DE60309862T2 - Plattierungsmedien - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Plattierungsmedien für den Nachweis und die Identifikation von verschiedenen Bakterien, Hefen oder Schimmelpilzen.
  • Potenziell fluorogene/chromogene Verbindungen sind Verbindungen, welche beim Kontakt mit gewissen Mikroorganismen oder mit von solchen Mikroorganismen produzierten Substanzen fluorogen/chromogen werden und demzufolge fluoroskopisch/visuell/spektroskopisch nachweisbar sind. Solche Verbindungen sind in WO 99/48899(= EP 949266 ) beziehungsweise WO 98/38332 von der Anmelderin beschrieben worden. In jedem dieser Fälle ist es entweder die fluorogene oder die chromogene Verbindung, die für den Nachweis verwendet wird.
  • Wie in diesen Referenzen beschrieben, kann das als "phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C" (d.h. 1-Phosphatidyl-D-myo-inositol-inositolphosphohydrolase, hier als PI-PLC abgekürzt; Enzymklassifikation EC 3.1.4.10) bezeichnete Enzym im Überstand von Kulturen verschiedener Bakterien, welche pathogene Bakterien wie Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Bakterien der Bacilluscereus-Gruppe, insbesondere Bacillus cereus und Bacillus thuringiensis, Staphylococcus aureus und Clostridium novyi einschliessen, gefunden werden (vgl. J. G. Songer, Trends in Microbiology 5 (1997), 156).
  • Ein Kulturmedium zum Nachweis von Listeria monocytogenes, das vornehmlich aus Agar, Nährstoffen sowie aus Antibiotika zur Unterdrückung von unerwünschten Keimen besteht und ebenfalls auf nur einem chromogenen Substrat beruht, ist in WO 99/04032 beschrieben.
  • Ebenso beruht das in US 6,284,517 beschriebene Plattierungsmedium für Bacillus cereus und Bacillus thuringiensis auf nur einem chromogenen Substrat der oben erwähnten Art. WO 99/48899 beschreibt den Nachweis von PI-PLC produzierenden Mirkroorganismen durch die aufeinander folgende Verwendung eines fluorogenen und eines chromogenen Agens. Manafi (International Journal of Food Microbiology (1998), Vol. 3, Seiten 45–58) beschreibt die simultane Verwendung eines fluorogenen und eines chromogenen Agens zum Nachweis von zwei verschiedenen Markern zum Nachweis von Mikroorganismen in einem Medium.
  • Der wichtigste Vorteil bei der Verwendung von PI-PLC-Substraten für die mikrobiologische Diagnose besteht in der Tatsache, dass PI-PLC-Enzyme Virulenzfaktoren dieser Mikroorganismen sind und solche Medien bei der Nahrungsmittel-Mikrobiologie nützlich sind.
  • Allerdings besteht ein Nachteil der oben erwähnten Medien in der Zeit, die zum Ausführen des Tests benötigt wird.
  • Mit dem im der oben erwähnten WO 99/48899 ( EP 949266 ) beschriebenen Listeria-Nachweissystem werden gewöhnlich 24 Stunden benötigt, um in der selektiven Anreicherungsbrühe eine eindeutige Fluoreszenz zu erhalten, und es wird mindestens eine zusätzliche Zeit von 24 bis zu 48 Stunden Inkubation des Plattierungsmediums benötigt, um die Mikroorganismen zu Kolonien anwachsen zu lassen, die eine wohldefinierte Farbe zeigen. Andererseits können fluorogene Verbindungen, falls sie in signifikanten Konzentrationen verwendet werden, die Stabilität des Anreicherungsmediums verringern. Solche Substrate können auch die Wiederbelebungseffizienz und -selektivität des Mediums beeinflussen.
  • Andererseits bedeutet die alleinige Verwendung eines chromogenen Plattierungsmediums den Verzicht auf ein schnelles Screening-Werkzeugs für den interessierenden Mikroorganismus (den Target-Mikroorganismus).
  • Da überdies die Primärprobe ohnehin angereichert werden muss, um die Mikroorganismen auf eine ausreichende Zelldichte anwachsen zu lassen, bevor sie auf ein Plattierungsmedium aufgestrichen wird, kann die Zeit auf diese Weise nicht wesentlich verkürzt werden.
  • Da es z.B. bei der Testung von Nahrungsmitteln hauptsächlich darum geht, die in der Probe vorliegenden Bakterien nicht nur nachzuweisen, sondern auch zu zählen, besteht ein grosser Bedarf für ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Identifikation und Auszählung.
  • Dennoch sind viele der oben erwähnten Plattierungsmedien nicht immer selektiv genug für den interessierenden Mikroorganismus, da das Wachstum von unerwünschten Bakterien nicht ausreichend unterdrückt wird. Ausserdem ist die chromogene Antwort auf bakterielle PI-PLC nicht dazu optimiert, stark gefärbte Kolonien mit einer minimalen Menge des chromogenen Substrates zu erhalten.
  • Eine bessere Differenzierung der pathogenen, PI-PLC produzierenden Mikroorganismen anderer Spezies wäre ebenfalls wünschenswert.
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass eine Kombination eines chromogenen und eines fluorogenen Substrates, z.B. in einem festen Agarmedium inkorporiert, zum simultanen Screening und zum Nachweis von phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C produzierenden pathogenen Bakterien verwendet werden kann.
  • Dementsprechend ist das erfindungsgemässe Plattierungsmedium wie in Anspruch 1 definiert. Bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemässen Plattierungsmediums sind in den Ansprüche 2 bis 27 spezifiziert.
  • Ausserdem stellt die Erfindung ein neues Nachweisverfahren, wie in Anspruch 28 definiert, bereit, während bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens in den Ansprüchen 29 bis 31 spezifiziert sind.
  • Im Allgemeinen besteht ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemässen Plattierungsmediums in der eingesparten Zeit (z.B. mindestens 24 bis 48 Stunden) im Vergleich zu den bisher bekannten Verfahren.
  • Die erfindungsgemässen Plattierungsmedien stellen ein verbessertes Mittel zum Screening wie auch zur Detektion, zur Isolierung und zur Auszählung von Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen, welche ein PI-PLC-Enzym, z.B. als Virulenzfaktor wie Listeria spp. und Bacillus spp. produzieren, dar. In diesem Zusammenhang kann die Auswahl von einzelnen Nährstoffen wie auch die Auswahl einer Kombination von geeigneten Nährstoffen durch Charakterisierung der Wachstumsparameter, z.B. durch Analyse unter Verwendung einer Bioscreen C Vorrichtung verbessert werden.
  • Die Begriffe "potenziell fluorogen" und "potenziell chromogen" wie sie hier unter Bezugnahme auf die oben erwähnten Verbindungen verwendet werden, weisen auf die Fähigkeit dieser Verbindungen hin, bei der Wechselwirkung mit PI-PLC "fluorogen" beziehungsweise "chromogen", d.h. fluoroskopisch/visuell aktiv und mittels fluoroskopischen Verfahren und visueller, Inspektion beziehungsweise Chromoskopie, nachweisbar zu werden.
  • Beim Kontakt mit PI-PLC wird eine potenziell fluorogene Verbindung der Formel (I) zu einem starken Fluorophor, welches ohne weiteres auf dem Plattierungsmedium nachgewiesen werden kann, z.B. mittels eines herkömmlichen in der Hand gehaltenem Fluorometers, das z.B. für den Betrieb bei einer Wellenlänge im ultravioletten Bereich wie beispielsweise 366 nm, die für praktische Zwecke günstig ist, vorgesehen ist.
