. Man kann sich „eine Positivitätsschwelle" des Tests von gleich 1 vorstellen. Für Intensitäten unter 1 würde der Prüfstamm als negativ für den Test bezeichnet werden; für Intensitäten über 1 wäre der Prüfstamm positiv. Im vorhandenen Fall würde es sich also um einen Stamm von L. monocytogenes handeln.
  • Versuch 4: Gleichzeitiger Nachweis einer Esteraseaktivität und einer Osidaseaktivität in einem Agar-Agar-Medium:
  • Es wurden verschiedene Paare von chromogenen Esterasesubstraten und chromogenen Osidasesubstraten geprüft, nämlich:
    • • 5-Brom-3-indolyloctanoat und 6-Chlor-3-indolyl-β-D-glucosid, Bezeichnung: Paar 1,
    • • 5-Brom-3-indolyloctanoat und 6-Chlor-3-indolyl-β-D-cellobiosid, Bezeichnung: Paar 2,
    • • 5-Brom-3-indolyloctanoat und 6-Chlor-3-indolyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid, Bezeichnung: Paar 3,
    • • 5-Brom-3-indolyloctanoat und 6-Chlor-3-indolyl-α-D-mannosid, Bezeichnung: Paar 4,
    • • 5-Brom-4-chlor-3-indolylnonanoat und 6-Chlor-3-indolyl-α-D-glucosid, Bezeichnung: Paar 5,
    • • 5-Brom-4-chlor-3-indolylnonanoat und 6-Chlor-3-indolyl-β-D-cellobiosid, Bezeichnung: Paar 6,
    • • 5-Brom-4-chlor-3-indolylnonanoat und 6-Chlor-3-indolyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid, Bezeichnung: Paar 7 und
    • • 5-Brom-4-chlor-3-indolylnonanoat und 6-Chlor-3-indolyl-α-D-mannosid, Bezeichnung: Paar 8.
  • In einer Mischung aus 40 % Dimethylsulfoxid und 60 % Tween 20 wird eine Stammlösung von jedem Esterasesubstrat zu 40 g/l hergestellt. Außerdem wird eine Stammlösung von jedem Osidasesubstrat in Dimethylsulfoxid hergestellt. Acht Medien des Typs Columbia werden mit einem ausreichenden Volumen der Stammlösung des Esterasesubstrats, das an jedes der oben beschriebenen paare angepasst ist, durch Überschichten versetzt, um zu einer Substratendkonzentration von 250 mg/l zu gelangen. Parallel dazu werden diese acht Medien auch mit einem ausreichenden Volumen des Osidasesubstrats, das an jedes der oben beschriebenen Paare angepasst ist, versetzt, um je nach Substrat zu einer Endkonzentration zwischen 100 und 200 mg/l zu gelangen. Dieses Medium wird ausgehend von einer Suspension Stärke 2 auf der McFarland-Skala durch Isolation in Form von drei Rundskalen mit Mikroorganismen aus der Sammlung der Anmelderin oder der Sammlung ATCC beimpft. Die Schalen wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und 48 Stunden Inkubation visuell geprüft.
  • Die Farbe der Kolonien sowie die Intensität dieser Farbe wurden aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 unten dargestellt:
    Figure 00240001
    Figure 00250001
    Figure 00260001
    Tabelle 4: Vergleichende Untersuchung von unterschiedlichen Paaren von chromogenen Substraten, mit denen gleichzeitig eine Esteraseaktivität und eine Osidaseaktivität in einem Agar-Agar-Medium nachgewiesen werden kann
  • Unabhängig von den geprüften Substratpaaren liegt ein Farbunterschied zwischen den Stämmen von Listeria monocytogenes und den Stämmen von Listeria innocua und Listeria ivanovii vor.
  • Der stärkste Kontrast wird mit 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-nonanoat und einem Osidasesubstrat auf Basis von 6-Chlor-3-indolyl, unabhängig von der Zielaktivität, erzielt. Man kann daher von vornherein alle unterschiedlichen Spezies von Esterasesubstraten und Osidasesubstraten paarweise verwenden, egal, ob es sich um α-Osidasen oder um β-Osidasen handelt.