  • Dieser einfache Ansatz für die Detektion kann erfindungsgemäss als erster Screening-Schritt des neuen Identifikationsverfahrens verwendet werden. Eine fluorogene Verbindung ist für das Screening vorteilhaft, weil der Nachweis eines Fluorophors erheblich empfindlicher ist als der Nachweis eines Chromophors. Dementsprechend ist nun bei der Verwendung eines festen Plattierungsmediums gemäss der vorliegenden Erfindung die frühe Wahrnehmung der Anwesenheit von PI-PLC freisetzenden Mikroorganismen möglich.
  • Bei diesem Screening-Test kann das Fehlen von Fluoreszenz als eine "negative" Reaktion in dem Sinne betrachtet werden, dass keine weitere Inkubation des Mediums benötigt wird, wogegen eine "positive" Reaktion im ersten Schritt durch weitere Inkubation zwecks Bildung einer Farbe verifiziert werden muss.
  • Die erfindungsgemässen Plattierungsmedien sind zur Detektion, Identifikation und Auszählung von Spezies der Bacillus-cereus-Gruppe, z.B. Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis und Bacillus anthracis wie auch zur Detektion, Identifikation und Auszählung von Listeria monocytogenes und Listeria ivanovii geeignet.
  • Das erfindungsgemässe Verfahren ist auch zur Detektion und Identifikation von Spezies oder Stämmen der Bacilluscereus-Gruppe und zur Auszählung von probiotischen Stämmen von Bacillus cereus (Paciflor®, Toyocerin®) geeignet.
  • Probiotische B. cereus sind nicht-toxische, "abgeschwächte" Stämme. Im Gegensatz zu den resistenten Wildstämmen von B. cereus sind sie gegenüber Penicillin G und Cefamandol suszeptibel. Die schnelle Erkennung von probiotischen gegenüber wilden Stämmen ist ein signifikanter Vorteil bei der Diagnose von B. cereus.
  • Die erfindungsgemässen Plattierungsmedien können auch für die direkte Auszählung der Target-Mikroorganismen ohne jeglichen Anreicherungsschritt sowie für das sogenannte Kontaktplattenverfahren, bei dem die interessierende Probe zur Inokulation direkt auf das Medium platziert wird, verwendet werden. Dieses einfache und schnelle Testprotokoll ist vorteilhaft, weil keine Anreicherungsschritte notwendig sind. Es ist für die Testung von Nahrungsmitteln und die Hygienekontrolle besonders nützlich.
  • Wenn das Medium für die direkte Plattierung verwendet wird, muss ein neutralisierendes Agens zugegeben werden, um eine etwaige Inhibition z.B. durch Desinfektionsmittel, die in solchen Proben vorkommen, zu überwinden. Ein weiterer Vorteil eines neutralisierenden Agens wie Lecithin besteht in seinem Beitrag zur besseren Erkennung der Target-Mikroorganismen durch Verstärkung der Färbung und durch Bildung einer Niederschlagszone um die Kolonien des Target-Mikroorganismus.
  • Eine besonders bevorzugte Verbindung zur Verwendung als fluorogenes Substrat der Formel (I) ist erfindungsgemäss das N-Methyl-morpholin-Salz von 4-Methylumbelliferyl-myo-inositol-1-phosphat.
  • Im Allgemeinen sind racemische Gemische der Verbindungen der Formel (I) und/oder (IV) zur Verwendung in dem erfindungsgemässen Plattierungsmedien geeignet.
  • Beispielsweise hat 4-Methylumbelliferon (entstehend aus der Spaltung des bevorzugten 4-Methylumbelliferyl-myo-inositol-1-phosphates oder eines Salzes davon mittels PI-PLC) ein Absorptionsmaximum von 360 nm bei pH-Werten über 8, während die entsprechenden Verbindungen der Formel (I) bei 360 nm nur eine vernachlässigbare Absorption zeigen.
  • 4-Methylumbelliferon (4-Methyl-7-hydroxy-coumarin) ist ein sehr gutes Fluorogen mit einem Emissionsmaximum bei 448 nm (Anregung bei 364 nm).
  • Bezüglich der erfindungsgemässen Nachweisverfahren bezieht sich der hier verwendete Begriff "Primärprobe" auf ein direkt von einer verdächtigen Quelle erhaltenes Material, das von physiologischer oder anderer Herkunft sein kann, wie beispielsweise Blut, Exkremente oder infizierte Nahrungsmittel, Futter, Wasserquellen, Getränke oder ähnliche Materialien, die zur Beherbergung der interessierenden Bakterien fähig sind. Proben aus der Nahrungsmittelverarbeitung sind ebenfalls von Interesse.
  • In beiden ihrer Aspekte als Screening- beziehungsweise Identifikationstest stellt die Erfindung Mittel bereit, um die bakterielle Aktivität von Mikroorganismen mit PI-PLC-Aktivität, einschliesslich Mitgliedern der Bacillus-cereus-Gruppe wie Bacillus thuringiensis und Bacillus cereus wie auch Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Staphylococcus aureus, Clostridium novyi, Clostridium perfringens, Legionella spp., Helicobacter pylori, Trypanosoma brucei, Aspergillus fumingatus anzuzeigen.
  • Die Erfindung ist für das Screening, die Detektion und die Isolierung von Pathogenen wie Listeria monocytogenes, Bacillus cereus und Bacillus anthracis besonders nützlich.
  • Bacillus anthracis ist unfähig, PI-PLC zu produzieren, und kann demnach von den anderen Mitgliedern der B. cereus-Gruppe aufgrund seiner typischen, aber nicht-gefärbten Kolonien gut differenziert werden.
  • Bei der Verwendung von Verbindungen der Formel (I) und/oder (IV) in einem Screening- und/oder Identifikationstest auf bakterielle Aktivität, welche durch die Anwesenheit von PI-PLC angezeigt wird, kann es vorteilhaft sein, eine Anreicherungsbrühe bereitzustellen, in welche die primäre Probe transferiert wird, um die bakterielle Aktivität vor der Plattierung zu erhöhen. Bei manchen Anwendungen des erfindungsgemässen Verfahrens ist es bevorzugt, eine Anreicherungsbrühe zu verwenden, die überdies für die interessierenden Bakterien selektiv sein kann. Der Begriff "Anreicherung", welche selektiv sein kann aber nicht sein muss, wird von Fachpersonen, welche das für die interessierenden Bakterien am besten geeignete Anreicherungsverfahren auszuwählen vermögen, verstanden. Im Allgemeinen kann die Inhibition des Wachstums von anderen das PI-PLC-Enzym produzierenden Bakterien durch Verwendung verschiedener Kombinationen von selektiven Verbindungen, die Antibiotika und andere Inhibitoren einschliessen, erreicht werden, und das Medium kann für irgend ein Pathogen, das PI-PLC enthält oder produziert, spezifisch gemacht werden.
  • Im Allgemeinen wird angenommen, dass die Erfindung gewisse Synergien von Verbindungen der Formel (I) bei Kombination mit Verbindungen der Formel (IV) ergibt.
  • In einer Gruppe von bevorzugten Verbindungen der Formel (IV) sind R6, R7 und R8 unabhängig voneinander ausgewählt Wasserstoff- oder Halogenatome, vorzugsweise Chlor und Brom; während R9 und R10 Wasserstoffe sind und X Hydroxy ist; wiederum können die Salze von solchen Verbindungen mit organischen oder anorganischen Basen als das potenzielle Chromophor verwendet werden, das z.B. bei Spaltung durch PI-PLC, Dimerisation und anschliessender Oxidation tief gefärbte Indigofarbstoffe ergibt, insbesondere wobei R10 Wasserstoff oder Methyl ist.
  • Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel (IV) zur Verwendung als chromogene Komponente sind die Salze von 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphat, 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphat und 6-Chloro-3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphat. Unter diesen ist das Ammoniumsalz von 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphat besonders bevorzugt. Im Allgemeinen können Verbindungen der Formel (IV) als Racemat verwendet werden.
  • Zur Veranschaulichung einer wichtigen Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird nun ein bevorzugtes Testverfahren zur Identifikation von Listeria monocytogenes ausführlicher erklärt. Dieses Verfahren umfasst gegebenenfalls die Verwendung einer Anreicherungsbrühe, welche versehrte Listeria-monocytogenes-Zellen gemäss EN ISO 11290 reparieren oder wiederbeleben kann.
  • Danach wird eine kleine Menge, z.B. eine Drahtschlinge, welche eine kleine Menge Flüssigkeit der Anreicherungsbrühe transportiert, auf ein selektives Plattierungsmedium, welches das fluorogene Substrat, vorzugsweise ein wie oben definiertes 4-Methylumbelliferyl-myo-inositol-1-phosphat der Formel (I) enthält, aufgestrichen.
  • Vorzugsweise wird dieses Plattierungsmedium selektiv gemacht, um überdies das Wachstum von anderen das PI-PLC-Enzym enthaltenden Bakterien ausser Listeria spp. sowie von verwandten grampositiven Bakterien zu verhindern, woraus sich für Listeria-monocytogenes-Zellen eine optimale Umgebung für das Wachstum auf dem Plattierungsmedium unter Produktion von isolierten Kolonien ergibt.
  • Im Anschluss an die Inkubation, typischerweise nach 16 bis 24 Stunden, wird das Medium in ein W-Fluorometer mit einer langen Wellenlänge bei 366 nm gebracht und auf Fluoreszenz untersucht. Eine positive fluorogene Reaktion um die kleinen, bis dahin gewachsenen Kolonien bedeutet einen vermutlich positiven Test, der eine weitere Testung erfordert, wogegen das Fehlen von Fluoreszenz bedeutet, dass keine Listeria monocytogenes in der getesteten Probe vorhanden ist.
  • Nach einer Inkubation während einer weiteren Zeitperiode wird bei Anwesenheit von beispielsweise Listeria monocytogenes das Plattierungsmedium, welches eine potenziell chromogene Verbindung der Formel (IV) enthält, gefärbte Kolonien zeigen, wobei sich die Farbe durch die chromogene Verbindung beim Kontakt mit PI-PLC entwickelt haben wird. Beispielsweise wird eine Kolonie von Listeria monocytogenes mit einem 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphat enthaltenden Substrat eine Farbe von türkisblau bis blau erzeugen. Die Kolonie kann erforderlichenfalls für weitere Testungen isoliert werden.
  • Im Allgemeinen wird der chromogene Bestandteil am besten auf einer festen Oberfläche funktionieren, da die Farbe des Chromogens innerhalb der Zelle enthalten bleiben wird, was dazu führt, dass die Farbe der Kolonie gleich der Farbe des wasserunlöslichen und in der Kolonie verbleibenden Chromogens sein wird.
  • Plattierungsmedien gemäss der vorliegenden Erfindung neigen dazu, eine gute Stabilität zu haben. Beispielsweise werden Farbe und Selektivität des Plattierungsmedium nach vierwöchiger Lagerung bei 4°C im Dunkeln im Wesentlichen gleich sein wie diejenigen des frisch hergestellten Mediums. Die Listeria-monocytogenes-Kolonien erscheinen türkisblau bis blau und konvex mit einem Durchmesser von 1.0–2.5 mm ohne Hof oder mit einem türkisblauen bis blauen Hof.
  • Es ist überraschend, dass fluorogene Verbindungen der Formel (I), z.B. in einem 4-Methylumbelliferylmyo-inositol-1-phosphat enthaltendem Plattierungsmedium nicht nur in einem Brühemedium, sondern auch auf einem festen Medium wie Agar wirksam sind.
  • Trotz der Tatsache, dass die Fluoreszenz aus der Kolonie in das Agarmedium ausgewaschen werden kann, dient die Fluoreszenz als Screeningtest für die Anwesenheit oder Abwesenheit von pathogenen, PI-PLC-Enzymen freisetzenden Bakterien.
  • Demzufolge wird eine positive Reaktion (Freisetzung des PI-PLC-Enzyms durch eine bakterielle Spezies) in der Anwesenheit des fluorogenen Substrates die Kolonie veranlassen, Fluoreszenz zu zeigen, welche darauf hinweist, dass eine PI-PLC-freisetzende bakterielle Spezies mit einer signifikanten Zelldichte anwesend ist.
  • Dies bedeutet eine vermutlich positive Reaktion für die interessierende bakterielle Spezies (wie Listeria monocytogenes), was eine weitere Isolierung der bakteriellen Spezies in der Form einer Kolonie unter Verwendung des chromogenen Substrates (IV) des PI-PLC-Enzyms, wie oben beschrieben, rechtfertigt.
  • Der fluorogene Bestandteil der Formel (I) und seine Fluoreszenz beeinträchtigt die enzymatische Farbreaktion des chromogenen Bestandteils der Formel (IV) in der Kombination oder im Plattierungsmedium gemäss der vorliegenden Erfindung nicht.
  • Im Allgemeinen erlaubt die Anwesenheit eines fluorogenen Bestandteils der Formel (I) und eines chromogenen Substrates der Formel (IV) in einem einzelnen Medium eine schnelle, vermutlich positive Reaktion (aufgrund des fluorogenen Bestandteils) innerhalb einer Periode von typischerweise 24 Stunden, gefolgt von einer Inkubation während einer weiteren Zeitperiode, z.B. 24 Stunden, und der Identifizierung der Kolonie auf dem festen Medium unter Verwendung des chromogenen Effektes als bestätigende Reaktion.
  • Ein weiterer Vorteil von bevorzugten Plattierungsmedien gemäss der vorliegenden Erfindung liegt in der Erzeugung einer weissen Niederschlagszone um die z.B. türkis gefärbten Kolonien von L. monocytogenes/L. ivanovii. Gegebenenfalls kann die Kolonie für eine weitere Testung isoliert werden.
  • Wie aus den nachfolgenden Beispielen ersichtlich wird, stellt die Erfindung neue und verbesserte Plattierungsmedien für das Screening sowie für die Isolierung, Charakterisierung und quantitative Evaluation (mikrobielle Auszählung) von verschiedenen hygienisch und pathologisch wichtigen Mikroorganismen bereit, die zur metabolischen Produktion einer Phosphatidyl-inositol-spezifischen Phospholipase C (PI-PLC) fähig sind, wofür nachfolgend Beispiele angegeben sind.
  • Typischerweise können die Bestandteile der Formel (I) und (IV) und namentlich die bevorzugten Verbindungen wie 4-Methylumbelliferyl-myo-inositol-1-phosphat bei einer Konzentration von ungefähr 0.05–0.3 Gramm pro Liter (g/l) verwendet werden, während eine typische Konzentration von 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphat im Bereich von ungefähr 0.1–0.4 g/l sein wird. (Der hier verwendete Begriff "ungefähr" bedeutet eine mögliche Abweichung von bis zu 50% des angegebenen Wertes).
  • Obwohl höhere Mengen verwendet werden könnten, ergeben sich dadurch normalerweise keine Vorteile, welche die höheren Kosten kompensieren würden. Es muss betont werden, dass die hier und in den nachfolgenden Beispielen angegebenen Konzentrationsangaben sich jeweils auf das gesamte gebrauchsfertige Medium beziehen. Zur Produktion von trockenen Plattierungsmedien (z.B. zur Erhöhung der Haltbarkeit oder für andere Anwendungsformen) müssen die geeigneten Mengen entsprechend berechnet werden.
  • Die Substituenten R1 bis R10 in den Formeln (I) und (IV) sind in dem Sinne fluorogen beziehungsweise chromogen, dass solche Substituenten die spezifische Absorption von Licht der Verbindungen der Formel (I) und/oder (IV), welche nach der Exposition mit PI-PLC Fluoreszenz und/oder Farbe bilden, erhöhen oder zumindest nicht signifikant verringern werden.