  • Man kann jedoch beobachten, dass die besten Ergebnisse mit 6-Chlor-3-indolyl-β-D-glucosid, 6-Chlor-3-indolyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid und 6-Chlor-3-indolyl-α-D-mannosid erhalten werden.
  • Versuch 5: Gleichzeitiger Nachweis einer Esteraseaktivität und einer Phosphataseaktivität in einem Agar-Agar-Medium:
  • Ein Agar-Agar-Medium des Typs Columbia wurde nacheinander mit zwei Stammlösungen von zwei Substraten, nämlich 5-Brom-4-chlor-3-indolyloctanoat (X-C8) (Endkonzentration in Medium: 250 mg/l) und 6-Chlor-3-indolyl-phosphat (Rose P) (Endkonzentration in Medium: 750 mg/l) durch Überschichten versetzt. Die Stammlösung von 5-Brom-4-chlor-3-indolyloctanoat wurde wie in den vorhergehenden Beispielen hergestellt, und die von 6-Chlor-3-indolyl-phosphat wurde zu 50 g/l in Dimethylsulfoxid hergestellt.
  • Dieses Medium wurde anschließend ausgehend von einer Suspension Stärke 2 auf der MCFarland-Skala durch Isolation in drei Rundskalen mit Mikroorganismen aus der Sammlung der Anmelderin oder der Sammlung ATCC beimpft. Die Schalen wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und 48 Stunden Inkubation visuell geprüft.
  • Die Farbe der Kolonien sowie die Intensität dieser Farbe wurden aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 unten dargestellt:
    Figure 00280001
    Tabelle 5: Gleichzeitiger Nachweis einer Esterase- und einer Phosphataseaktivität
  • Die gleichzeitige Untersuchung dieser beiden Aktivitäten gestattet die Auseinanderhaltung von zwei Listeria-Gruppen, und zwar einerseits L. monocytogenes, L. seeligeri und L. welshimeri und andererseits L. grayi, L. innocua und L. ivanovii. Dieses Nachweissystem kann noch durch Variieren der Formulierung des Mediums verbessert werden, wie dies in Versuch 6 beschrieben werden wird, oder man kann L. monocytogenes von allen anderen Spezies der Gattung Listeria auseinanderhalten.
  • Versuch 6: Nachweis von Listeria monocytogenes im Vergleich zu Listeria welshimeri und Listeria seeligeri in einem Agar-Agar-Medium, das ein Esterasesubstrat und ein Osidasesubstrat enthält:
  • Bei dem geprüften Paar der chromogenen Esterasesubstrate und der chromogenen Osidasesubstrate handelt es sich um das folgende: 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-octanoat und 6-Chlor-3-indolyl-N-acatyl-β-D-glucosaminid.
  • Die Medien und die Substratstammlösungen wurden wie in den vorhergehenden Beispielen hergestellt. Dieses Basismedium wird in vier Medien aufgeteilt, die jeweils mit Folgendem versetzt werden:
    • • 40 g/l Xylose, Bezeichnung: Medium 1,
    • • 40 g/l Tagatose, Bezeichnung: Medium 2,
    • • eine Mischung aus 45 g/l Kohlenhydrate mit 30 g/l Xylose und 15 g/l Tagatose, Bezeichnung: Medium 3,
    • • eine Mischung aus 65 g/l Kohlenhydrate mit 35 g/l Xylose und 30 g/l Tagatose, Bezeichnung: Medium 4.
  • Dieses Medium wurde anschließend ausgehend von einer Suspension Stärke 2 auf der McFarland-Skala durch Isolation in drei Rundskalen mit Mikroorganismen aus der Sammlung der Anmelderin beimpft. Die Schalen wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und 48 Stunden Inkubation visuell geprüft.
  • Die Farbe der Kolonien sowie die Intensität dieser Farbe wurden aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 unten dargestellt:
    Figure 00300001
    Figure 00310001
    Tabelle 6: Verbesserung der Spezifität für L. monocytogenes gegenüber L. welshimeri und L. seeligeri durch Zusatz einer sehr hohen Kohlenhydratkonzentration
  • Der Zusatz von Kohlenhydraten in hohen Konzentrationen (40 g/l oder darüber) gestattet die Unterscheidung von L. monocytogenes von allen anderen Listeria-Spezies, und dies ausschließlich aufgrund eines Farbkriteriums. Trotzdem wurde gezeigt, dass es möglich war, zu einer Unterscheidung zwischen Spezies zu gelangen, und zwar durch Verwendung von niedrigeren Konzentrationen bis zu 10 g/l, wie dies der Inhalt des Patents FR-B-2.708.285 beweist. Im Unterschied zu diesem Patent liegt hier jedoch ein Farbwechsel durch Hemmung einer Enzymaktivität und nicht eine abgeleitete Farbe, die sich von der Grundfarbe des Markers unterscheidet, vor.