  • Im Allgemeinen sind die Zusammensetzungen von Plattierungsmedien per se im Stand der Technik wohlbekannt (vgl., beispielsweise, "Biotechnological Bioengineering" vol. 24, 1982, 1519) und sind als flüssige, halbflüssige oder feste Kulturmedien verfügbar, die im Allgemeinen enthalten:
    • – einen gelbildenden Bestandteil wie Agar oder Gelatine;
    • – Nährstoffe, einschliesslich einer Kohlenstoffquelle für die interessierenden Mikroorganismen,
    • – verschiedene Zusätze und (abhängig von der gewünschten Form),
    • – ein optionales wässriges Medium wie es für die gelbildende Fähigkeit des gelbildenden Bestandteils erforderlich ist.
  • Wie es den Fachpersonen wohlbekannt ist, wird ein Träger oder Substrat wie typischerweise eine Petrischale als Unterlage für das flüssige oder halbflüssige Plattierungsmedium verwendet.
  • Plattierungsmedien gemäss der vorliegenden Erfindung umfassen solche flüssige oder halbflüssige Formen wie auch trockene Plattierungsmedien. "Trocken" bedeutet vorzugsweise im Wesentlichen wasserfrei und enthält zwecks Lagerung typischerweise weniger als 5 Gew.-% und bevorzugt weniger als 3 Gew.-% Wasser. Mit anderen Worten: ein typisches trockenes oder wasserfreies Plattierungsmedium gemäss der vorliegenden Erfindung kann so gebildet sein, dass es bei Zugabe von genügend wässrigem Medium ein flüssiges oder halbflüssiges Plattierungsmedium ergeben wird.
  • Die Herstellung von Plattierungsmedien erfolgt nach den wohlbekannten Regeln, z.B. wie von den Herstellern der herkömmlichen Komponenten beschrieben.
  • Es ist zu bemerken, dass die Bezeichnung "gebrauchsfertig" im Allgemeinen Plattierungsmedien verschiedener Konsistenzen umfasst, die von einem maximalen bis zu einem minimalen Wassergehalt des für die Kultivierung verwendeten Plattierungsmediums reichen und "wässrige" oder "flüssige" sowie "halbtrockene" oder "halbflüssige" Plattierungsmedien einschliessen. Wie es aus dem Stand der Technik der mikrobiellen Kultivierung wohlbekannt ist, wird ein typisches Plattierungsmedium als vergiessbare oder "flüssige" Zusammensetzung (gelegentlich als ein "Sol" bezeichnet) gebildet, welche nach dem Auftragen auf einen Träger wie beispielsweise eine Petrischale oder andere Arten von Trägerplatten ein relativ festes Gel bilden wird. Demnach können die Plattierungsmedien gemäss der vorliegenden Erfindung, ohne dies zu müssen, in ihrer gebrauchsfertigen flüssigen oder halbflüssigen Form solch einen Träger oder eine Platte umfassen.
  • Ein typisches wasserfreies Plattierungsmedium gemäss der vorliegenden Erfindung wird alle für die beabsichtige Verwendung erforderlichen Grundingredienzien, d.h. den gelbildenden Bestandteil, die Verbindung der Formel (I) und/oder Formel (IV) und – im Allgemeinen – essenzielle Nährstoffe für Mikroben umfassen, und ein bevorzugtes wasserfreies Plattierungsmedium gemäss der vorliegenden Erfindung, z.B. in der Form einer gefriergetrockneten Zusammensetzung oder eines Lyophilisates, wird alle essenziellen Bestandteile des gebrauchsfertigen Plattierungsmediums ausser dem wässrigen Bestandteil umfassen.
  • Es sollte jedoch bemerkt werden, dass das wesentliche Merkmal eines Plattierungsmediums gemäss der vorliegenden Erfindung darin liegt, dass es mindestens eine Verbindung der Formel (I) und Formel (IV) zum Nachweis von mikrobiellem PI-PLC durch Fluoreszenz- und Farbbildung enthält. Dementsprechend können Nährstoffe, spezifische Zusätze zur Selektivität (Inhibitoren) oder Aktivatoren zur Wachstumsförderung, verbesserten enzymatischen Spaltung oder Zusätze zur Verwendung in Kontaktplattenverfahren in einem trockenen, halbflüssigen (gleichbedeutend mit halbfestem) oder flüssigen Plattierungsmedium gemäss der vorliegenden Erfindung vorzugsweise aber nicht obligatorisch enthalten sein, da es der jeweilige Anwender im Hinblick auf spezifische Erfordernisse möglicherweise anpassen möchte.
  • Zu den verschiedenen bevorzugten Anwendungen von Plattierungsmedien gemäss der vorliegenden Erfindung gehört deren Verwendung für das soeben erwähnte, sogenannte Kontaktplattenverfahren, d.h. bei dem die interessierende Probe, z.B. ein Nahrungsmittelprodukt wie Käse oder ein in der Nahrungsmittelherstellung verwendetes Werkzeug oder Apparatebestandteil (Hygieneüberwachung) direkt auf das Medium auf der Platte zur Inokulation und Hygienekontrolle aufgebracht wird. Für dieses Verfahren enthält das Plattierungsmedium vorzugsweise eine Komponente, die fähig ist, oberflächenaktiven Substanzen, wie sie in typischen Proben enthalten sein können, entgegenzuwirken. Phospholipide wie Lecithin und L-Histidin sind hierfür, aber auch für andere Zwecke, geeignete Zusätze wie nachfolgend noch ausführlicher erklärt wird. Typische kommerzielle Kontaktplatten haben eine rechteckige Form (20 auf 80 mm) und werden soweit gefüllt, bis sie eine leicht konvexe, nach aussen stehende Aufwölbung für gute Kontakteigenschaften gebildet haben.
  • Halbflüssige Medien können inokuliert und dann auf eine nicht-spezifische Nährstoffschicht aufgebracht werden, oder aufgrund ihrer Mobilität und/oder unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes zur Migration der interessierenden Mikroorganismen verwendet werden. Fluoreszenz- und/oder Farbbildung werden im halbfesten Teil des Plattierungsmediums beobachtet werden.
  • Gelierungsmittel (auch als gelbildende Agenzien bezeichnet) zur Verwendung mit Plattierungsmedien sind im Stand der Technik wohlbekannt und kommerziell erhältlich. Geeignete Agenzien wie verschiedene Typen von Agar oder Gelatine zur Verwendung in mikrobiellen Kulturen einschliesslich der Plattierungsmedien gemäss der vorliegenden Erfindung sind zur Bildung eines wässrigen Gels fähig.
  • Bevorzugte Nährstoffe für alle Typen von Plattierungsmedien gemäss der vorliegenden Erfindung umfassen Gemische von peptidischen, pankreatinischen, tryptischen und papainischen Peptonen aus Kasein, Soja, Fleisch und Gemischen von Aminosäuren, z.B. Kasaminosäuren, namentlich mit dem Ziel, die Anlaufphase des mikrobiellen Wachstums zu verkürzen. Pepton-Gemische können durch hochqualitativen Nährstoffagar wie Columbia-Agar ersetzt werden.
  • Bevorzugte Gemische von Aminosäuren sind solche, die L-Cystein und L-Tryptophan enthalten, und werden typischerweise in Mengen von ungefähr 10 bis 200 Milligramm pro Liter (mg/l), berechnet für das fertige oder gebrauchsfertige Plattierungsmedium, verwendet.
  • Zusätze, die für Plattierungsmedien gemäss der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind essenzielle Wachstumsagenzien für die interessierenden Mikroben und umfassen Vitamine, z.B. in der Form von Hefeextrakt oder Fleischextrakt (die Bezeichnung "Fleisch" umfasst unter anderem Organe wie Leber, Blutbestandteile) und Brain-Heart-Infusion, typischerweise in einer Menge von ungefähr 1 bis 12 g/l.
  • Kohlenstoffquellen, die für die Plattierungsmedien gemäss der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen unter anderem Kohlenhydrate oder deren metabolische Vorläufer, z.B. D-Glukose, Natriumpyruvat und L-Rhamnose, typischerweise in einer Konzentration von ungefähr 0.5 bis 5 g/l. Natriumpyruvat reduziert auch die Menge der Sauerstoffradikale, welche auf wachsende Zellen inhibierend wirken.
  • Zur Verbesserung des Wachstums und der PI-PLC-Spaltung können Spurenelemente zugegeben werden, beispielsweise Magnesiumsalze, z.B. MgSO4, und die standardisierten Spurenelementlösung "Schlösser" (vgl. W. Dunger, H. J. Fiedler; Methoden der Bodenkunde, 2. Ausgabe, 1997, pp 92, Gustav Fischer, Jena-Stuttgart/Deutschland) in typischen Konzentrationen von ungefähr 0.2 bis 1.0 g/l. Es wurde gefunden, dass solch eine Spurenelementlösung die PI-PLC-Produktion und demnach die Spaltung von Verbindungen der Formel (I) und/oder (IV) verstärken wird, so dass im Ergebnis Fluoreszenz und/oder Färbung in einem beträchtlichen und unerwartetem Ausmass erzeugt wird.
  • Ein weiterer bevorzugter Zusatz ist eine Quelle von Eisen(II)- oder Eisen(II)-Ionen, z.B. Eisenzitrate wie Eisen(III)ammoniumzitrat (z.B. in einer Konzentration von ungefähr 0.1 bis 1.0 g/l) oder Ferrioxamine wie Ferrioxamin B, z.B. in einer Konzentration von ungefähr 50 bis 2000 Mikrogramm pro Liter (μg/l) vorzugsweise 100 bis 500 μg/l.
  • Zur Förderung der spaltenden Wirkung von PI-PLC kann ein Serum, z.B. Pferde- oder Rinderserum zugegeben werden, typischerweise in einer Konzentration von ungefähr 20 bis 100 ml/l, oder Albumin aus Rinderserum, typischerweise in einer Konzentration von ungefähr 2 bis 5 g/l. Die Verwendung von solchem Albumin ist bei der Bildung eines trockenen Plattierungsmediums besonders vorteilhaft.
  • Ein weiterer Aktivator oder Promoter für PI-PLC sind Phospholipide, z.B. Lecithin aus Sojabohnen, anderen Samen oder Eidottern, typischerweise in einer Konzentration von ungefähr 1 bis 5 g/l, und Salze von Glycerophosphorsäure, z.B. Magnesiumglycerophosphat oder Natriumglycerophosphat, in einer Konzentration von ungefähr 0.5 bis 2.0 g/l. Die Verwendung von solchen Bestandteilen ist namentlich bei Plattierungsmedien zur Verwendung im oben kurz erwähnten Kontaktplattenverfahren wichtig. L-Histidin, z.B. in einer typischen Konzentration von ungefähr 0.5 bis 2 g/l, ist ein weiterer Zusatz zur Verwendung in Plattierungsmedien für den direkten Kontakt.
  • Ein inertes Trübungsmittel wie Titandioxid, typischerweise in einer Menge von ungefähr 1 bis 5 g/l, kann zugegeben werden, um das Erkennen der gefärbten Kolonien zu verbessern.
  • Natürliche Stärke, z.B. in einer Konzentration von ungefähr 1 bis 5 g/l, kann zugegeben werden, um die Grösse der Kolonien zu reduzieren und die Effizienz der in den Plattierungsmedien gemäss der vorliegenden Erfindung verwendeten fluorogenen und/oder chromogenen Indikatoren zu verbessern.
  • Es ist vorteilhaft, das Plattierungsmedium für spezifische interessierende Mikroorganismen selektiv zu machen. Um beispielsweise eine Selektivität für Listeria monocytogenes bereitzustellen, ist das Wachstum von anderen PI-PLC-produzierenden Mikroorganismen wie anderen gramnegativen oder grampositiven Bakterien, z.B. Bacillus cereus, wie auch von Hefen und Schimmelpilzen nachteilig und sollte verhindert werden, um eine Verwirrung beim Ablesen der Platten zu vermeiden.
  • Wenn andererseits das Plattierungsmedium für andere Mikroorganismen als Listeria selektiv gemacht werden soll, müssen geeignete Inhibitoren entsprechend ausgewählt werden. Dementsprechend sind die nachfolgend erwähnten Inhibitoren als Anschauungsbeispiel für Plattierungsmedien angegeben, die selektiv für Listeria sind. Eine Fachperson kann ohne Weiteres auf der Basis des allgemeinen mikrobiologischen Fachwissens und/oder anhand einiger weniger und einfacher Wachstumsexperimente geeignete Inhibitoren auswählen.
  • Geeignete Inhibitoren für Listeria-spezifische Plattierungsmedien umfassen Kombinationen von synergistisch wirkenden Antibiotika, z.B. eine Kombination von Antibiotika wie Polymyxin B, z.B. in einer Konzentration von ungefähr 10 bis 20 Milligramm pro Liter (mg/l), gegebenenfalls kombiniert mit Sulfamethoxazol (z.B. ungefähr 50 bis 1000 mg/l) wie auch Phosphomycin (z.B. ungefähr 20 bis 50 mg/l) oder Ceftazidim (z.B. ungefähr 20 bis 50 mg/l), Doxycyclin (z.B. ungefähr 2 bis 20 mg/l) zur Inhibition von gramnegativen Bakterien.
  • Ausserdem dient die Zugabe von Lithiumchlorid (z.B. ungefähr 2 bis 20 g/l), vorzugsweise in Kombination mit Nalidixinsäure (z.B. ungefähr 20 bis 50 mg/l) oder Clindamycin (z.B. 1 bis 10 mg/l) zur Suppression von unerwünschten grampositiven Bakterien.
  • Eine Inhibition von Hefen und Schimmelpilzen kann durch Zugabe von Cycloheximid (z.B. ungefähr 50 bis 300 mg/l) oder Amphotericin B (z.B. ungefähr 1 bis 5 mg/l) in geeigneter Weise erreicht werden.
  • Im Allgemeinen gelten solche Mechanismen für Medien zum Nachweis und zur Bestimmung der Anzahl von anderen PI-PLC-produzierenden Mikroorganismen, namentlich von Bacillus cereus und Bacillus thuringiensis, und eine Selektivität kann auf analoge Art und Weise wie oben für Listeria erwähnt erreicht werden.
  • Eine Inhibition für Bacillus-cereus-Gruppen-spezifische Plattierungsmedien wird gemäss einer bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung einer synergistisch wirkenden Kombination von Antibiotika, z.B. eine Kombination von Polymyxin B (10 bis 20 mg/l), Sulfamethoxazol (10 bis 200 mg/l) und Trimethoprim (1 bis 20 mg/l), erreicht.
  • Das in der vorliegenden Erfindung geoffenbarte, für die Bacillus-cereus-Gruppe spezifische Plattierungsmedium kann auch zur Charakterisierung und Differenzierung von aus tierischem Futter stammenden, sogenannt "probiotischen" Bacillus-cereus-Isolaten verwendet werden. Die nicht-toxischen "abgeschwächten" Bacillus-cereus-Stämme Paciflor® und Toyocerin® werden als Futterzusätze verwendet, die als Fertilisatoren wirken.
  • Die Differenzierung dieser probiotischen, sporenbildenden Produkte von toxischen Bacillus cereus Wild-Stämmen kann nicht mittels einfacher, z.B. biochemischer Tests, gemacht werden, da sich diese Stämme bezüglich Hämolysinbildung, Stärkehydrolyse, Katalase wie auch Gelatinase- und Lecithinase-Reaktion gleich verhalten und keinerlei signifikanten Unterschied bezüglich der Fermentation von Kohlenhydraten zeigen.