  • Versuch 7: Zusatz von selektiven Mitteln zur Hemmung von grampositiven Bakterien, bei denen es sich nicht um Listerien handelt, und von gramnegativen Bakterien sowie Hefen:
  • Das Basismedium des Typs Columbia enthält:
    • • 5-Brom-4-chlor-3-indolyloctanoat in einer Konzentration von 250 mg/l, das durch eine Stammlösung in einer Mischung aus 40 Dimethylsulfoxid und 60 % Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Tween 20) bereitgestellt wird,
    • • 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-β-N-acetylglucosaminid in einer Konzentration von 150 mg/l, das durch eine Stammlösung in DMSO bereitgestellt wird,
    • • Xylose in einer Konzentration von 10 g/l und Tagatose in einer Konzentration von 5 g/l, sowie
    • • eine Selektionsmischung, die folgendermaßen definiert ist: Lithiumchlorid in einer Konzentration von 5 g/l, Ceftazidim in einer Konzentration von 20 mg/l, Amphoterizin B einer Konzentration von 4 mg/l, Fosfomycin in einer Konzentration von 10 mg/l und Colistin in einer Konzentration von 5 mg/l.
  • Dieses Medium wurde anschließend ausgehend von einer Suspension Stärke 2 auf der McFarland-Skala durch Isolation in drei Rundskalen mit Mikroorganismen aus der Sammlung der Anmelderin beimpft. Die Schalen wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und 48 Stunden Inkubation visuell geprüft. Die Farbe der Kolonien sowie die Intensität dieser Farbe wurden aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 unten dargestellt:
    Figure 00320001
    Figure 00330001
    Figure 00340001
    Tabelle 7: Vergleich von Medien mit oder ohne selektive(n) Mittel(n)
  • In Tabelle 7 oben bedeutet F die Farbe der Kolonien nach der Inkubation, I die Intensität dieser Farbe, das Symbol „–" ist gleichbedeutend mit der Abwesenheit von Farbe oder Intensität, und ID schließlich definiert die Inkubationsdauer. Es ist anzumerken, dass die Intensität der Farbe eine willkürliche Skala ist, die jedoch allen biologischen Proben und geprüften Medien gemeinsam ist.
  • Es kann angemerkt werden, dass in GegenwSpezies von selektiven Mitteln die geprüften störenden Bakterien und Hefen (also diejenigen, bei denen es sich nicht um Listeria handelt) insgesamt kein Wachstum aufweisen und daher gehemmt sind. Das Vorhandensein von selektiven Mittel modifiziert die Farben der geprüften Listeria-Stämme nicht.
  • Dieser Versuch zeigt ebenfalls, dass auch ohne selektive Mittel die Unterscheidung zwischen Listeria monocytogenes einerseits und den geprüften störenden Bakterien und Hefen, also inklusive den anderen Listerien, andererseits möglich ist, was mit den im Stand der Technik beschrieben Substraten und Kultur- oder Reaktionsmedien nicht der Fall war.

Claims (22)

  1. Verwendung eines Substrats zum direkten Nachweis von pathogenen Listeria monocytogenes Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat durch eine Esteraseaktivität, die sich von der für Phosphatidylinositol (PI-PLC) spezifischen Phospholipase-C-Aktivität unterscheidet, gespalten wird, wobei die Esteraseaktivität für Listeria monocytogenes spezifisch ist, und dass es einen Zielteil umfasst, der aus einer Fettsäure mit einer Kohlenstoffkette einer Länge von 4 bis 20 Kohlenstoffatomen zusammengesetzt ist.
  2. Verwendung eines Substrats gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Esteraseaktivität eine spezifische Enzymaktivität ist, das heißt, sie spaltet die Esterbindung zwischen dem Markerteil und dem Zielteil, die das Substrat bilden.