  • Allerdings zeigen die oben erwähnten nicht-toxischen probiotischen Bacillus-cereus-Stämme unerwarteterweise eine verzögerte Produktion von PI-PLC, die auf dem neuen Bacillus-cereus-Gruppen-Plattierungsmedium gemäss der vorliegenden Erfindung durch eine erheblich schwächere Färbung (z.B. hell-türkise Kolonien) nachweisbar ist.
  • Um gegenüber schwach PI-PLC-produzierenden Bacillus cereus Stämmen vom Wildtyp eine eindeutige Differenzierung zu erhalten, können Antibiotika-Scheiben auf die Oberfläche des Mediums aufgetragen werden. Während sich wilde Stämme von B. cereus gegenüber Penicillin G (10 μg/Scheibe) und Cefamandol (30 μg/Scheibe) resistent verhielten, waren alle getesteten probiotischen B. cereus-Stämme suszeptibel.
  • Nicht einschränkende Beispiele von Mikroorganismen, die dem Nachweis und der Auszählung mittels Plattierungsmedien gemäss der vorliegenden Erfindung zugänglich sind, umfassen Mitglieder der Bacillus-cereus-Gruppe, namentlich Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus weihen-stephanensis und Bacillus anthracis wie auch Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Staphylococcus aureus, Legionella pneumophila, Clostridium species, Helicobacter pylori. Zu den weiteren interessierenden mikrobiellen Organismen gehören Hefen, z.B. Candida species und Schimmelpilze, z.B. Aspergillus species.
  • Ein bevorzugtes Testverfahren zur Identifikation von Listeria monocytogenes umfasst die Verwendung einer wie oben beschriebenen Anreicherungsbrühe, welche versehrte Listeriamonocytogenes-Zellen wiederherstellen oder wiederbeleben kann, z.B. eine Kombination einer sogenannten Fraser-½-Brühe für die Voranreicherung, gefolgt von selektiver Anreicherung mit normaler Fraser-Brühe wie in EN ISO 11290-1 und EN ISO 11290-2 beschrieben.
  • Danach wird das Plattierungsmedium mindestens mit einer kleinen Portion der Anreicherungsbrühe inokuliert, z.B. mittels einer Drahtschlinge zum Transport einer kleinen Menge Flüssigkeit. Da das Plattierungsmedium eine fluorogene und/oder chromogene Verbindung enthält, d.h. beim Kontakt mit dem durch den interessierenden Mikroorganismus produzierten PI-PLC eine Fluoreszenz oder Färbung zeigt, was auf die Anwesenheit von interessierenden Mikroorganismen hinweist, und wegen der durch die Zusammensetzung des Plattierungsmediums gebotenen selektiven Wachstumsbedingungen führt die Inkubation des Plattierungsmediums zum Wachstum der interessierenden Mikroorganismen und zur Bildung von entsprechenden mikrobiellen Kolonien, die Fluoreszenz und/oder Färbung aufweisen. Falls gewünscht, können mikrobielle Zellen aus den fluoreszierenden und/oder gefärbten Kolonien zwecks Verifizierung isoliert werden.
  • Das Plattierungsmedium kann mit den Proben, z.B. mit verschiedenen Nahrungsmittelproben zwecks direkter Auszählung der Pathogene auch direkt inokuliert werden.
  • Das oben erwähnte Kontaktplattenverfahren und das direkte Plattierungsmedium gemäss der vorliegenden Erfindung, das wie oben beschrieben selektiv gemacht wurde, ist von besonderem Interesse für Kontroll- und Überwachungszwecke in der Nahrungsmittel verarbeitenden Industrie. Die nachfolgenden, nicht einschränkenden Beispiele dienen der weiteren Veranschaulichung der Erfindung.
  • Im Allgemeinen stellt die Erfindung eine sichere, empfindliche und kommerziell gangbare Detektion, Identifikation und Auszählung von potenziell pathogener bakterieller Aktivität von Mikroben wie Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Bacillus cereus, einschliesslich der probiotischen B. cereus-Stämme (Paciflor®, Toyocerin®), Bacillus thuringiensis und Bacillus anthracis in potenziell infizierten Materialien, die physiologische Proben oder verzehrbare Güter wie Nahrungsmittel, Getränke und Tierfutter einschliessen, bereit.
  • Die Erfindung wird nun anhand von nicht einschränkenden Beispielen ausführlicher erklärt.
  • BEISPIELE
  • Beispiele 1–3: Verbesserte selektive Plattierungsmedien für Listeria monocytogenes
  • Beispiel 1:
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung, Inokulation und Wirksamkeit eines verbesserten gebrauchsfertigen und selektiven Plattierungsmediums für Listeria monocytogenes mit einer fluoreszierenden Verbindung der Formel (I) gemäss der vorliegenden Erfindung.
  • Plattierungsagar wurde aus den nachfolgenden Grundingredienzien hergestellt:
    Agar 15.0 g/l
    Spezielles Pepton 18.0 g/l
    Hefeextrakt 8.0 g/l
    Kasaminosäuren 5.0 g/l
    Fleischextrakt 5.0 g/l
    Natriumglycerophosphat 1.0 g/l
    Natriumpyruvat 1.0 g/l
    Magnesiumsulfat-Heptahydrat 1.5 g/l
    Lithiumchlorid 5.0 g/l
    Eisen(III)ammoniumzitrat 0.2 g/l
    Kaliumphosphat, dibasisches (KH2PO4) 1.5 g/l
    Natriumphosphat, dibasisches (NaH2PO4·2 H2O) 3.1 g/l
    Cycloheximid 0.2 g/l
  • Alle Ingredienzien wurden in 960 ml Wasser (destilliert oder entionisiert) gelöst und bei 121°C während 15 Minuten autoklaviert. Der pH wurde im Bereich von 7.1 bis 7.2 gehalten.
  • Die nachfolgenden Zusätze wurden in den angegebenen Mengen zugegeben:
    D-Glukose 2.0 g/l
    Rinderserumalbumin 3.5 g/l
    Sojalecithin 1.5 g/l
    Standardisierte Spurenelementlösung Schlösser 5 ml/l
    4-Methylumbelliferylmyo-inositol-1-phosphat,
    N-Methylmorpholin-Salz 0.1 g/l
  • Die nachfolgenden Antibiotika wurden wie oben erklärt als Inhibitoren für unerwünschte Mikroorganismen im Hinblick auf die Selektivität von Listeria zugegeben:
    Polymyxin B 0.01 g/l
    Nalidixinsäure 0.03 g/l
    Ceftazidim 0,03 g/l
  • Rinderalbumin wurde separat in 10 ml Wasser (destilliert oder entionisiert) gelöst. Lecithin wurde in 10 ml 20 Vol.-% Ethanol suspendiert. Beide Lösungen wie auch die Glukose, die Spurenelement-Lösung und das Substrat wurden nach dem Abkühlen auf 50 bis 55°C aseptisch unter Rühren zum oben erwähnten Plattierungsagar zugegeben. Abschliessend wurden die Antibiotika aseptisch zugegeben.
  • Nach 10-minütigem Rühren wurde der pH kontrolliert, und das Medium wurde in Petrischalen gegossen und verfestigen gelassen.
  • Die standardisierte Spurenelement-Lösung "Schlösser" ist zusammengesetzt aus:
    Zinksulfat-Heptahydrat 1 mg/l
    Mangansulfat-Tetrahydrat 2 mg/l
    Borsäure 10 mg/l
    Cobalt-(II)-nitrat-Hexahydrat 1 mg/l
    Natriummolybdat-Dihydrat 1 mg/l
    Kupfer-(II)-sulfat-Pentahydrat 0.005 mg/l
    Eisensulfat-Heptahydrat 0.7 g/l
    EDTA 0.8 g/l
    Bidestilliertes Wasser auf 1 Liter Gesamtvolumen.
  • Diese standardisierte Schlösser-Lösung wird in zehnfacher Konzentration als Stammlösung hergestellt und bei 121°C während 15 Minuten autoklaviert. 5 ml dieser konzentrierten Lösung wurden zu 1 Liter des oben erwähnten Plattierungsmediums zugegeben.
  • Das Plattierungsmedium wurde durch Verwendung einer mit Flüssigkeit aus einer Voranreicherungsbrühe gefüllten Schlinge und durch Aufstreichen auf das Plattierungsmedium inokuliert und bei 36 ± 1°C während 24 Stunden inkubiert.
  • Nach einer ersten Ablesung wurden die Platten während weiteren 20 bis 24 Std. bei 36 + 1°C inkubiert.
  • Die Resultate sind in Tabelle 1 zusammengefasst, welche die Kolonienmerkmale einer Vielzahl von Bakterien auf dem selektiven/differenziellen Plattierungsmedien nach der Inkubation zeigt.
  • Beispiel 2:
  • Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass 0.2 g/l 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphat-Ammoniumsalz zugegeben wurden, um eine Kombination eines fluorogenen (Formel I) und eines chromogenen (Formel IV) Indikators gemäss der vorliegenden Erfindung bereitzustellen.
  • Wiederum sind die Resultate in Tabelle 1 zusammengefasst.
  • Beispiel 3:
  • Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass die 0.1 g/l 4-Methylumbelliferyl-myo-inositol-1-phosphat-N-methyl-morpholinsalz (Verbindung der Formel I) durch 0.2 g/l 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphat-Ammoniumsalz (Verbindung der Formel IV) ersetzt wurden.
  • Die türkisblaue bis blaue Farbe der Listeriamonocytogenes-Kolonien zeigte die Anwesenheit des PI-PLC-Enzyms durch Bildung des tief gefärbten wasserunlöslichen 5,5'-Dibromo-4,4'-dichloro-indigo-Farbstoffes, welcher innerhalb der Kolonie zurückbehalten wurde und nicht in das Medium diffundierte.
  • Wiederum sind die Resultate in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1 Kolonienmorphologien von verschiedenen Bakterien auf selektivem Plattierungsmedium für Listeria monocytogenes, erhalten gemäss den Beispielen 1 bis 3
    Figure 00300001
    Figure 00310001
  • Beispiele 4–6: Verbesserte selektive Plattierungsmedien für Bacillus-Spezies
  • Selektiv fluoreszierende und/oder chromogene Plattierungsmedien für verschiedene Bacillus-Spezies wurden im Wesentlichen wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt, ausser wie in Tabelle 2 unten spezifiziert. Das Plattierungsmedium von Beispiel 4 (Vergleich) enthielt den fluorogenen. Indikator (A). Das Plattierungsmedium von Beispiel 5 enthielt sowohl fluorogenen als auch chromogenen Indikator (A + B), während das Plattierungsmedium von Beispiel 6 (Vergleich) nur den chromogenen Indikator (B) enthielt. Die Zusammensetzung der Nährstoffe ist so gewählt, dass nicht allzu grosse Kolonien erhalten werden, da die Menge des fluorogenen/chromogenen Substrates reduziert werden könnte. Tabelle 2
    Figure 00320001
  • Das Grundmedium wurde bei 121°C während 15 Minuten autoklaviert, und der pH wurde auf 7.1 bis 7.3 eingestellt.
  • Die Zusätze wurden aseptisch in sterilem destilliertem oder entionisiertem Wasser gelöst und nach dem Abkühlen auf ungefähr 50°C aseptisch zum Plattierungsmedium zugegeben.
  • Das fertige Medium wurde in Petrischalen gegossen und verfestigen gelassen.
  • Das Plattierungsmedium wurde entweder durch Verwendung einer mit Flüssigkeit einer Voranreicherungsbrühe gefüllten Schlinge und Aufstreichen auf den Agar oder direkt mittels der Probe inokuliert. Es wurde bei 36 + 1°C während 24 Stunden inkubiert. Tabelle 3 fasst die Kolonienmerkmale einer Vielzahl von Bakterien auf dem verbesserten selektiven/differenziellen Plattierungsmedium für Bacillus-Spezies nach Inkubation zusammen.
  • Eine weitere vorteilhafte Anwendungsform dieses Mediums ist der Nachweis von probiotischen Bacillus-cereus-Stämmen (Paciflor®, Toyocer®) durch Anwendung von Antibiotikascheiben auf die Oberfläche des in Tabelle 2 gezeigten Mediums. Das durchgeführte Verfahren ist ähnlich wie der Agar-Diffusionstest. Während sich B. cereus-Wild-Stämme gegenüber Penicillin G (10 μg/Scheibe) und Cefamandol (30 μg/Scheibe) resistent verhielten, waren alle getesteten probiotischen Bacillus cereus-Stämme gegenüber diesen Antibiotika suszeptibel. Tabelle 3 Morphologien von Kolonien verschiedener Bakterien auf dem für Bacillus spp. selektiven Plattierungsmedium, erhalten gemäss den Beispielen 4 bis 6
    Figure 00330001
    Figure 00340001
    Figure 00350001
  • Es sollte bemerkt werden, dass obleich die oben erwähnten Beispiele sich auf die bevorzugten Bestandteile 4-Methylumbelliferyl-myo-inositol-1-phosphat, N-Methylmorpholin-Salz beziehungsweise 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphat, Ammoniumsalz beziehen, es aus den allgemeinen obigen Beschreibungen offensichtlich ist, dass mit anderen Substraten der Formel (I) beziehungsweise (IV) sehr ähnliche Resultate erhalten werden. Dementsprechend werden verschiedene Abwandlungen der oben aufgeführten Beispiele offensichtlich sein.

Claims (31)

  1. Plattierungsmedium zum Nachweis eines Mikroorganismus eines Typs, der zur metabolischen Produktion einer phosphatidylinositol-spezifischen Phospholipase C (PI-PLC) fähig ist, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Plattierungsmedium in Kombination enthält: mindestens eine fluorogene Verbindung, die bei Kontakt mit besagtem PI-PLC zur Erzeugung von Fluoreszenz fähig ist, und mindestens eine chromogene Verbindung, die bei Kontakt mit besagtem PI-PLC zur Bildung einer Farbe fähig ist; wobei besagte fluorogene Verbindung durch die Formel (I) dargestellt ist,
    Figure 00370001
    wobei R1, R2, R3, R4 und R5 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und fluorogenen Substituenten, und X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Hydroxyl; ORY, wobei RY ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C1-C4-Alkyl; und O–Me+, wobei Me+ ein von einer organischen oder anorganischen Base abgeleitetes Kation ist, und wobei besagte chromogene Verbindung durch die Formel (IV) dargestellt ist,
    Figure 00380001
    wobei R10 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und C1-4-Alkyl und R6, R7, R8 und R9 ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und chromogenen Substituenten; und X wie oben definiert ist.
  2. Plattierungsmedium nach Anspruch 1, wobei besagtes Me+ in den Formeln (I) und (IV) ein von Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Diethylamin, Triethylamin, Tetramethylammoniumhydroxid, Tetraethylammoniumhydroxid, Cyclohexylamin, Pyridin, Piperidin, Pyrrolidin, Morpholin, N-Methyl-morpholin, N-Ethyl-morpholin und p-Toluidin abgeleitetes Kation ist.
  3. Plattierungsmedium nach Anspruch 1 oder 2, wobei ein jeder der besagten fluorogenen Substituenten in Formel (I) unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C1-C4-Alkyl, das gegebenenfalls in der Alkylkette ein Sauerstoffatom enthält; C1-C4-Alkoxy; Nitro; Carboxy, C1-C4-Carboxyalkyl und Cyano, wobei eine jede der besagten Alkylgruppen gegebenenfalls mindestens ein Halogenatom als Substituent aufweist.