  3. Verwendung eines Substrats gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die gespaltene Bindung eine Esterbindung zwischen einer vom Markerteil getragenen Alkoholfunktion und einer den Zielteil bildenden organischen Säure ist.
  4. Verwendung eines Substrats gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Markerteil aus einem Chromogen zusammengesetzt ist, wie etwa einem Indoxyl, das aus einem der folgenden Bestandteile zusammengesetzt sein kann: • 5-Brom-3-indoxyl oder • 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl oder • 6-Chlor-3-indoxyl oder • 5-Brom-6-chlor-3-indoxyl oder • 6-Brom-3-indoxyl.
  5. Verwendung eines Substrats gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Zielteil aus einer Fettsäure mit einer Kohlenstoffkette einer Länge von 4 bis 10 Kohlenstoffatomen zusammengesetzt ist.
  6. Verwendung eines Substrats gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es aus 5-Brom-4-chlor-3-indolylbutyrat, 5-Brom-4-chlor-3-indolyloctanoat, 5-Brom-4-chlor-3-indolylnonanoat oder 5-Brom-4-chlor-3-indolyldecanoat zusammengesetzt ist.
  7. Verwendung eines Substrats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat mit mindestens einem anderen Substrat gekoppelt ist, was das Ermitteln mindestens einer anderen Enzymaktivität der gesamten oder eines Teils der Spezies Listeria ermöglicht.
  8. Verwendung von Substraten gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat, das das Ermitteln der Esteraseaktivität, mit Ausnahme des Enzyms PI-PLC, ermöglicht, eine andere Färbung aufweist als das andere Substrat, was das Ermitteln einer anderen Enzymaktivität als die vorangehend definierte Esteraseaktivität ermöglicht.
  9. Verwendung von Substraten gemäß Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die andere Enzymaktivität der gesamten oder eines Teils der Spezies Listeria eine Osidase-, Phosphatase- oder Aminopeptidaseaktivität ist.
  10. Verwendung von Substraten gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Markerteil des anderen Substrats aus Folgendem als Basis zusammengesetzt ist: • 5-Brom-3-indoxyl oder • 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl oder • 6-Chlor-3-indoxyl oder • 5-Brom-6-chlor-3-indoxyl oder • 6-Brom-3-indoxyl.
  11. Verwendung von Substraten gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das andere Substrat aus Folgendem zusammengesetzt ist: • 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-β-D-glucosid oder • 6-Chlor-3-indolyl-β-D-glucosid oder • 6-Chlor-3-indolyl-β-D-cellobiosid oder • 6-Chlor-3-indolyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid oder • 6-Chlor-3-indolyl-α-D-mannosid oder • 6-Chlor-3-indolylphosphat.
  12. Verwendung eines Reaktionsmediums zum direkten Nachweis von Listeria monocytogenes, wobei mindestens ein Substrat verwendet wird, das durch eine Esteraseaktivität, die sich von der für Phosphatidylinositol (PI-PLC) spezifischen Phospholipase-C-Aktivität unterscheidet, gespalten wird, wobei die Esteraseaktivität spezifisch für Listeria monocytogenes ist, und das einen Zielteil umfasst, der aus einer Fettsäure mit einer Kohlenstoffkette einer Länge von 4 bis 20 Kohlenstoffatomen zusammengesetzt ist.
  13. Verwendung eines Mediums gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat, das das Ermitteln einer sich von der PI-PLC-Aktivität unterscheidenden Esteraseaktivität ermöglicht, eine Konzentration von 20 mg/l bis 3 g/l, oder vorzugsweise von 50 mg/l bis 1 g/l, oder vorzugsweise von 100 bis 600 mg/l oder vorzugsweise von ungefähr 250 mg/l aufweist.
  14. Verwendung eines Mediums gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein anderes Substrat umfasst, das das Ermitteln einer anderen Aktivität, wie etwa einer Osidase-, Phosphatase- oder Aminopeptidaseaktivität, ermöglicht, in einer Konzentration von 10 mg/l bis 500 mg/l, vorzugsweise von 50 bis 300 mg/l und am besten von 100 bis 200 mg/l aufweist.