  4. Plattierungsmedium nach Anspruch 3, wobei R3 in Formel (I) ein C1-C4-Alkyl ist, das gegebenenfalls ein oder mehrere Halogenatome enthält, X Hydroxyl ist, und R1, R2, R4 und R5 Wasserstoffatome sind; und wobei besagtes Salz von besagter Verbindung der Formel (I) ein mit einer organischen oder anorganischen Base gebildetes Salz ist.
  5. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei besagte Verbindung der Formel (I) ausgewählt ist aus 4-Methylumbelliferylmyo-inositol-1-phosphat und dessen Salzen mit einer organischen oder anorganischen Base.
  6. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei in besagter Formel (IV) R6, R7 und R8 ausgewählt sind aus Wasserstoff, Chlor und Brom; R9 und R10 Wasserstoff sind und/oder wobei besagte Verbindung der Formel (IV) in der Form eines Salzes mit einer organischen oder anorganischen Base vorliegt.
  7. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei besagte Verbindung der Formel (IV) ausgewählt ist aus 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphat, 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphat, 6-chloro-3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphat und einem Salz davon.
  8. Plattierungsmedium nach Anspruch 7, wobei besagtes Salz ein Ammoniumsalz der besagten Verbindung der Formel (IV) ist.
  9. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 8, zusätzlich enthaltend mindestens einen gelbildenden Bestandteil und mindestens einen zur Aufrechterhaltung des Wachstums von besagtem Mikroorganismus fähigen Nährstoff.
  10. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 9, zusätzlich enthaltend mindestens einen Inhibitor für andere Mikroorganismen als besagter interessierender Mikroorganismus.
  11. Plattierungsmedium nach Anspruch 9 oder 10, wobei besagter Nährstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Peptonen und Aminosäuren.
  12. Plattierungsmedium nach Anspruch 11, wobei besagte Aminosäuren als sauer hydrolysiertes Kasein in einer Menge von ungefähr 2 bis ungefähr 20 Gramm pro Liter von besagtem Medium mit Zugabe von L-Cystein und L-Tryptophan in einer Menge von ungefähr 10 bis ungefähr 200 Milligramm pro Liter verwendet werden.
  13. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei besagte Nährstoffe mittels Nährstoffanalyse ausgewählt sind und wobei besagter Nährstoff mindestens ein Mitglied der Gruppe bestehend aus Hefenextrakt, Fleischextrakt und Brain-Heart- Infusion in einer Menge von ungefähr 1 bis ungefähr 12 Gramm pro Liter von besagtem Medium umfasst.
  14. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 13, zusätzlich umfassend mindestens ein Kohlenhydrat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D-Glukose, Natriumpyruvat und L-Rhamnose in einer Menge von ungefähr 0.5 bis ungefähr 5 Gramm pro Liter von besagtem Medium.
  15. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 14, zusätzlich umfassend Spurenelemente, die zur Verbesserung des Wachstums von besagtem Mikroorganismus fähig sind.
  16. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 15, zusätzlich umfassend mindestens eine Eisen(III)-Verbindung ausgewählt aus der Gruppe von Eisen(III)-Zitrat, Eisen(III)-Ammoniumzitrat und Ferrioxaminen.
  17. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 16, zusätzlich umfassend einen Promoter zur Spaltung von PI-PLC ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Albuminen, Phospholipoiden und Glycerophosphorsäuren.
  18. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 17, zusätzlich umfassend einen Induktor für die Enzymproduktion, z.B. Lecithin, wobei die Spaltung von besagtem Induktor durch Verbesserung der Färbung der Kolonie und durch Bildung einer weissen Niederschlagszone, welche die fluoreszierenden und/oder angefärbten Kolonien umgibt, zu einer besseren Erkennung des Zielmikroorganismus beiträgt.
  19. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 18, zusätzlich umfassend ein kontrastverstärkendes Agens zur Verbesserung der visuellen Nachweisbarkeit von gefärbten Kolonien des besagten interessierenden Mikroorganismus.
  20. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 10 bis 19, wobei besagter Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen, die zur Inhibierung des Wachstums von gramnegativen Bakterien, grampositiven Bakterien, Hefen und Pilzen fähig sind.
  21. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 10 bis 20, wobei besagter Inhibitor ausgewählt ist aus Polymyxin, Sulfamethazol, Sulfamethoxazol, Phosphomycin, Doxycyclin, Ceftazidim, Clindamycin, Nalidixinsäure, Cycloheximid, Trimethoprim und Amphotericin.
  22. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Verwendung in einem Direktkontaktverfahren durch direkten Kontakt mit einer Probe mit Verdacht, den besagten interessierenden Mikroorganismus zu enthalten, umfassend mindestens einen Bestandteil zur Entgegenwirkung mit oberflächenaktiven Komponenten einer Probe.
  23. Plattierungsmedium nach Anspruch 22, wobei besagter Bestandteil zur Entgegenwirkung mit oberflächenaktiven Komponenten einer Probe Lecithin und L-Histidin umfasst.
  24. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 23, enthaltend ein wässriges Medium zum Bereitstellen eines gebrauchsfertigen Plattierungsmediums.
  25. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 23 in einer im Wesentlichen wasserfreien Form.
  26. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei ausgewählte Antibiotika-Scheiben auf die Oberfläche dieses Plattierungsmediums zur weiteren Differenzierung der wachsenden Bakterien aufgrund von deren unterschiedlichen Resistenzen gebracht werden.
  27. Plattierungsmedium nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei besagter nachzuweisender Mikroorganismus ausgewählt ist aus Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Bacillus cereus, probiotschen Stämmen von Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus anthracis, Staphylococcus aureus, Legionella pneumophila, Clostridium species, Helicobacter pylori, Candida species; und Aspergillus species.
  28. Verfahren zum Nachweis eines interessierenden Mikroorganismus, wobei besagter Mikroorganismus vom Typ ist, der zur metabolischen Produktion einer phosphatidylinositol-spezifischen Phospholipase C (PI-PLC) fähig ist; umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Plattierungsmediums enthaltend ein wässriges Gel und mindestens einen Nährstoff, der zur Aufrechterhaltung des Wachstums von besagtem Mikroorganismus fähig ist; und mindestens eine Verbindung der Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert, und mindestens eine Verbindung der Formel (IV) wie in Anspruch 1 definiert; (b) Inokulieren des besagten Plattierungsmediums mit einem Probenmaterial mit dem Verdacht, den besagten interessierenden Mikroorganismus zu enthalten; (c) Inkubieren des besagten Plattierungsmediums im Anschluss an besagten Schritt (b); (d) gegebenenfalls Anbringen von ausgewählten Antibiotika-Scheiben auf die Oberfläche des Plattierungsmediums zur weiteren Differenzierung von wachsenden Bakterien aufgrund ihrer unterschiedlichen Resistenz; und (e) Beobachten des besagten Plattierungsmediums im Anschluss an besagten Schritt (c) oder (d) bezüglich der Bildung von fluoreszierenden und/oder angefärbten Kolonien von besagtem interessierendem Mikroorganismus als Nachweis für die Anwesenheit von besagtem Mikroorganismus in der besagten Probe.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei besagte Verbindung der Formel (I) 4-Methylumbelliferyl-myo-inositol-1-phosphat oder ein Salz davon ist.
  30. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, wobei besagte Verbindung der Formel (IV) 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphat oder ein Salz davon ist.
  31. Kombination von mindestens einer Verbindung der Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert und mindestens einer Verbindung der Formel (IV) wie in Anspruch 1 definiert, zur Verwendung für den Nachweis von Mikroorganismen des Typs, der zur metabolischen Produktion einer phosphatidylinositol-spezifischen Phospholipase C (PI-PLC) fähig ist.
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