  15. Verwendung eines Mediums gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium ein Agar-Agar-Medium oder ein flüssiges Medium ist.
  16. Verwendung eines Mediums gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Mittel beinhaltet, das es ermöglicht, Listeria monocytogenes von Listeria welshimeri und Listeria seeligeri zu unterscheiden, nämlich: • Zugabe mindestens eines durch Listeria welshimeri und Listeria seeligeri und nicht durch Listeria monocytogenes azidifizierten Kohlenhydrats (zum Beispiel Xylose und/oder D-Tagatose) oder • Zugabe mindestens eines durch Listeria monocytogenes und eventuell Listeria innocua und/oder Listeria ivanovii und/oder Listeria grayii azidifizierten Kohlenhydrats oder • Zugabe mindestens eines Substrats, das das Aufdecken einer für mindestens Listeria welshimeri und Listeria seeligeri jedoch nicht für Listeria monocytogenes spezifischen Osidase-(β-Maltosidase) und/oder Phosphatase- und/oder Aminopeptidase-(L-glycinaminopeptidase)-Aktivität ermöglicht, oder • Zugabe mindestens eines natürlichen Substrats aus Phospholipase (PLC), wie etwa Phosphatidylinositol (PI) und/oder Phosphatidylcholin (PC).
  17. Verwendung eines Mediums gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass es ein selektives Mittel beinhaltet, das es ermöglicht, Listeria monocytogenes von mindestens den folgenden Spezies zu unterscheiden: • Staphylococcus aureus, • Bacillus thuringiensis, • Enterococcus faecalis, • Escherichia coli, • Pseudomonas aeruginosa und • Candida albicans.
  18. Verwendung eines Mediums gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das selektive Mittel aus mindestens einem der folgenden Bestandteile zusammengesetzt ist: • Lithiumchlorid, • Ceftazidim, • Amphoterizin B, • Fosfomyzin und/oder • Colistin.
  19. Verfahren zum Nachweis von pathogenen Bakterien der Spezies Listeria monocytogenes, das Folgendes umfasst: • Beimpfung eines Kulturmediums mit einer Probe, die die pathogenen Bakterien enthalten kann, das mindestens ein Substrat verwendet, das durch eine Esteraseaktivität, die sich von der für Phosphatidylinositol (PI-PLC) spezifischen Phospholipase-C-Aktivität unterscheidet, gespalten wird, wobei die Esteraseaktivität spezifisch für Listeria monocytogenes ist, und das einen Zielteil umfasst, der aus einer Fettsäure mit einer Kohlenstoffkette einer Länge von 4 bis 20 Kohlenstoffatomen zusammengesetzt ist; • Inkubation des mit der Probe beimpften Kulurmediums und • Bestimmung der Anwesenheit der pathogenen Bakterien anhand der charakteristischen Farbe und Intensität des Substrats oder der Substrate.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe, die pathogene Bakterien enthalten kann, vor dem Beimpfen eines Kulturmediums angereichert wird, das mindestens ein Substrat verwendet, das durch eine Esteraseaktivität, die sich von der für Phosphatidylinositol (PI-PLC) spezifischen Phospholipase-C-Aktivität unterscheidet, gespalten wird, wobei die Esteraseaktivität spezifisch für Listeria monocytogenes ist, und das einen Zielteil umfasst, der aus einer Fettsäure mit einer Kohlenstoffkette einer Länge von 4 bis 20 Kohlenstoffatomen zusammengesetzt ist.
  21. Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Anwesenheit der pathogenen Bakterien anhand der charakteristischen Farbe und Intensität des Substrats oder der Substrate nach 18 bis 24 Stunden Inkubation vorgenommen wird.
  22. In-vitro-Verwendung eines Substrats, das durch eine Esteraseaktivität, die sich von der für Phosphatidylinositol (PI-PLC) spezifischen Phospholipase-C-Aktivität unterscheidet, gespalten wird, wobei die Esteraseaktivität spezifisch für Listeria monocytogenes ist, und das einen Zielteil, der aus einer Fettsäure mit einer Kohlenstoffkette einer Länge von 4 bis 20 Kohlenstoffatomen zusammengesetzt ist, und einen hemmenden Teil zur spezifischen Hemmung von Listeria monocytogenes während der Freisetzung des hemmenden Teils umfasst.
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